PLoS ONE: Ændring i Mir-21 /PTEN Expression Modulerer Gefitinib Modstand i ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Modstand mod TKI behandling er en væsentlig hindring i effektiv behandling af NSCLC. Udover EGFR mutation status, de involverede mekanismer er stort set ukendt. Nogle beviser understøtter en rolle for microRNA 21 i modulerende stof følsomhed kemoterapi, men dens rolle i NSCLC TKI modstand stadig uudforsket. Denne undersøgelse havde til formål at undersøge, om NSCLC miR-21 medieret resistens over for TKI’er også skyldes PTEN målretning. Her viser vi miR-21 fremmer kræft ved negativt at regulere PTEN udtryk i humane NSCLC væv: høj miR-21 ekspressionsniveauerne var forbundet med kortere DFS i 47 NSCLC patienter; høje miR-21 /lave PTEN ekspressionsniveauer angivet en dårlig TKI klinisk respons og kortere samlet overlevelse i en anden 46 NSCLC patienter, der gennemgår TKI behandling.

In vitro

analyser viste, at miR-21 var opreguleret samtidig til nedregulering af PTEN i pc-9 /GR celler i sammenligning med pc-9 celler. Desuden overekspression af MIR-21 faldt betydeligt gefitinib følsomhed ved nedregulering PTEN ekspression og aktivering Akt og ERK veje i pc-9-celler, mens MIR-21 knockdown dramatisk restaureret gefitinib følsomhed PC-9 /GR-celler ved op- regulering af PTEN ekspression og inaktivering af AKT og ERK veje,

in vivo

in vitro

. Vi foreslår ændring af miR-21 /PTEN udtryk som en ny mekanisme til TKI modstand i NSCLC kræft. Vores resultater giver et nyt grundlag for at bruge miR 21 /PTEN-baserede terapeutiske strategier for at vende gefitinibs modstand i NSCLC

Henvisning:. Shen H, Zhu F, Liu J, Xu T, Pei D, Wang R, et al. (2014) Ændring i Mir-21 /PTEN Expression Modulerer Gefitinib Modstand i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 9 (7): e103305. doi: 10,1371 /journal.pone.0103305

Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Republikken Korea

Modtaget: Marts 4, 2014 Accepteret: 27. juni, 2014, Udgivet: 24 Juli 2014

Copyright: © 2014 Shen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Data er inkluderet i papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81101705 og 81272532), de Jiangsu provinsen kliniske videnskabelige og teknologiske projekter (klinisk forskningscenter, BL2012008) og Natural Science Foundation i Jiangsu-provinsen (BK2011852). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) er den hyppigste årsag til kræft dødsfald på verdensplan. [1] desværre på trods af fremskridt i tidlig påvisning af kræft, de fleste patienter med NSCLC er diagnosticeret med fremskreden-stadie sygdom, hvilket resulterer i dårlig prognose med en median overlevelse på kun 10-12 måneder. [2], [3] Udviklingen af ​​lægemidler, der er målrettet mod epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), såsom EGFR-TKI’er (gefitinib og erlotinib) har forbedret effektiviteten af ​​NSCLC terapi. Faktisk er tilstedeværelsen af ​​aktiverende EGFR exon mutationer spiller en central rolle i at forudsige den terapeutiske effektivitet af EGFR-TKI’er. [2] Disse aktiverende EGFR mutationer ofte væsentligt korrelere med en adenocarcinom-associeret histologi, rygning status, køn og etnicitet. [3] Således har EGFR-TKI’er blevet anbefalet som den første linje behandling for NSCLC patienter med EGFR-mutationer. Desværre er deres kliniske effekt begrænset af udviklingen af ​​erhvervet resistens: de fleste patienter, der oprindeligt reagerer vil efterfølgende opleve sygdomsprogression med kontinuerlig brug af TKI for omkring 9-11 måneder; [4] ca. 50% af patienter, der initialt svare EGFR-TKI udvikler resistens over for EGFR-TKI, mens EGFR T790M mutation i exon20 udgør 50% af dette erhvervet resistens; [4] en anden 20% af TKI erhvervet resistens resultater fra MET amplifikation. [2] Det er stadig uklart, hvordan de resterende 30% af patienterne udvikler erhvervet resistens.

MicroRNA (miRNA), kendt for uløseligt undertrykke mRNA ved parring med 3′-utranslaterede region (UTR) af mRNA’et var vist til negativt at modulere ekspression af målrettede gener. [5], [6] som gener regulatorer, miRNA regulere omkring en tredjedel af gener og spiller en vigtig rolle i cellulære funktioner, herunder proliferation, vækst, differentiering og apoptose. [7], [8] I de seneste år, den afgørende rolle, miRNA i carcinogenese er blevet påvist. [9] Desuden er nogle miRNA fungerer som tumorsuppressorer

in vitro.

[10], [11] Derfor overekspression af sådanne miRNA kan undertrykke målet proteiner, som fungerer som kræftfremkaldende faktorer. [7], [12] I modsætning til lille interfererende RNA, miRNA menes at regulere den samme pathway på flere niveauer. [10] MIR-21 er en vigtig onkogent miRNA, nært beslægtet med tumorvækst og metastase. [13], [14] Indeed, ekspression af MIR-21 blev vist at være associeret med dårlig prognose og kemo-følsomhed i colon adenocarcinoma. [15], [16] Desuden anti-MIR-21 undertrykte cellevækst af brystkræft gennem nedregulering af antiapoptotisk faktor, B-celle lymfom 2 (Bcl-2). [17], [18] Disse data tilsammen støtte en vigtig rolle ændret miR-21 udtryk under tumor udvikling. Så vi undersøgt, om miR-21 modulerer TKI følsomhed i NSCLC patienter så godt.

Vi fandt, at opregulering af miR-21 og nedregulering af PTEN i 47 NSCLC tumorvæv sammenlignet med deres tilstødende normale væv, og at deres ekspressionsniveauer negativt korreleret. MIR-21-ekspression korrelerede med kortere DFS i de 47 NSCLC-patienter. Desuden viste vores data en god korrelation mellem høje miR-21 /lav PTEN ekspressionsniveauerne og dårlig TKI følsomhed med kort samlet overlevelse i 46 NSCLC patienter, der gennemgår TKI behandling. Derfor vi hypotese, at ændring af miR-21-PTEN udtryk modulerer TKI følsomhed i lunge kræftceller. Vi fandt, at miR-21 var opreguleret concomittantly med nedregulering af PTEN i pc-9 /GR celler sammenlignet med pc-9 celler,

in vitro

. Endvidere overekspression af MIR-21 faldt betydeligt gefitinib følsomhed gennem nedregulering af PTEN ekspression og aktivering af Akt og ERK pathways, mens knockdown af MIR-21 drastisk restaureret gefitinib følsomhed PC-9 /GR-celler ved opregulering PTEN udtryk og inaktivering AKT og ERK signalveje, både

in vivo

in vitro

.

Materialer og metoder

Materialer

gefitinib var en slags gave fra AstraZeneca (Tocris, Storbritannien). Antistoffer mod PTEN, phospho-ERK1 /2, phospho-AKT (Ser-473), og total AKT blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antistoffer mod ERK2 blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Antistoffer mod GAPDH blev opnået fra Kangcheng Company (Shanghai, Kina). Lipofectamine og TRIZOL reagenser blev købt hos Life Technologies (Grand Island, NY, USA). MIR-21 efterligner og miR-21-inhibitor blev tilvejebragt af GenePharma (Shanghai, Kina). High Capacity RNA-til cDNA Kit og Power SYBR Green PCR Master Mix blev købt fra Applied Biosystems (Carlsbad, CA). De PC-9 cellelinier blev indkøbt fra Type Culture Collection af det kinesiske Academy of Sciences, Shanghai, Kina. PC-9 gefitinib resistente cellelinie (PC-9 /GR), som blev induceret ved fremstilling af PC-9-celler til stigende koncentrationer af gefitinib som rapporteret tidligere [19], [20], blev venligt tilvejebragt af Department of Oncology, Shanghai Pulmonal Hospital, Tongji Universitet, Shanghai.

Kliniske prøver

Forbundne humane NSCLC prøver (n = 47), og matchede normale tilstødende vævsprøver blev indsamlet fra patienter, der gennemgår standard kirurgiske procedurer i First Affiliated Hospital i Nanjing Medical University, Jiangsu (Kina), med skriftligt informeret samtykke fra patienterne. En del af hver vævsprøve blev straks lynfrosset i flydende nitrogen, medens den anden side blev fikseret i formalin til histologisk undersøgelse.

paraffinindlejrede prøver fra patienter med NSCLC (n = 46), der modtog EGFR- TKI behandling, blev indsamlet fra patologi afdeling af First Affiliated Hospital i Nanjing Medical University, Jiangsu (Kina), med skriftligt informeret samtykke fra patienterne. Alle prøver blev histologisk klassificeret og klassificeres efter TNM stadie af en blindet klinisk patolog. Alle eksperimentelle protokoller blev godkendt af Institutional Review Committee for den første tilknyttede hospital af Nanjing Medical University, Nanjing (Kina).

Cell kultur

Menneskelig pc-9 og pc-9 /GR celle linjer, og HEK293T celler blev dyrket i RPMI og DMEM henholdsvis suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 enheder /ml penicillin, og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en fugtig miljø, der indeholder 5% CO

2 .

Cell transfektion

Hsa-mIR-21 eller HSA-mIR-NC efterligner blev transficeret ind PC-9 celler under anvendelse af Lipofectamine reagens (Life Technologies) ifølge producentens instruktioner. De endelige koncentrationer af HSA-MIR-21 eller HSA-MIR-NC efterligner til transfektion var 40 nM. En lignende fremgangsmåde blev anvendt til transfektion miR-21 inhibitor (40 nM) eller NC i PC-9 /GR celler.

Cell levedygtighed assay

Pc-9 og PC-9 /GR celler blev podet i plader med 96 brønde med en tæthed på 4 x 10

3 celler /brønd og fik lov at adhærere natten over. Parallelt hermed blev Pc-9-celler podet i plader med 96 brønde og transficeret med MIR-21 mimic og NC i 24 timer, mens PC-9 /GR-celler blev transficeret med MIR-21 inhibitor. Efter cellulær adhæsion blev gefitinib tilsat ved en endelig koncentration på 2,5 til 40 mmol /l. Efter 72 h inkubation blev cellelevedygtighed vurderet under anvendelse af Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories) ifølge producentens anvisninger. Hver prøve blev belagt i tre eksemplarer og blev udført tre uafhængige forsøg.

Lentiviral emballage og stabil cellelinje etablering

For at stabilt knockdown miR-21-ekspression i PC-9 /GR celler, den lentiviral emballage kit (Thermo Fisher Scientific) blev anvendt. Lentivirus bærer MIR-21 inhibitor eller negativ kontrol (MIR-NC) blev pakket i overensstemmelse med producentens anvisninger. Grønt fluorescerende protein (GFP) -gen blev indsat i emballagesystemet og co-udtrykkes med miRNA. Lentivirus blev pakket i HEK293T celler og secerneres ud i mediet. PC-9 /GR-celler blev inficeret med lentivirus transporterer MIR-21 inhibitor eller MIR-NC i nærvær af polybren (Sigma-Aldrich), og udvalgt af puromycin (Sigma-Aldrich) i 2 uger for at opnå pc-9 GR /miR -21 inhibitor og pc-9 GR /mIR-NC stabile cellelinjer.

Apoptose assay

Apoptose blev målt som tidligere beskrevet [21]. Kort beskrevet blev celler trypsiniseret og mærket med Alexa Fluor 647 Annexin V (Biolegend) og 7-AAD (BD Pharmingen), og analyseret ved flowcytometri. Celler blev anset apoptotiske når de var annexin V-positive og 7-AAD-negative.

RNA-isolering og kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) analyse

Totale RNA’er blev ekstraheret fra dyrkede celler eller humane vævsprøver under anvendelse af TRIzol reagens ifølge producentens instruktioner. Til måling MIR-21 ekspressionsniveauer blev RNA’er transskriberet af hårnåle-RT-primer under anvendelse PrimeScript RT Reagent Kit (Takara) som tidligere beskrevet [21], [22]. Sekvenserne af RT-primere var som følger: MIR-21-RT, 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG TCAACATC -3 ‘; U6-RT, 5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3 ‘. QRT-PCR blev udført under anvendelse af SYBR Premix DimerEraser (Takara) på en 7900HT systemet (Applied Biosystems). MIR-21 qPCR primere var: sense, 5’-ACACTCCAGCTGGG TAGCTTATCAGACTGA -3 ‘; anti-sense, 5’TGGTGTCGTGGAGTCG 3 ‘. U6 snRNA qPCR primere var: sense, 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ‘; anti-sense, 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 ‘. Udtrykket af miR-21 blev normaliseret til niveauerne af U6 og den sammenlignende tærskel cyklus metode (2

-ΔΔCT) blev anvendt med U6 som kontrol.

Protein udvinding og western blotting

Celler eller væv blev høstet og lyseret på is i 30 minutter i RIPA-buffer (Beyotime) suppleret med 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF). Lysater blev underkastet Western blotting assay som tidligere beskrevet [23] og påvises med antistoffer mod PTEN, phospho-AKT (Ser-473), total AKT, phospho-ERK, total ERK, GAPDH.

Immunhistokemi (IHC )

formalinfikserede, paraffinindlejrede væv, der indsamles fra patienter med NSCLC (n = 46), blev snittet på 5 um og inkuberet med antistoffer mod PTEN (Cell Signaling Technology). Vurderingen af ​​IHC-signaler blev udført af to erfarne patologer i en blindet måde. Fem high-power felter (200 ×) blev udvalgt tilfældigt i hver prøve. Procentdele af tumorceller blev kategoriseret i fem semikvantitative klasser: 0 (≤5% positive celler), 1 (6% -25% positive celler), 2 (26% -50% positive celler), 3 (51% -75 % positive celler) og 4 ( 76% positive celler). Intensitet af farvning blev også semi-kvantitativt bestemt på en skala fra 0-3 som følger: 0 (negativ), 1 (svagt positiv), 2 (moderat positiv), og 3 (stærkt positiv). Produkterne fra procentvise scoringer ved intensiteten af ​​farvning gav endelige IHC score: 0 (negativ), + (1-4), ++ (5-8), og +++ (9-12) som tidligere beskrevet [24]

.

In situ hybridisering

ISH blev gennemført på paraffin indlejring prøver af NSCLC at undersøge den kliniske respons på TKI og miR-21-ekspression. Kort fortalt blev objektglassene behandlet og hybridiseret med 10 pmol probe (LNA-modificerede og DIG mærket oligonukleotid; Exiqon) komplementær til MIR-21, ifølge producentens instruktioner. Efter inkubation med anti-DIG-HRP Fab-fragmenter konjugeret til peberrodsperoxidase, blev de hybridiserede prober detekteret ved inkubation med 3’3-diaminobenzidin opløsning med kerner modfarvet med Carazzi hæmatoxylin. Farvningsmønstre blev analyseret ved 3 eksperter og andelen af ​​positivt farvede tumorceller blev gradueret som følger: 0 (ingen positive celler), 1 ( 10% positive celler), 2 (10% -50% positive celler), 3 ( 50% positive celler). Celler ved hver farvningsintensiteten blev registreret på en skala fra 0 (ingen farvning), 1 (svag farvning, lyseblå eller gul), 2 (moderat farvning, blå eller gul), og 3 (kraftig farvning, mørk blå eller gul) . For tumorer, der viste heterogene farvning, blev den dominerende mønster i betragtning til scoring. Farvningen (SI) blev beregnet som andelen af ​​positivt farvede tumorceller × farvningsintensitet. Ved hjælp af denne metode blev ekspressionen af ​​miR-21 scoret som 0, 1, 2, 3, 4, 6 eller 9. I tilfælde af uenighed (score uoverensstemmelse 1), blev der slides op til revision, og blev opnået enighed af eksperter .

xenograft tumor model i nøgne mus Salg

i tumorvækst assays, 6 uger gammel mand nøgne mus (BALB /cA-nu (nu /nu) blev indkøbt fra SLAC Animal center ( Shanghai, Kina), og vedligeholdes i særlige patogenfrie (SPF) betingelser. protokoller for dyreforsøg blev godkendt af Animal Welfare Udvalg for Nanjing Medical University. Prøver af celler (4 × 10

6) blev suspenderet i 150 pi FBS-frit RPMI DMEM-medium og subkutant injiceret i bageste flanke af nøgne mus (n = 6). Tumorstørrelse blev målt ved anvendelse af en skydelære hver syvende dag, indtil de blev aflivet på dag 35 efter implantering og tumorvolumen blev afledt som 0,5 × Længde × bredde

2.

Statistisk analyse

Værdier blev opnået fra mindst tre uafhængige forsøg og præsenteres som gennemsnit ± SE. Students uparrede

t

test blev udført og værdier blev anset signifikant forskellige, når

P

. 0,05

Resultater

opregulering af miR-21 og nedregulering af PTEN negativt korreleret med kortere DSF i tumorvæv fra humane NSCLC patienter

for at bestemme ekspressionsniveauerne af miR-21 og PTEN protein i tumorvæv fra humane NSCLC patienter, vi vurderede 47 par kræft tumor prøver og tilstødende normale væv (tabel S1) ved QRT-PCR og fundet en signifikant højere udtryk for miR-21 i 37/47 (78,7%) i tumorvæv sammenlignet med tilstødende normale væv (fig. 1A). Da PTEN er en af ​​de vigtige mål for MIR-21, [25], [26] undersøgte vi forholdet mellem ekspression af MIR-21 og PTEN i human NSCLC prøver både ved immunoblot og immunhistokemi (IHC). Vi fandt, at PTEN proteinniveauer blev signifikant reduceret i 34/47 (72,3%) tumorvæv sammenlignet med tilstødende normale dem (fig. 1b). Desuden blev de relative ekspressionsniveauer af PTEN evalueret af to erfarne patologer i et blindet måde, og markeret med endelige IHC score på 0 (negativ), + (svag), ++ (moderat) og +++ (strong) (fig. 1C ). Niveauer af MIR-21 blev reduceret ved høj PTEN intensitet (fig. 1D). Desuden viste scatter plot analyse en omvendt korrelation mellem MIR-21 ekspressionsniveauer og IHC scoringer af PTEN signaler (fig. 1E). Disse resultater viste, at MIR-21 ekspressionsniveauer omvendt blev korreleret med PTEN niveauer i NSCLC væv. For yderligere at vurdere sammenhængen mellem MIR-21 /PTEN ekspressionsniveauerne og prognose i NSCLC patienter, brugte vi Kaplan-Meier overlevelsesanalyse og log-rank test for at vurdere de normaliserede miR-21-ekspressionsniveauer (tumor /normal) og sygdomsfri overlevelse ( DFS). Resultaterne viste, at patienter med høje MIR-21 ekspressionsniveauer havde en kortere sygdomsfri overlevelse (DFS) sammenlignet med patienter med lav MIR-21-ekspression (fig. 1F).

(A) Ekspressionsniveauer af miR- 21 blev opreguleret i 37/47 par NSCLC væv relativt til tilstødende normale prøver. MIR-21 blev analyseret ved hårnåle-QRT-PCR og normaliseret til niveauet af U6. Fold ændringer blev opnået ved forholdet mellem MIR-21 overflod i cancervæv med den i tilgrænsende normale væv. *

s

0,05 indikerer signifikant forskel sammenligne miR-21-ekspression i tumorvæv med tilstødende normale væv. (B) repræsentant PTEN proteinniveauer i NSCLC væv (T) og tilstødende normale prøver (N), der vurderes ved immunoblot, var GAPDH anvendt som indlæsning kontrol. (C) PTEN Immunhistokemi (IHC) resultater af NSCLC sektioner, 0 (negativ), + (svagt positiv), ++ (moderat positiv), og +++ (stærkt positiv). (D) Sammenhæng analyse mellem PTEN protein niveauer og miR-21 ekspressionsniveauerne i NSCLC væv. IHC scoringer blev brugt til at beskrive PTEN protein niveauer i tumorvæv, vurderet af erfarne patologer i en blindet måde. (E) Lineær regression kurver af miR-21-ekspression og PTEN protein niveauer. (F) Kaplan-Meier kurver skildrer sygdomsfri overlevelse efter ekspressionen af ​​miR-21. Afskæringsværdien for undergrupperne (høje og lave) af miR-21 ekspressionsniveauet var den 50-percentilen værdi.

opregulering af miR-21 og nedregulering af PTEN protein er forbundet med dårlig TKI-følsomhed og kortere samlet overlevelse i tumorvæv af humane NSCLC patienter, der gennemgår TKI behandling

Tidligere undersøgelser har vist, at miR-21 inducerer cisplatin modstand i NSCLC [27]. Desuden Wang et al. fandt, at miR-214 regulerer erhvervet resistens over for gefitinib via PTEN /AKT Pathway i EGFR-mutant cellelinjer [28]. I betragtning af den potentielle effekt af miRNA i modulerende narkotika følsomhed, vi undersøgt, om ændring af miR-21 /PTEN udtryk korrelerer med TKI følsomhed. Efter opfølgning af klinisk behandling af de 47 NSCLC-patienter, fandt vi kun 5 patienter, der brugte TKI behandling. En patient, der viser et partielt respons (PR) viste MIR-21 ekspressionsniveauet (tumor /normal) på kun 0,16; tre patienter med stabil sygdom (SD) viste gennemsnitlige MIR-21 ekspressionsniveauer af 2,57; en patient med en progressiv sygdom (PD) viste høj MIR-21-ekspression ved 33,15 (fig. 2A). IHC assays på væv fra disse fem patienter viste, at PTEN ekspressionsniveauer negativt korreleret med klinisk respons af TKI: en PD patient væv viste PTEN ekspression af (-); PTEN ekspression i de resterende fire patienter med PR og SD varierede fra (++) til (+++) (fig. 2B). For yderligere at bekræfte vores resultater, vi vurderede miR-21 udtryk niveauer ved hjælp af ISH assays (fig. 2D) og PTEN ekspressionsniveauerne ved IHC på paraffin indlejrede prøver fra 46 NSCLC patienter behandlet med TKI (gefitinib eller erlotinib) som behandling og fulgt op deres kliniske respons og overlevelse status (tabel S2). Som forventet, MIR-21 ekspressionsniveauer i PD patienter var signifikant højere end i PR og SD-grupper (fig. 2C). Højere miR-21 ekspressionsniveauerne oplyste også kortere samlet overlevelse i TKI behandlede patienter (fig. 2E). Desuden PTEN ekspressionsniveauer i PD patienter var signifikant lavere end i PR og SD patientgrupper (fig. 2F), og højere PTEN ekspression korrelerede med længere samlet overlevelse i TKI behandlede patienter (Fig. 2G). Disse resultater er alle enige og foreslå inddragelse af høj miR-21 /lav PTEN udtryk i modulering af TKI følsomhed i NSCLC.

(A) Klinisk respons TKI og miR-21 ekspressionsniveauerne i 5 NSCLC patienter evalueret ved q-RT-PCR. (B) Klinisk respons TKI og PTEN ekspressionsniveauer i 5 NSCLC-patienter testet ved immunhistokemi. PR (delvis respons) og SD (stabil sygdom) patienter havde relativt lavere miR-21 ekspressionsniveauerne og højere PTEN ekspressionsniveauer sammenlignet med PD (progressiv sygdom) patienter. (*

s

0,05). (C) Sammenhæng analyse udført mellem miR-21 ekspressionsniveauerne og klinisk respons på TKI’er. (D) Repræsentative miR-21 niveauer og scores i NSCLC væv undergår TKI behandling vurderet ved in situ hybridisering. (E) Kaplan-Meier kurver skildrer samlet overlevelse efter ekspressionen af ​​miR-21 i 46 NSCLC patienter, der gennemgår TKI’er behandling. (F) Sammenhæng analyse udført mellem PTEN ekspressionsniveauerne og klinisk respons på TKI’er. (E) Kaplan-Meier kurver skildrer samlet overlevelse efter ekspressionen af ​​PTEN i 46 NSCLC patienter, der gennemgår TKI’er behandling.

PC9 /GR celler viser signifikant resistens over for gefitinib, opregulering af miR-21, nedregulering af PTEN og aktivering af AKT, ERK sammenlignet med PC9 celler

for at teste hvorvidt virkningen af ​​høj mIR-21 /lav PTEN ekspression på modulering af TKI følsomhed, valgte vi pc-9, en TKI sensitive cellelinje, og gefitinib resistente cellelinie PC-9 /GR (venligst stillet til rådighed af Onkologisk afdeling, Shanghai Pulmonal Sygehus, Tongji Universitet, Shanghai) blev induceret ved gennemgang af PC-9 celle til stigende koncentrationer af gefitinib som tidligere rapporteret . [19], [20] Vi bruges CCK-8 assay til påvisning gefitinib følsomhed i PC-9 og pc-9 GR-celler og fundet, at pc-9 GR-celler var resistente over for gefitinib sammenlignet med pc-9 celler (fig. 3A , fig. 3B). IC50 for gefitinib i PC9 /GR-celler var omkring 2,54 mmol /l, 200times højere end i PC9 celler (0,0127 mmol /L, P 0,001) (. Figur 3C). Efter 72 timer på 1 mmol /l gefitinib behandling, vi brugte Flow cytometri at vurdere gefitinib induceret apoptose satser. Vores data viste apoptose er betydeligt højere i PC9 celler sammenlignet med PC9 /GR (15,04% versus 3,08%) (fig. 3D). QRT-PCR-data viste, at MIR-21 var 3,70 gange opreguleret i PC9 /GR-celler sammenlignet med PC9 celler (Fig. 3e). Brug western-blot-analyser, viste vi PTEN tab og aktivering af AKT og ERK i PC-9 GR celler sammenlignet med pc-9 celler, men viste ikke total AKT og total ERK udtryk forskel mellem de to cellelinjer (fig. 3F, 3G).

(A, B) PC-9 og PC-9 /GR-celler blev behandlet med gefitinib i 72 timer i 0,1% serumholdigt RPMI. Cellevækst blev målt ved CCK-8 assay in triplo. Cellevækst ved 72 timer er plottet mod gefitinibs koncentration. (C) gefitinib IC 50 i pc-9 og pc-9 /GR celler med tredobbelte analyser udført. ** Angiver p 0,01. (D) Apoptosis satser af PC-9 /GR og PC-9-celler induceret af gefitinib blev bedømt ved flowcytometri. PC-9 /GR og pc-9-celler blev behandlet med 1 pmol /L gefitinib i 72 timer før apoptose evaluering. (E) Relative ekspressionsniveauer af MIR-21 i PC-9 og PC-9 /GR-celler vurderet ved hårnåle-QRT-PCR, og normaliseret til U6 niveauer. Tredobbelte analyser blev udført for hver RNA-prøve. Signifikante forskelle er angivet med * (P 0,05). (F) PTEN, p-AKT, AKT, p-ERK, ERK proteiner i pc-9 og pc-9 /GR analyserede celler ved Western blot. (G) Kvantificering af western blot analyse viste, at PTEN-proteinekspression blev reduceret i PC-9 /GR celle sammenlignet med PC-9-celler ** P 0,01; p-AKT og p-ERK proteiner udtryk var opreguleret i PC-9 GR celler sammenlignet med pc-9 celler ** P 0,01; Der var ingen signifikante forskelle i total AKT og totale ERK proteiner mellem PC-9 og PC-9 /GR celler.

Forhøjet udtryk for miR-21 reduceret gefitinib følsomhed, forbedret invasiv evne og reduceret gefitinib inducerede apoptose i pc-9 celler ved at nedregulere PTEN og aktivering AKT og ERK veje

Vores resultater er beskrevet ovenfor viste, at miR-21 blev opreguleret og PTEN blev nedreguleret i PC-9 GR celler sammenlignet med PC-9-celler. Derfor fremsatte vi den hypotese, at MIR-21 /PTEN ekspression ændring spiller en vigtig rolle i modulering gefitinib følsomhed i PC-9-celler og PC-9 /GR-celler. Vi transficerede PC-9 celler med MIR-21 efterligner og derefter co-transficerede disse celler med PTEN plasmid for at observere, om PTEN kunne redde MIR-21 inducerede biologiske ændringer i PC-9-celler. qPCR data bekræftede, at MIR-21 ekspression blev signifikant forøget i MIR-21 efterligner transficerede celler sammenlignet med de NC transficerede celler, ** p 0,01 (. figur 4A). Derefter brugte vi CCK-8 assay kit til påvisning gefitinib følsomhed 24 timer efter transfektion. Som forventet, miR-21 gjorde reducere gefitinibs følsomhed i pc-9 celler og overekspression PTEN kunne redde denne gefitinib følsomhed forandring. ** P 0,01 (. Figur 4B, 4C). At observere andre parameter ændringer efter miR-21 transfektion, vi udførte en transwell assay for at bestemme indflydelsen af ​​miR-21 på invasiv evne. Vi fandt, at miR-21 transficerede pc-9 celler var mere indgribende end NC-gruppen og overekspression PTEN kunne redde denne invasive evne ** p 0,01 (. Figur 4D, 4E). For at detektere virkningen af ​​MIR-21 på gefitinib induceret apoptose, blev de ovenfor beskrevne celler behandlet med 1 pmol /L gefitinib i 72 timer. Ved anvendelse af flowcytometri, fandt vi, at i pc-9-celler, blev et markant fald i apoptose observeres i MIR-21 efterligner transficerede celler sammenlignet med NC transficerede celler og MIR-21 mimic og PTEN plasmid co-transficerede celler efter gefitinib behandling (fig. 4F). For bedre at forstå de molekylære mekanismer, der er involveret i MIR-21 induceret gefitinib resistens i PC-9-celler, blev western-blot-assays anvendes til at vurdere ekspression af beslægtede proteiner. I pc-9 celler, forhøjet udtryk for miR-21 resulterede i undertrykkelse af PTEN udtryk og aktivering af p-AKT og p-ERK sammenlignet med NC-gruppen, men ikke ændre total protein udtryk for AKT og EKR. Over-ekspression af PTEN ekspression kunne redde opregulering af MIR-21 induceret aktivering af p-AKT og p-ERK. (Fig. 4G, 4H).

(A) relative ekspressionsniveauer af miR-21 i pc-9 /NC + pCMV 6 transfekterede celler, pc-9 /miR-21 efterligner + pCMV 6 transfekterede celler og PC-9 /mIR-21 efterligner + PTEN plasmid transficerede celler blev vurderet ved hårnåle-QRT-PCR, og normaliseret til U6 niveauer. Tredobbelte analyser blev udført for hver RNA-prøve. Signifikante forskelle er angivet med ** (P 0,01). (B) gefitinib følsomhed PC-9 /NC + pCMV 6-transficerede celler, PC-9 /MIR-21 mimic + pCMV 6 transficerede celler og PC-9 /MIR-21 efterligner + PTEN plasmid transficerede celler blev evalueret ved CCK-8 assay. (C) IC50 for gefitinib i PC-9 /NC + pCMV 6-transficerede celler, PC-9 /MIR-21 efterligner + pCMV 6-transficerede celler og PC-9 /MIR-21 efterligner + PTEN plasmid transficerede celler. ** P 0,001, # P 0,01. (D) PC-9 /NC + pCMV 6-transficerede celler, PC-9 /MIR-21 mimic + pCMV 6-transficerede celler og PC-9 /MIR-21 efterligner + PTEN plasmid transficerede celler blev anvendt til celleinvasion assays. Invasion celler farvet med 0,1% krystalviolet blev talt 24 timer efter udpladning. Øvre paneler: repræsentative fotografier af invasive celler (× 200). (E) Antal invasive celler pr blev opnået fra mindst tre replikere brønde og repræsenteret af middelværdi ± SD (nederste graf). ** Angiver signifikant forskel mellem PC-9 /NC + pCMV 6-transficerede celler og PC-9 /MIR-21 mimic + pCMV 6-transficerede celler (P 0,01). ## Angiver signifikant forskel mellem PC-9 /MIR-21 efterligner + pCMV 6-transficerede celler og PC-9 /MIR-21 mimic + PTEN plasmid transficerede celler (P 0,01). (F) Apoptosis satser af PC-9 /NC + pCMV 6-transficerede celler, PC-9 /MIR-21 mimic + pCMV 6 transficerede celler og PC-9 /MIR-21 mimic + PTEN plasmid transficeres celler induceret af gefitinib blev evalueret ved flowcytometri. Alle celler blev behandlet med 1 pmol /L gefitinib i 72 timer før apoptose evaluering. (G) PTEN, p-AKT, AKT, p-ERK, og ERK-proteinerne af PC-9 /NC + pCMV 6-transficerede celler, PC-9 /MIR-21 mimic + pCMV 6-transficerede celler og PC-9 /miR- 21 mimic + PTEN plasmid transficerede celler blev analyseret ved Western blot. (H) Kvantificering af western blot analyse viste nedregulering af PTEN protein i PC-9/21 efterligner + pCMV 6-transficerede celler sammenlignet med PC-9 /NC + pCMV 6-transficerede celler (* P 0,05) og PC-9 /mIR-21 efterligner + PTEN transficeres celler (# P 0,05); p-AKT og p-ERK-proteinerne ekspression opreguleret i PC-9/21 efterligner + pCMV 6-transficerede celler sammenlignet med pc-9 /NC + pCMV 6-transficerede celler (* P 0,05) og PC-9 /miR- 21 efterligne + PTEN plasmid transfekterede celler (# P 0,05). Der var ingen signifikante forskelle i alt AKT og totale ERK proteiner blandt de tre celler.

Knockdown af miR-21 restaurerede gefitinib følsomhed, reduceret den invasive evne og forbedret gefitinib induceret apoptose i pc-9 /GR celler ved opregulering PTEN og inaktivering af AKK og ERK veje

for yderligere at bekræfte funktionen af ​​miR-21 på gefitinib følsomhed regulering i pc-9 /GR celler, pc-9 /GR celler blev transficeret med miR -21 inhibitor for at mindske miR-21-ekspression og derefter co-transficeret disse celler med PTEN siRNA. Vi først afprøvet effekten af ​​PTEN siRNA vi transficeret pc-9 /GR celler med to PTEN siRNAs og scramble siRNA (siSCR). Både Verdensbanken og QRT-PCR-analyser viste, at siPTEN # 1 kunne mindske PTEN protein (fig. S1A), og mRNA (fig. S1B) udtryk niveau mere effektivt end siPTEN 2 #. Så vi valgte siPTEN # 1 til at gøre yderligere forsøg. qPCR resultater bekræftede, at MIR-21 ekspression blev reduceret betydeligt i MIR-21 inhibitor transficerede celler sammenlignet med NC-celler, ** p 0,01 (. figur 5A). CCK-8 assay viste, at miR-21 knockdown faldt betydeligt gefitinib følsomhed pc-9 /GR og reduceret PTEN ekspressionsniveauet kunne genskabe gefitinibs følsomhed pc-9 /GR ** p 0,01 (. Figur 5B, 5C). Yang et al.