PLoS ONE: aminosteroid Afledte RM-133 Shows in vitro og in vivo antitumoraktivitet i Human æggestokkene og pancreascancer

Abstrakt

æggestokkene og pancreascancer er to af de mest aggressive og dødelige kræftformer, hvis forvaltning ansigter kun begrænset behandlingsmuligheder. Typisk spredt disse tumorer snigende ledsaget først med atypiske symptomer, og som regel skifte til et lægemiddel resistens fænotype med den nuværende farmaceutiske arsenal. Således udvikling af nye lægemidler, der virker via en anden virkningsmekanisme repræsenterer en klar prioritet. Heri er vi rapportering for første gang, at aminosteroid derivat RM-133, som er udviklet i vores laboratorium, viser lovende aktivitet på to modeller af aggressive kræftformer, nemlig æggestokkene (OVCAR-3) og pancreas (Panc-1) kræftformer. IC

50 værdien af ​​RM-133 var 0,8 uM og 0,3 uM for OVCAR-3 og PANC-1 cellelinier i kultur, hhv. Baseret på farmakokinetiske undersøgelser af RM-133 ved hjælp af 11 forskellige køretøjer, valgte vi to køretøjer: vandig 0,4% methylcellulose: ethanol (92: 8) og solsikkeolie: ethanol (92: 8) for

in vivo

undersøgelser . Brug af subkutan injektion af RM-133 med methylcellulose-baserede køretøj, vækst af PANC-1 tumorer xenotransplanteret til nøgne mus blev inhiberet med 63%. Helt interessant, RM-133 injiceret subkutant med methylcellulose-baserede eller solsikke-baserede køretøjer reducerede OVCAR-3 xenograft vækst ved 122% og 100%, hhv. Efter afslutningen af ​​RM-133 behandling under anvendelse af methylcellulose-baserede køretøj blev OVCAR-3 tumorvæksthæmning opretholdt i ≥ 1 uge. RM-133 blev også veltolereret i hele dyret, der tilsyneladende ingen tegn på toksicitet blevet påvist i xenografundersøgelser

Henvisning:. Kenmogne LC, Ayan D, Roy J, Maltais R, Poirier D (2015) aminosteroid Afledte RM-133 Shows

In vitro

In Vivo

antitumoraktivitet i human æggestokkene og pancreascancer. PLoS ONE 10 (12): e0144890. doi: 10,1371 /journal.pone.0144890

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: September 25, 2015; Accepteret: November 24, 2015; Udgivet: December 14, 2015

Copyright: © 2015 Kenmogne et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af canadiske Institutes of Health Research (CIHR, POP-i), Quebec Breast Cancer Foundation (QBCF), Société de valorisering de la recherche på Québec City (SOVAR), medicinske fakultet Université Laval, og Centre de Recherche en Endocrinologie Moléculaire et Oncologique et Génomique Humaine (CREMOGH). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfattere JR, RM, og DP af dette manuskript har følgende konkurrerende interesser: 2 – (N-substituerede piperazinyl) steroid derivater: patent 13 /130.621 (US); Patentansøgninger 2.744.369 (Canada) og 09.828.506,7 (Europa). Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Som et stort folkesundhedsproblem bekymring i hele verden, kræft er ansvarlig for hver fjerde dødsfald i USA og Canada [1,2]. Æggestokkene og pancreascancer er to aggressive kræftformer, der deler karakteristika spredes snigende mens der vises atypiske symptomer, og let at skifte til et lægemiddel resistens fænotype. Kræft i æggestokkene er en heterogen sygdom, der rammer årligt 225.000 kvinder verden over [3-5]. Det er den mest dødelige blandt de gynækologiske maligniteter, grundet dens asymptomatisk naturen i sin tidlige ætiologi, og manglen på effektive diagnostiske redskaber [2,5]. Som et resultat, 75% af kvinderne allerede præsentere sig selv med fremskredne stadier af kræft i æggestokkene (stadier III IV International Federation of Gynækologi og obstetrik klassifikation), når først diagnosticeret [3,6-9]. For disse kvinder, 5-års overlevelse varierer fra 25% til 35% [3,10] og guldstandarden behandling er kirurgisk debulking og kemoterapi baseret på en kombination af paclitaxel- og platin-baserede regimer [6,11-13 ]. Selvom første reaktion på kræft i æggestokkene behandling er gunstige, de fleste patienter bliver resistente over for tiden anvendte behandlinger og mere end 90% er genstand for tilbagefald efter 18 måneder [14,15]. På den anden side, pancreascancer, som er den fjerde mest dødbringende kræft, er en aggressiv neoplasma præsenterer sig med en meget dårlig prognose [1,2,16]. Dens 5-års overlevelse er på kun 6% [1] på grund af sen første diagnose, hurtig progression af sygdom, og modstand mod kemoterapi i brug [17]. Da pancreas tumorer er kendetegnet ved omfattende lokal invasion og tidlig lymfe samt hæmatogene metastaser [18], kun få patienter er kandidater til resektion, og derfor systemisk gemcitabin kemoterapi er den mest anvendte form for behandling [19]. Trods de seneste forbedringer i lægemiddeludvikling, har længden og livskvalitet af pancreas kræftpatienter ikke forbedret [20]. Således er der et presserende behov for at udvikle nye metoder til forvaltning af disse sygdomme, som er blandt mest aggressive og dødelige kræftformer og har begrænsede behandlingsmuligheder, især for patienter med inoperabel kræft i bugspytkirtlen, hvis almentilstanden hurtigt forværres [16,20, 21].

det fremgår af ovenstående, at udviklingen af ​​hidtil ukendte terapeutiske midler virker via forskellige virkningsmekanismer kritisk er nødvendig for at overvinde det store problem med lægemiddelresistens stødt med disse to cancertyper, og derfor, for at forbedre samlet overlevelse af patienter. Forbindelse RM-133 (figur 1) er en aminosteroid, der er blevet udviklet i vores laboratorium [22]. Den har vist antiproliferativ aktivitet på adskillige cancercellelinier (HL60 humane promyelocytiske leukæmiceller, T-47D humane brystcarcinomaceller, WEHI-3 mus myelomonocytleukæmi celler og LNCaP human prostatacancer celler) med IC

50 værdier i området fra 0,1 til 2 uM [23]. RM-133 viste også en lav til moderat risiko for lægemiddel-lægemiddel-interaktioner baseret på dens svage inhibering af leverenzymer CYP3A4 og CYP2D6 [23]. I en ovenstående

in vivo

assay, RM-133 blokeret med 57% vækst af HL60 tumor xenotransplanteret i nøgne mus [22]. I en indledende undersøgelse af virkningsmekanismen for denne familie af aminosteroider, en analog af RM-133 blokerede HL60 celler i G0 /G1 fasen og induceret apoptose [24].

Heri rapporterer vi det lovende anticancer aktivitet af RM-133 på human adenocarcinom OVCAR-3 celler, som er en model for resistens undersøgelse i ovariecancer [25], og på menneskers pancreas carcinom (PANC-1) celler. Vi rapporterer også farmakokinetiske undersøgelser på RM-133 involverer forskellige køretøjer, samt dets antitumoraktivitet i modeller for æggestokkene og pancreascancer, nemlig OVCAR-3 og Panc-1 tumorer xenotransplanteret i nøgne mus.

Materialer og metoder Salg

cellelinier og cellekultur

humanovarie (OVCAR-3) og pancreas (Panc-1) cancerceller blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) og opretholdt i eksponentiel vækst i en CO 5%

2 befugtet atmosfære ved 37 ° C. OVCAR-3 celler blev rutinemæssigt dyrket i RPMI-1640-medium (Sigma, St. Louis, MO) suppleret med 20% FBS, L-glutamin (2 mM), antibiotika (100 IU penicillin /ml og 100 ug streptomycin /ml), insulin (50 ng /ml) og estradiol (1 nM). For OVCAR-3 celleproliferationsassays, det anvendte medium var identiske, bortset fra udeladelsen af ​​estradiol. PANC-1-celler blev holdt i DMEM-high glucose (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) indeholdende L-glutamin (2 mM) og antibiotika (100 IU penicillin /ml og 100 ug streptomycin /ml), og suppleret med 10% FBS . For Panc-1 celleproliferationsassays blev sidstnævnte vedligeholdelse mediet udskiftet med DMEM /F12 indeholdende de samme kosttilskud.

Cell levedygtighed assays

celleproliferationsassay blev udført med en kolorimetrisk metode ved anvendelse af 3 – (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium (MTS) (Cell Titer 96 vandigt, Promega, Madison, WI). Mikrotiterplader med 96 brønde (Becton-Dickinson Company, Lincoln Park, NJ) blev podet med 1 × 10

4 celler /brønd suspenderet i 100 pi medium og præinkuberet i 24 timer ved 37 ° C i en 5% CO

2 atmosfære. En stamopløsning af RM-133 blev fremstillet i EtOH (1 × 10

-2 M) og blev fortyndet i eksperimentel medium, der blev tilsat til hver brønd ved tiden nul. Efter en 72-timers inkubation blev MTS (20 pi af opløsningen tilvejebragt af producenten) tilsat til hver brønd, og pladen inkuberes i 4 timer. MTS omdannes til vandopløselige farvede formazan ved dehydrogenaser stede i metabolisk aktive celler, og derfor tillader MTS-assayet umiddelbar bestemmelse af absorbansen af ​​den opløselige formazan direkte i cellemediet og dermed målingen af ​​levedygtige celler.

En

490 af mediet blev bestemt ved anvendelse af en 96-brønds mikropladelæser INFINITE 200 PRO serie (TECAN, Männedorf, Schweiz). IC

50 værdien af ​​RM-133 blev bestemt for hver af de to cellelinjer ved hjælp af GraphPad Prism 7 software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA).

Dyr

Alle

in vivo

eksperimenter blev godkendt af vores Institutional Animal Care og brug Udvalg (Comités de beskyttelse des animaux de l’Université Laval) og udføres i henhold til retningslinjerne fra det canadiske Rådet om Animal Care. For xenotransplantater, homozygot ♀

nu /nu

nøgne mus (24-42 dage gamle) blev indkøbt fra Charles River Inc. (Saint-Constant, QC, Canada) og husede (4:56) i vinyl mikro- isolerede ventilerede bure, der er udstyret med luft låg, som blev holdt i laminare luftstrøm hætter og vedligeholdes under patogen-begrænsende forhold. Under akklimatisering og undersøgelsesperioden blev dyrene huset under et kontrolleret miljø ved 22 ± 3 ° C, med 50 ± 20% relativ fugtighed og lys sat til 12 h /dag (lys på i 7:15). Gnaver mad (gnaver kost # T.2018.15, Harlan Teklad, Madison, WI) og vand blev leveret

ad libitum

. For

nu /nu

nøgne mus, mad og vand blev steriliseret før dispensering til dyrene. Standard Balb /c mus blev anvendt til farmakokinetiske undersøgelser. Dyrene blev bedøvet med isofluran og dræbt ved cervikal dislokation.

Effekt af RM-133 på OVCAR-3 xenotransplantater og medikamentkoncentration plasma i nøgne mus

Første del.

Tyve -To ♀

nu /nu

nøgne mus (22-24 g) blev inokuleret sc med 5 × 10

6 OVCAR-3-celler (i 0,1 ml vækstmedium indeholdende 30% Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA)) i begge flanker i hver mus via en 2,5-cm lang 22-gauge nål. Efter 11 dage blev tumor-bærende mus randomiseret til to grupper af 11 mus hver efter tumorstørrelse, dvs. en kontrolgruppe (

n

= 12 tumorer) og en behandlet gruppe (

n

= 15 tumorer). RM-133 blev indgivet s.c. dagligt ved 60 mg /kg i 0,1 ml propylenglycol: EtOH (92: 8). Dyrene i kontrolgruppen fik 0,1 ml vehikel alene. Tumorstørrelse blev målt to gange ugentligt ved anvendelse af en skydelære. To vinkelrette diametre (

L

W

) blev målt, og tumor-området (i mm

2) blev beregnet ved hjælp af formlen (

L

/2 ) x (

W-service /2) x Tr. Dyrene blev vejet på forskellige intervaller under forsøget.

anden del.

I slutningen af ​​xenotransplantat eksperiment, og for at opnå foreløbige farmakologiske data blev mus i behandlede grupper adskilt i 4 undergrupper af 2-3 mus hver, injiceret sc med RM-133 (60 mg /kg) og aflivet efter 3, 7, 12, eller 24 timer. Sideløbende blev mus i kontrolgruppen også adskilt i 4 undergrupper, behandlet med RM-133 (60 mg /kg) som for behandlede mus, og aflivet med de samme intervaller. Blod blev opsamlet fra mus ved hjertepunktur, og plasmakoncentrationen af ​​RM-133 bestemt ved væskekromatografi-tandem-massespektrometri (LC-MS /MS) som tidligere beskrevet [23]. Tumorer i musene i den behandlede gruppe blev opsamlet ved obduktion, samlet, homogeniseret ifølge en kendt procedure [26], og mængden af ​​RM-133 blev bestemt ved LC-MS /MS.

Plasmakoncentrationen af ​​RM -133 i mus på forskellige injektionssteder doser Salg

Otte ♀ Balb /c-mus, der vejede ca. 20 g, blev separeret i 4 grupper. Mus i hver gruppe modtog en enkelt s.c. injektion af RM-133 (30, 60, 120, eller 480 mg /kg). Det anvendte vehikel var propylenglycol: EtOH (92: 8) og injektionsvolumen var 0,1 ml for alle koncentrationer undtagen ved 480 mg /kg, hvor 0,2 ml blev anvendt. Blod blev opsamlet ved hjertepunktur efter 12 timer, og plasmakoncentrationen af ​​RM-133 bestemt ved LC-MS /MS som ovenfor.

Analyse af forskellige køretøjer for RM-133 administration

Eleven forskellige køretøjer blev undersøgt ved sc injektion [27-35]. Disse køretøjer blev formuleret som følger: køretøj # 1 [propylenglycol: EtOH (92: 8)]; køretøj # 2 [vandig 0,4% methylcellulose: EtOH (92: 8)]; køretøj # 3 [ricinusolie: EtOH: benzylalkohol: benzylbenzoat (65: 10: 10: 15)]; køretøj # 4 [solsikkeolie: EtOH (92: 8)]; køretøj # 5 [solsikkeolie: tetrahydrofuran (92: 8)]; køretøj # 6 [vandig 25% β-cyclodextrin: EtOH (92: 8)]; køretøj # 7 [sesamolie: EtOH: benzylbenzoat: benzylalkohol: Tween 80 (89,8: 7,8: 1: 1: 0,5)]; køretøj # 8 [sojaolie: EtOH (92: 8)]; køretøj # 9 [RPMI medium: EtOH (92: 8)]; køretøj # 10 [saltvand: dimethylsulfoxid (DMSO): Tween 80 (89,5: 10: 0,5)]; og køretøj # 11 [saltvand: benzylalkohol: carboxymethylcellulose: Tween 80 (98,2: 0,9: 0,5: 0,4)]. De otte biler, der producerer den bedste RM-133 opløselighed (# 1-8) blev injiceret subkutant (0,1 ml) uden testforbindelsen (RM-133) for tolerance og adfærdsmæssige evalueringer, ved at observere musene på 0,25, 1, 3, 7, 23, 26, 28, 30, og 96 timer efter indgivelse. Endelig blev RM-133 injiceret s.c. én gang ved 120 mg /kg /0,1 ml af de bedste syv tolereres køretøjer (# 1,2,4-7) ind ♀ Balb /c-mus (4 pr gruppe), og musene blev overvåget næste med blodprøvetagning ved hjertepunktur efter 3 og 12 timer. Plasmakoncentrationen af ​​RM-133 blev derefter bestemt ved LC-MS /MS som ovenfor.

Virkning af gentagne s.c. injektioner af RM-133 ved hjælp af 3 køretøjer

Ti ♀ Balb /c mus, der vejer ca. 23 g blev adskilt i 3 grupper. Gruppe 1 (3 mus) blev behandlet s.c. med RM-133 (240 mg /kg /0,2 ml, to gange dagligt (AM og PM), hver anden dag) i vandig 0,4% methylcellulose: EtOH (92: 8). Gruppe 2 (3 mus) blev behandlet s.c. med RM-133 (120 mg /kg /0,1 ml, to gange dagligt (AM og PM), hver anden dag) i solsikkeolie: EtOH (92: 8). Gruppe 3 (4 mus) modtog kun en injektion af RM-133 (120 mg /kg /0,1 ml) i vandig 25% β-cyclodextrin: EtOH (92: 8) og blev aflivet 24 timer senere. Mus i gruppe 1 og 2 modtog i alt 8 indsprøjtninger over 4 dage og blev aflivet på dag 8. Mus adfærd blev overvåget under hele forsøgets varighed, og makroskopisk observation af organer blev udført ved obduktion.

Effekt af RM-133 på OVCAR-3 xenotransplantater ved hjælp af to udvalgte køretøjer

Fourty ♀

nu /nu

nøgne mus (22-24 g) blev podet med 5 x 10

6 OVCAR-3 celler pr flanke, i 30% matrigel indeholdende dyrkningsmedium (0,1 ml). Efter 23 dage blev tumorbærende mus randomiseret i 4 grupper på 8 til 9 mus hver. Gruppe 1 (12 tumorer) blev behandlet s.c. med RM-133 (240 mg /kg /0,2 ml, én gang (AM) hver anden dag) i solsikkeolie: EtOH (92: 8), og gruppe 2 (13 tumorer) blev behandlet s.c. med RM-133 (240 mg /kg /0,2 ml, to gange dagligt (AM og PM), hver anden dag) i vandig 0,4% methylcellulose: EtOH (92: 8). To kontrol mus grupper, der hver repræsenterer 12 tumorer, modtog kun køretøjerne. Som nævnt ovenfor, blev tumoren område målt to gange om ugen og kropsvægt overvåget.

Effekt af RM-133 på Panc-1-xenografter

Tyve kvindelige

nu /nu

nøgen mus (22-24 g) blev inokuleret med 5 x 10

6 PANC-1 celler pr flanke, i 30% matrigel indeholdende dyrkningsmedium (0,1 ml). Ti dage efter podning blev tumorbærende mus randomiseret i 2 grupper på 10 mus hver. Mus i den første gruppe (

n

= 16 tumorer) blev behandlet subkutant med RM-133 (240 mg /kg, to gange dagligt (AM og PM), hver anden dag) i 0,2 ml vandig 0,4% methylcellulose: EtOH (92: 8). Mus i den anden (kontrol) gruppe (

n

= 18 tumorer) fik kun køretøjet. Som med tidligere xenografter blev tumoren området målt og mus kropsvægt overvåget.

Syntese og forberedelse af RM-133

aminosteroid RM-133 (2β- [1- (quinolin-2 carbonyl) -pyrrolidin-2-carbonyl]

N

-piperazin-5α-androstan-3α, 17β-diol) blev syntetiseret, karakteriseret og oprenset som tidligere beskrevet [22]. Renheden af ​​RM-133 blev fundet at være 99,5% som bestemt ved højtydende væskekromatografi (Apparat: Shimadzu (Kyoto, Japan); Søjle: Altima, HP, C18-AQ, 4,6 x 250 mm, 5 um; Opløsningsmidler: A gradient fra methanol /vand (70:30) til 100% methanol; UV-detektion ved 190 nm). For

in vivo

behandlinger blev RM-133 suspenderes i bæreren én dag forud for injektion i mus og opbevaret ved 4 ° C under konstant omrøring indtil anvendelse.

Statistik

Duncan-Kramer test blev anvendt til at analysere data, og statistisk signifikans accepteres på

P

0,05 [36].

Resultater og Diskussion

RM-133 er cytotoksisk over for menneskelig OVCAR-3 og Panc-1 celler

For at vurdere effekten af ​​RM-133 på spredning af OVCAR-3 og PANC-1 cancerceller, sidstnævnte blev inkuberet med stigende koncentrationer af RM-133 i 72 timer, og IC

50 af lægemidlet derefter målt. RM-133 klart haft en antiproliferativ aktivitet på de testede cellelinier, med IC

50 værdier på 0,8 og 0,3 uM for OVCAR-3 og PANC-1, (fig 2). IC

50 værdier i 0,1-1 um opnået her lignede dem tidligere målt i et panel af humane cancercellelinjer med denne familie af aminosteroider [23].

IC

50-værdier blev beregnet som 0,8 um (OVCAR-3) og 0,3 pM (Panc-1). Dataene repræsenterer gennemsnittet ± S.D. Fejlsøjlerne er mindre end symbolerne.

OVCAR-3 cellelinien blev afledt fra en patient refraktære over for cytotoksisk kemoterapi, og er derfor en interessant model for at undersøge resistens [25]. Det faktum, at RM-133 udviste potent antiproliferativ aktivitet på en model (OVCAR-3) kendt for sin kemoresistens, samt på Panc-1-celler, fik os til at yderligere at undersøge

in vivo

aktiviteten af ​​RM- 133 i to tumor xenograftmodeller ved hjælp af disse to cancer cellelinjer.

RM-133 hæmmer væksten af ​​OVCAR-3 tumorxenoplantater

Kvindelige nøgne mus blev inokuleret i begge flanker med OVCAR-3 celler. Mus med tumorer blev randomiseret i 2 grupper: den ene gruppe blev behandlet med RM-133 (60 mg /kg) og den anden (kontrol) modtog kun vehikel (propylenglycol: EtOH (92: 8)). Tumorer i kontrolgruppen voksede tydeligvis hurtigere end dem behandlet med aminosteroid (Fig 3A). Begyndende fra dag 15 af behandlingen og indtil slutningen af ​​forsøgsperioden, RM-133-behandlede tumorer blev signifikant mindre end i kontrolgruppen, med en forskel på 60% mellem de to grupper målt ved afslutningen af ​​behandlingen. Da den toksiske potentiale en given forbindelse afhænger af dens koncentration og eksponeringstid [37], og som dødelighed, kliniske symptomer, og ændringer i kropsvægt er blandt de vigtigste indikatorer for dets toksicitet [38], er det bemærkelsesværdigt, at over en 21- dages behandlingsperiode med RM-133, var der ingen tydelig virkning på kropsvægt (fig 3B) eller tilsyneladende toksicitet af lægemidlet (f.eks unormal adfærd, død).

OVCAR-3 celler (5 x 10

6 celler blandet med 30% matrigel) blev inokuleret sc i begge flanker af mus. Mus, der bærer en tumor blev injiceret en gang dagligt s.c. med RM-133 (0 eller 60 mg /kg legemsvægt) i 0,1 ml propylenglycol: EtOH (92: 8), i 21 dage. Tumorstørrelse (A) og legemsvægt hos mus (B) blev registreret. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SEM. **: RM 133-behandlede gruppe er signifikant forskellig fra kontrol (P 0,01)

I slutningen af ​​OVCAR-3 xenograft eksperiment, både kontrol- og RM-133-behandlede grupper hver for sig. fik en enkelt sc dosis af RM-133 (60 mg /kg). Blod blev opsamlet efter 3, 7, 12 og 24 timer, og drug plasmakoncentration målt ved LC-MS /MS. Tidsforløbet for RM-133 plasmakoncentration den samme i gruppe A og B. Det stof udviste en klassisk lægemiddel-frigivende profil [39], med en bolus levering af RM-133 efterfulgt af en vedvarende fald i plasmakoncentrationen (fig 4 ). Den maksimale gennemsnitlige plasmakoncentration (460 ng /ml) blev observeret 3 timer efter bolusinjektion, og var faldet til 81 ng /ml efter 24 timer. Disse resultater viser, at RM-133 ikke ophobes i blodet under 21 dage-xenograft eksperiment. Tumorer i mus behandlet med RM-133 blev også opsamlet ved obduktion for at måle mængden af ​​RM-133. Dette senere var til stede inden i tumoren i en koncentration på 1,2 uM (773 ng /g), hvilket svarer nogenlunde til koncentrationen af ​​RM-133, der inhiberer 50% af OVCAR-3-celleproliferation (IC

50 = 0,8 uM) . Dette resultat er i overensstemmelse med den 60% nedsættelse af tumorstørrelse progression observeret i den første OVCAR-3 xenograft eksperiment. Således er RM-133 ikke tilstrækkelig koncentreret inde i tumoren til fuldt ud at inhibere dens vækst

RM-133 (60 mg /kg) i 0,1 ml propylenglycol:. EtOH (92: 8) blev injiceret s.c. i

nu /nu

nøgne mus. Gruppe A: mus blev tidligere behandlet dagligt i 21 dage med RM-133 ved 60 mg /kg; gruppe B:. mus, der ikke tidligere er udsat for stoffet

RM-133 plasmakoncentration udviser en logaritmisk afhængighed af mængden injicerede

I tidligere forsøg, RM-133 havde vist en maksimal antitumoraktiviteten af ​​57% mod HL60 xenografter [32], der kan sammenlignes med den 60% hæmning målt i denne rapport, dybt OVCAR-3 xenotransplantater. Ved afslutningen af ​​OVCAR-3 xenograft eksperiment, RM-133 plasmakoncentrationen målt 12 timer efter en enkelt bolusinjektion på 60 mg /kg (i 0,1 ml) i gruppe A og B (figur 4) var 178 og 91 ng /ml , henholdsvis. Dette resultat fik os til at undersøge dosis-plasmaniveauet forhold af en enkelt subkutan injektion af RM-133 under anvendelse af en række forskellige doser af forbindelsen. Som vist i figur 5 er plasmakoncentrationen (167 ng /mL) nåede efter injektionen af ​​30 mg /kg kun udgør 17% af den injicerede mængde, og denne andel faldt yderligere med højere doser af RM-133. Er tendensen af ​​dosis-niveau forhold tyder således at øge dosis RM-133 fører til et plateau, sandsynligvis som følge af lav plasma opløselighed eller af den dårlige biotilgængelighed af RM-133 i køretøjet benyttes (propylenglycol: EtOH ( 92: 8)). Imidlertid blev dosis på 480 mg /kg i 0,2 ml køretøjet ikke tolereres af mus (Fig 5), som manifesterede med bevægelse ubehag. Efter disse observationer, at køretøjet alene (0,2 ml propylenglycol: EtOH (92: 8)) blev administreret til musene. Som mistænkt, reaktioner var den samme i de dyr, hvilket indikerer, at køretøjet selv (propylenglycol: EtOH (92: 8), ved 0,2 ml) blev den skyldige. Den maksimale lydstyrke tolereres var næste beslutsom som 0,1 ml. Disse observationer førte os til at undersøge alternative køretøjer, som ville tillade at give højere RM-133 plasmaniveauer med minimale bivirkninger.

RM-133 blev målt ved LC-MS /MS 12 timer efter en enkelt subkutan injektion i Balb /c-mus, under anvendelse af propylenglycol: EtOH (92: 8) som bærer. Volumenet af injektion er 0,1 ml bortset fra det højeste anvendte dosis (480 mg /kg), hvor 0,2 ml blev anvendt. Mængden af ​​0,2 ml, med og uden RM-133, produceret nogle bevægelser ubehag

Vehicle optimering:. Screening af alternative køretøjer til optimal RM-133 administration

Ikke-vandige opløsningsmidler såsom dimethylsulfoxid og polyethylenglycol, detergenter (f.eks Tween, vegetabilske olier, etc.) og solubilisatorer (fx β-cyclodextrin, methylcellulose) tilbyder strategiske muligheder for at styrke forbindelsen opløselighed i lægemiddelopdagelsesprocessen [30, 39]. Derfor blev 11 forskellige køretøjer, der tidligere anvendt med steroide derivater undersøgt. For det første er baseret på opløseligheden af ​​RM-133 i hvert køretøj (tabel A i S1 File), blev otte køretøjer udvalgt til en anden runde af undersøgelsen. I de sidstnævnte eksperimenter, mus modtog en enkelt s.c. injektion af hvert stoffri køretøj til tolerance og adfærdsmæssig evaluering (tabel B i S1 File). Baseret på vores observationer på forskellige efter injektion gange (0,25-96 h), vi elimineret køretøjets # 3 (ricinusolie-baserede). Faktisk efter administration af køretøjets # 3 alene, mus viste mange ubehag symptomer (kløe, spring, og microphtalmia), og i de følgende fire dage, mus præsenteret sår gennemsnit ~ 24 mm

2 ved injektionsstedet.

I et tredje eksperiment, de syv bedst tolererede vehikler indeholdende RM-133 blev injiceret sc i mus (120 mg /kg) og blodprøver efter 3 og 12 timer for RM-133 plasmakoncentration måling (tabel 1). Den højeste RM-133 plasmakoncentration nås efter 3 timer blev opnået med køretøj # 6, efterfulgt (i nævnte rækkefølge) med køretøjer # 5, # 2, # 1, # 7, # 4 og # 8. Som forventet havde RM-133 plasmakoncentration faldt efter 12 timer, men køretøj # 6 stadig gav de højeste niveauer efter at sidstnævnte interval. I modsætning hertil køretøj # 8 gav den laveste plasmakoncentration ved begge tidsintervaller. Baseret på resultaterne opnået ved de tre forsøg beskrevet ovenfor (tabel A og B i S1 File, tabel 1), konkluderede vi, at (i) RM-133 var tungtopløseligt i køretøjets # 5 (små klumper), (ii) at køretøjer # 1 og # 7 førte til hudlæsioner og køretøj # 8 gav de laveste plasmakoncentrationer af den analyserede sæt. På den anden side, køretøj # 6 førte til de højeste plasmakoncentrationer af sættet, mens køretøjer # 2 og # 4 ikke viser nogen negativ virkning på mus. Vi derfor valgt køretøjer # 2, # 4 og # 6 for at udføre en ekstra tolerance test.

Effekt af gentagne subkutane injektioner af RM-133 i 3 udvalgte køretøjer (tolerance test)

RM-133 blev administreret til mus hver anden dag med køretøjer # 2, # 4 og # 6. Dyr blev behandlet i en uge med køretøjer # 2 og # 4, men kun en gang med bærer # 6. Mus adfærd blev overvåget under forsøget, og makroskopisk observation af organer blev udført ved obduktion (tabel C i S1 File). Ti timer efter s.c. injektion af den første dosis af RM-133 (120 mg /kg /0,1 ml) i vandig 25% β-cyclodextrin: EtOH (92: 8) (køretøj # 6), blev muse mobilitet betydeligt reduceret. Fireogtyve timer senere, havde deres generelle tilstand yderligere forværret, som set med afsondrethed, dehydrering, microphthalmia, strittende, accelereret vejrtrækning, og maven udspiling. Baseret på disse observationer, vi brat afsluttet eksperimentere med køretøj # 6, 24 timer efter injektion. Ved obduktion alle mus i denne gruppe viste hæmoragiske lunger, lastet maver sammen med tomme tarme, og 75% udviste lidt forstørrede nyrer. Når korreleret med musen dødsfald tidligere bemærket ved administration køretøj # 6 alene, disse observationer tydeligt, at cyclodextrin-baserede køretøjet ikke blev tolereret af mus, og køretøjet # 6 blev derfor fjernet fra vores screening undersøgelser.

Interessant , og i overensstemmelse med observationer fra forsøget udført med køretøjer kun blev nogen skadelig virkning noteret, når mus blev behandlet med RM-133 med køretøjer # 2 og # 4. Fordi den olieagtige køretøj # 4 (solsikkeolie: EtOH (92: 8) genererede blærer på injektionsstedet, vi begrænset behandling til en enkelt injektion af RM-133 (240 mg /kg /0,2 ml /hver anden dag) for xenograft eksperimenter imidlertid den vandige køretøjet # 2 (vandig 0,4% methylcellulose: EtOH (92: 8)). tilladelse til at udføre multiple injektioner (240 mg /kg /0,2 ml, BID /hver anden dag) ikke har skadelige virkninger på mus Ved obduktion. , har organer ikke nogen påviselig abnormitet. således både køretøjer # 2 og # 4 blev medtaget til sammenligning for

in vivo

studier om RM-133 antitumoraktivitet.

antitumoraktivitet af RM -133 om OVCAR-3 xenotransplantater under anvendelse af to forskellige køretøjer Salg

med solsikke-baserede køretøj (fig 6A), RM-133 begyndte at inhibere tumorvækst efter 20 dage, men effekten først blev betydelig på dag 28 . ved udgangen af ​​behandlingen (40 dage), RM-133 havde fuldstændig hæmmet (dvs. 100%) OVCAR-3 tumorvækst. Men den olieagtige type vehikel # 4 genereret store blærer, som også hæmmet tumor målinger. Når RM-133 behandling blev stoppet på dag 40 på grund af vehikel-inducerede virkninger, tumorvækst genoptaget, og ingen signifikant forskel bestod mellem de to grupper syv dage efter behandling ophør (Fig 6A). Sidstnævnte resultater viser, at aminosteroid RM-133 var ansvarlig for inhibering af tumorvækst. Der sås ingen signifikant forskel i kropsvægt mellem den ubehandlede (kontrol) og behandlede (RM-133) gruppe (figur 6B). Endvidere blev ingen toksicitet symptom enten observeret under undersøgelsen eller ved obduktion.

OVCAR-3 celler (5 x 10

6 celler blandet med 30% matrigel) blev inokuleret s.c. i begge flanker af mus. Tumorbærende mus blev injiceret s.c. med RM-133 (240 mg /kg legemsvægt) eller vehikel alene (0,2 ml solsikkeolie: EtOH (92: 8)) hver anden dag. Tumorstørrelse (A) og legemsvægt hos mus (B) blev registreret. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SEM **: RM-133-behandlede gruppe er signifikant forskellig fra kontrol (P 0,01). *:. RM-133-behandlede gruppe er signifikant forskellig fra kontrol (P 0,05)

Med methylcellulose-baserede køretøj, tumorvækst blev signifikant forskellig mellem de behandlede og kontrolgrupper så tidligt som på dag 15 (fig 7A), og denne forskel varede indtil slutningen af ​​forsøgsperioden (dag 35). Faktisk RM-133 behandling effektivt ophævet den hurtige vækst i OVCAR-3 tumorer, hvis overfladeareal blev reduceret med aminosteroid. Efter 28 dage, RM-133 havde fuldstændig hæmmet (med 100%) tumorvækst, og havde faldt yderligere tumorstørrelse til 78% af den oprindelige værdi ved slutningen af ​​behandlingen (35 dage). Efter afbrydelse af behandlingen, RM-133 stadig opretholdt sin fuldstændige blokade af tumor progression indtil mindst 12 dage efter behandlingens afslutning (fig 7A). Interessant nok blev hverken unormal adfærd eller død indspillet over 35-dages behandlingsperiode med RM-133. Desuden gjorde køretøj # 2 ikke påvirke kropsvægten (Fig 7B) eller fører til nogen åbenlys toksicitet symptom over hele forsøgsperioden samt ved obduktion.

OVCAR-3 celler (5 x 10

6 celler blandet med 30% matrigel) blev inokuleret sc i begge flanker af mus. Tumorbærende mus blev injiceret s.c.