PLoS ONE: Rac1-Dependent Lamellipodial motilitet i prostatakræft PC-3 Cells Revealed af optogenetic Kontrol af Rac1 aktivitet

Abstrakt

lamellipodium, en vigtig struktur for celle migration, spiller en vigtig rolle i invasionen og metastase af kræftceller. Selvom Rac1 anerkendt som en central aktør i dannelsen af ​​lamellipodia, er de molekylære mekanismer, der ligger lamellipodial motilitet ikke fuldt forstået. Optogenetic teknologi gjort det muligt at spatiotemporally kontrollere aktiviteten af ​​fotoaktiverbare Rac1 (PA-Rac1) i levende celler. Anvendelse af dette system, viste vi den rolle, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) i Rac1-afhængig lamellipodial motilitet i PC-3 prostatacancerceller. Gennem lokale blå laser bestråling af PA-Rac1-udtrykkende celler blev lamellipodial motilitet reversibelt induceret. Først blev observeret udadrettede forlængelse af en lamellipodium parallelt med underlaget. Den udvidede lamellipodium derefter viste ruffling aktivitet i periferien. Især blev PI (3,4,5) P

3 og Wave2 lokaliseret i strækker lamellipodium i en PI3K-afhængig måde. Vi bekræftede, at inhibering af PI3K-aktivitet i høj grad undertrykt lamellipodial forlængelse, mens ruffling aktivitet var mindre påvirket. Disse resultater tyder på, at Rac1-induceret lamellipodial motilitet består af to særskilte aktiviteter, PI3K-afhængige udadgående udvidelse og PI3K-uafhængig ruffling

Henvisning:. Kato T, Kawai K, Egami Y, Kakehi Y, Araki N (2014 ) Rac1-Dependent Lamellipodial motilitet i Prostata Cancer PC-3 Cells afsløret af optogenetic Kontrol af Rac1 aktivitet. PLoS ONE 9 (5): e97749. doi: 10,1371 /journal.pone.0097749

Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA

Modtaget: 8. januar 2014 Accepteret: April 24, 2014; Udgivet: 21 maj, 2014

Copyright: © 2014 Kato et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Japan Society for fremme af Science (JSP’er) KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/index.html) 25.861.427 til TK; 24659087 og 23390039 til NA; 26860136 og 24890154 til KK; 25860142 til YE; 24390369 til YK. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cell indvandring spiller en vigtig rolle i embryonal organogenese; sårheling og immunresponser; og patogenesen af ​​flere sygdomme, herunder cancer invasion og metastase [1], [2]. Derfor en forståelse af den molekylære mekanismer underliggende cellemigrering er vigtigt for at udvikle nye terapeutiske strategier til forebyggelse af tumorinvasion og metastase. Cellemigrering involverer de processer af polariseret cellulær fremspring og adhæsion i bevægelsesretningen, celle sammentrækning, demontering af klæbende foci, og tilbagetrækning ved periferien af ​​cellens bagkant [1]. Under tumorcellemigration der er forbundet med cancer metastase og invasion, metastatiske celler udviser drastiske ændringer i form. Denne deformation er forårsaget af actin cytoskeletal remodeling, som reguleres af Rho familie GTPaser såsom Cdc42 og Rac1. Rho familie GTPaser opfører sig som molekylære kontakter, cykling mellem aktive GTP-bundne former og inaktive BNP-bundne former. Rho familie GTPaser aktiveres af guanin nukleotid-exchange faktorer (GEFs) og inaktiveret ved GTPase-aktiverende proteiner (gaps) [3]. Rac1, et medlem af Rho familie GTPaser, fører til produktion af pladelignende fremspring benævnt lamellipodia eller membran flæser, mens Cdc42, et andet medlem af Rho-familien, skaber spike-lignende fremspring kaldet filopodia [3]. Rac1 er hyperaktiveret i metastatisk prostatacancer celler [4]. Derudover inhibering af Rac1 aktivitet blokerer migration og invasion af prostatacancerceller [5]. Disse undersøgelser antyder, at Rac1-medieret lamellipodial dannelse spiller en vigtig rolle i prostatacancer metastaser.

Til dato ekspressionen af ​​Rac1 mutanter såsom konstitutivt aktiv (CA) Rac1Q61L og den dominante negative (DN) Rac1T17N har været meget anvendt til undersøgelse inddragelse af Rac1 i lamellipodial dannelse og ruffling [6]. Dog skal celle fænotype data opnået ved hjælp Rac1 mutanter fortolkes med forsigtighed. På grund af virkningerne af irreversibel, permanent og global ekspression i cellerne, er det svært at sige, at fænotyper af celler, der udtrykker Rac1 mutanter nøjagtigt afspejler proteinets aktion som en molekylær omskifter. At belyse den præcise rolle af Spatiotemporal aktivering af Rac1, Wu et al. [7], [8] for nylig udviklet en foto-aktiverbar Rac1 (PA-Rac1) systemet ved at fusionere en lys-oxygen-spænding (LOV) domæne og en carboxyterminal spiralformet forlængelse (Jα) sekvens til aminoterminalen af ​​et konstitutivt aktiv Rac1. LOV er et protein lys-switch domæne af

Avena sativa

phototropin 1. I den mørke, den flavin-bindende LOV domæne interagerer med Jα og blokerer effektor bindingssted PA-Rac1 ved at konfigurere i sin lukkede kropsbygning. Bestråling med lys ved 400-500 nm lys inducerer dissociation af LOV domæne og Jα helix, og fører til Rac1 aktivering. Dette foto-induceret aktivering er reversibel. Med dette system blev lokaliseret Rac1 aktivering vist at være tilstrækkelig til at inducere cellemotilitet og bestemme retningen af ​​cellebevægelse [7], [8].

Forholdet mellem Rac1 og phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) i dannelsen af ​​lamellipodia er kompliceret, fordi PI3K fungerer både opstrøms og nedstrøms Rac1 [9]. Phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphat (PI (3,4,5) P

3) vides at være binde Rac GEFs og derefter accelerere actinpolymerisation gennem Rac1 aktivering [10]. Derudover har en positiv feedback loop er rapporteret mellem PI (3,4,5) P

3 og Rac for cellepolaritet under eukaryote kemotaksi [11], [12]. Men i reguleringen af ​​celle fremspring og polaritet, rapporter vedrørende funktionen af ​​PI3K neden for Rac1 blandes [13], [14]. Således nøjagtige rolle PI3K neden for Rac1 fortsat et kontroversielt emne.

For at tydeliggøre relevansen af ​​PI3K til Rac1-afhængige lamellipodial motilitet, vi anvendte PA-Rac1 system prostata kræftceller. Billedmanipulation af PA-Rac1 aktivitet under anvendelse af en blå laser muligt for os at skelne mellem to lamellipodial bevægelige processer i levende celler: lamellipodial udvidelse og perifer ruffling. Især fandt vi, at PI3K inhibitorer undertrykte indledningen af ​​lamellipodial udvidelse men havde ringe indvirkning på den perifere ruffling. Den foreliggende undersøgelse viste, at Rac1-afhængige lamellipodial bevægelige processer består af to dissocierbare aktiviteter:. PI3K-afhængige lamellipodial udadgående udvidelse og PI3K-uafhængig perifer ruffling

Materialer og metoder

Reagenser og cDNA konstruktioner

føtalt bovint serum (FBS) og RPMI-1640 blev opnået fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). X-tremeGENE HP DNA transfektion Reagens blev erhvervet fra Roche Diagnostic Systems (Basel, Schweiz). De andre reagenser blev købt fra Wako Pure Chemicals (Osaka, Japan) eller Nacalai Tesque (Kyoto, Japan), medmindre andet er angivet.

pTriEx /mCherry-PA-Rac1Q61L (plasmid # 22027) og pTriEx /mCherry- PA-Rac1 T17N (plasmid # 22029) blev opnået fra Addgene (Cambridge, MA). Dr. Joel A. Swanson (University of Michigan) venligt givet pmCitrine-AKT-pleckstrin homologi domæne (PH) og pmCitrine-Rac1Q61L. De pEGFP-N1-Wave2 konstruktioner var generøse gaver af Dr. Tadaomi Takenawa (Kobe University).

Cell Kultur og transfektion

PC-3 humane prostata kræftceller blev købt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD) og blev opretholdt i RPMI-medium indeholdende 10% varmeinaktiveret FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Cellerne blev holdt ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 incubator. For live-cell imaging, blev cellerne podet på 25 mm dækglas i 35 mm-skåle ved en densitet på 2,0 x 10

4 celler /skål og blev inkuberet natten over før transfektion.

X-tremeGENE HP DNA-transfektion Reagens blev anvendt til plasmid transfektion ifølge producentens anvisninger. pTriEx /mCherry-PA-Rac1Q61L blev sat til mm skåle 35. I co-transfektion behandlinger, blev 0,01-0,5 ug af de egnede plasmider sat til 35 mm skåle sammen med 0,3 ug af PA-Rac1 plasmidet.

Drug Behandlinger

For at bestemme rolle PI3K i Rac1-induceret cellemotilitet, blev cellerne behandlet med PI3K-inhibitorer under bestråling. Vi brugte 50 pM LY294002 (Sigma), 100 nM wortmannin (Sigma), og 1 uM ZSTK474 (Aktive Biochemicals) som PI3K-inhibitorer. LY294002 og wortmannin, som er pan-PI3K-inhibitorer, er almindeligt anvendt som redskaber til undersøgelse af forskellige signaltransduktionsveje, der involverer PI3K. ZSTK474 hæmmer også alle fire PI3K-isoformer, men ikke inhiberer PI3K-relaterede kinaser såsom mTOR og DNA-afhængig proteinkinase. Disse inhibitorer blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO), opbevaret ved -20 ° C, og påført til cellerne ved de angivne slutkoncentrationer. Disse inhibitorer blev sædvanligvis tilsat til cellerne 30 min før fotoaktivering, men i nogle eksperimenter, blev de tilsat under fotoaktivering. For kontrolbehandlingerne, blev 0,1% DMSO anvendt til cellerne.

Fotoaktivering og live-cell imaging

12-24 timer efter transfektion blev dyrkningsmediet erstattet med Ringers puffer (RB ) bestående af 155 mM NaCl, 5 mM KCI, 2 mM CaClz

2, 1 mM MgCl

2, 2 mM Na

2HPO

4, 10 mM glucose, 10 mM HEPES pH 7,2, og 0,5 mg /ml bovint serumalbumin. De 25 mm dækglas blev anbragt i en RB-fyldt kammer på en 37 ° C termo-kontrollerede fase (Tokai Hit INU-ONI, Shizuoka, Japan). Fotoaktivering af PA-Rac1 og live-cell imaging blev udført ved hjælp af en Axio Observer Z1 omvendt mikroskop udstyret med en laser scanning enhed (LSM700, Zeiss), som tidligere beskrevet [15]. At photoactivate PA-Rac1, det indikerede de prostatacancerceller udtrykker mCherry-PA-Rac1 blev gentagne gange bestråles under anvendelse af en 5 mW 445 nm laser ved 0,2% effekt i de angivne perioder i en fotoblegning tilstand. Live-cell billeder blev erhvervet gennem et 63x Plan-Apochromat /N. A. 1.4 linse hver 15 sek med en 10 mW 555 nm laser på 0,5% -2,0% magt til at opnå mCherry fluorescens og lyse-field fase-kontrast. At visualisere PI (3,4,5) P

3 eller Wave2 blev cellerne cotransficeret med pmCherry-PA-Rac1 og pmCitrine-AKT-PH-domæne eller pEGFP-Wave2 hhv. EGFP eller mCitrine fluorescens billeder blev erhvervet kun på første og sidste tidspunkter for at undgå utilsigtet fotoaktivering ved 488 nm laser, da denne excitation bølgelængde lidt overlapper fotoaktivering spektrum [8]. Vi har justeret magt 488 nm laser så lavt som muligt, således at erhvervelsen af ​​den første ramme af laser ikke ville påvirke PA-Rac1 aktivitet.

Time-lapse billeder ved hjælp af fase-kontrast og fluorescens mikroskopi var taget ved 15 sek mellemrum og samles til QuickTime-film ved hjælp af Zen 2009 software (Carl Zeiss). Kymograph analyser blev udført ved hjælp af MetaMorph imaging software (Molecular Devices). De billeddata, der præsenteres her, er repræsentative for resultaterne af mindst tre uafhængige forsøg.

Kvantitative Image Analysis

For kvantitativ billedanalyse af lamellipodial udvidelse på grund af PA-Rac1 fotoaktivering i fravær eller tilstedeværelse af PI3K inhibitorer, tog vi målinger af celle område øges ved at fratrække de områder af cellerne før fotoaktivering fra dem efter fotoaktivering hjælp MetaMorph imaging software.

for kvantitativ analyse af mCitrine-AKT-PH og EGFP-WAVW2 rekruttering til fotoaktiverede områder blev fluorescensintensiteterne i regionerne interesse målt ved hjælp MetaMorph imaging software. De fluorescens intensiteter af mCitrine og EGFP efter 5 min af fotoaktivering blev sammenlignet med fluorescens intensiteter i det tilsvarende område før fotoaktivering bruger mindst 16 celler.

For at kvantificere effekten af ​​PI3K inhibitorer på udvidet lamellipodia og ruffling aktivitet i mCitrine-Rac1Q61L-udtrykkende celler, blev cellerne fikseret med 4% paraformaldehyd ved 30 minutter efter tilsætningen af ​​PI3K-inhibitorer (50 pM LY294002, 100 nM wortmannin, eller 1 uM ZSTK474) eller kun vehikel (0,1% DMSO). Brug af MetaMorph imaging system blev de største diameter celler, der udtrykker Rac1Q61L målt før og efter medicinsk behandling for at evaluere effekten af ​​PI3K-inhibering på den forlængede lamellipodial. Ligeledes blev de perifere flæser per celle tælles ved hjælp af en fluorescens mikroskop for at vurdere virkningen af ​​PI3K hæmning på ruffling aktivitet. Tredive celler i hver gruppe blev underkastet den kvantitative billedanalyse.

Data er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (SE) for antallet af celler, der er angivet i teksten. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Wilcoxon t-test funktion i Excel 2012. Forskelle mellem de analyserede prøver blev betragtet som signifikante ved p. 0,05

Resultater

Lokal Aktivering af PA-Rac1 reversibelt Fremkalde Lamellipodial Udvidelse og rynkning

for at belyse forholdet mellem Rac1 aktivering og lamellipodial dynamik, vi introducerede mCherry-smeltet PA-Rac1 i PC-3 celler. Efter bekræftelse af ekspressionen af ​​mCherry-PA-Rac1 baseret på mCherry signal, vi bestrålet en perifer region af cellerne ved hjælp af en 445 nm laser i pauserne erhvervelse image og erhvervede fase kontrast billeder af levende celler hver 15 sek ved konfokal mikroskopi. Typisk efter 1-4 min på bestråling med 445 nm laser, en tynd plade-lignende fremspring (dvs. en lamellipodium) strækker sig parallelt med underlaget blev observeret ved cellen perifere site, der blev bestrålet ved 445 nm laser. Den lamellipodium nået sin maksimale længde efter 5-6 min af PA-Rac1 aktivering. På det tidspunkt, efter den udadgående udvidelse, den fuldt udstrakte lamellipodium krøllet sin forkant for at vise en perifer ruffling bevægelse. De ruffling bevægelser fortsatte for varigheden af ​​bestrålingen. Efter bestråling ophørt, ruffling både lamellipodial udvidelse og det perifere omgående trak sig tilbage (fig. 1 og Movie S1). I vores tidligere undersøgelse, ruffling dorsal blev induceret i RAW 264 makrofager af PA-Rac1 aktivering [15], [16], men dorsal ruffling var ikke fremtrædende i PC-3 celler.

PC-3 celler var forbigående transficeret med pTriEx /mCherry-PA-Rac1 og udsat for lokal fotoaktivering af PA-Rac1 (rektangulært område skitseret af blå prikker). Time-lapse billeder af en PC-3-celle udtrykker mCherry-PA-Rac1 blev erhvervet under fotoaktivering hjælp 445-nm laser bestråling. De øvre og midterste paneler viser fase-kontrast og mCherry fluorescens billeder, hhv. Forløbne tider efter indledningen af ​​fotoaktivering vises øverst. I den nederste panel, er konturerne af cellens form i de angivne forløbet gange trukket i blå (0 min, original), gul (3,5 min, udvidelse fase), og rød (6 min, ruffling fase). De sorte profiler angiver membran flæser. Scale bar, 10 um.

Når vi bestrålet et andet område af den samme celle, en lamellipodial udvidelse blev genereret på den nyligt bestrålet område, hvilket tyder på, at disse fænomener var afhængige af lokale PA-Rac1 aktivering ved lysbestråling (fig. 2). Det overekspression af et BNP-bundne (dominant negativ) mutant af PA-Rac1 (PA-Rac1 T17N) inducerede ikke enten lamellipodial udvidelse eller perifer ruffling efter 445-nm laser bestråling (ikke vist). Dette fund viste, at de morfologiske forandringer som følge af 445-nm laser bestråling er afhængige af GTP-loaded Rac1.

Time-lapse billeder af en PC-3-celle udtrykker mCherry-PA-Rac1 blev erhvervet i løbet af PA-Rac1 foto-manipulation ved lokal laserbestråling af forskellige områder. Valgt fase-kontrast og mCherry fluorescens billeder vises. Først område 1 blev bestrålet i 10 minutter. Bestrålingen blev derefter flyttet til region 2. Ved 25 min, bestrålingen blev slukket. Udvalgte time-lapse billeder af fase-kontrast og mCherry fluorescens vises. Den strækker sig og trække lamellipodia er skitseret i rød og gul, hhv. Scale bar, 10 um.

PA-Rac1-induceret Lamellipodial Extension er afhængig PI3K

For at undersøge effekten af ​​hæmmende PI3K aktivitet på PA-Rac1-induceret lamellipodial motilitet, vi brugte LY294002, en syntetisk inhibitor af PI3K. Vi først bekræftet, at de celler, der udtrykker PA-Rac1 udstillet lamellipodial udvidelse og ruffling grund fotoaktivering. Efter ophør fotoaktivering, tilføjede vi 50 pM LY294002 til de samme celler. Når vi bestrålede de samme regioner af cellerne 30 min efter tilsætningen af ​​LY294002 blev lamellipodial forlængelse stærkt undertrykt af PI3K-inhibitor (fig. 3A og Movie S2). Vi udførte samme forsøg under anvendelse 22 PC-3-celler og kvantitativt sammenlignet stigningen området på grund af PA-Rac1 aktivering i hver celle før og efter behandling med LY294002 (fig. 3B). Den kvantitative billedanalyse viste, at stigningen i celle området på grund af PA-Rac1-induceret lamellipodial forlængelse blev signifikant undertrykt af LY294002 (p. 0,01, n = 22, fig 3B).

(A) PC- 3 celler blev transient transficeret med pTriEx /mCherry-PA-Rac1. Cellerne blev udsat for gentagne fotoaktivering i fravær (kontrol) eller nærvær af 50 uM LY294002. Forkanten af ​​den udragende lamellipodium er skitseret i rødt. Scale bar, 10 um. (B) Den øgede celle område på grund af lamellipodial forlængelsen blev kvantificeret ved at subtrahere det område af cellen før fotoaktivering fra området af cellen 7 min efter begyndelsen af ​​PA-Rac1 aktivering. Denne stigning blev bekræftet i 22 PC-3 celler. Dataene plot viser den forøgede område på grund af lamellipodial ekspansion, som blev induceret ved PA-Rac1 fotoaktivering i fravær [LY (-)] eller nærvær af LY294002 [LY (+)]. Betydningen af ​​forskellene mellem LY (-) og LY (+) blev bekræftet med Wilcoxon t-test (til højre). Stigningen i lamellipodial område i overværelse af LY294002 var signifikant lavere end for kontrol- celler (p 0,01). (C) Kymographic analyse blev udført ved en to-hovedet pil anbragt tværs over lamellipodium af en PC-3 celle, der udtrykker mCherry-PA-Rac1 før og efter tilsætningen af ​​LY294002. Laseren-bestrålede område er indikeret med et blåt rektangel. Den hvide streg skitserer den strækker lamellipodium, og den stiplede linje skitserer den oprindelige celleform. Det nedre panel viser kymograph af en lamellipodium undergår ændringer i længden. Den kymograph viser udvidelse og tilbagetrækning af en lamellipodium under PA-Rac1 aktivering (blå 1) og deaktivering (sort 1), hhv. Den grønne pil angiver tilsætning af LY294002. PI3K-inhibitoren havde mindre af en hæmmende virkning på lamellipodial udvidelse og rynkning (blue 2). Imidlertid blev indledningen af ​​lamellipodial forlængelse drastisk hæmmede (sort 2-blå 3). Scale barer, 10 um.

Derudover gennemførte vi kymographic analyse for at bestemme ændringer i længden af ​​lamellipodia. Efter bekræftelse PA-Rac1-induceret lamellipodial udvidelse og ruffling grund PA-Rac1 fotoaktivering, tilføjede vi LY294002 til cellerne under PA-Rac1 fotoaktivering. Selv længderne af lamellipodia blev ændret på grund af perifer ruffling, den inhiberende virkning af LY294002 på lamellipodial forlængelse var lille. Perifere ruffling varet for varigheden af ​​bestråling. Umiddelbart efter fotoaktivering ophørt, både lamellipodial udvidelse og perifer ruffling aftaget helt. Når vi igen bestrålet samme region, cellerne viste ikke lamellipodial forlængelse (fig. 3C). Disse resultater antyder, at dannelsen af ​​en lamellipodium er mere følsomme over for PI3K-inhibitorer end er opretholdelsen af ​​forlænget lamellipodia og perifer ruffling.

Lignende resultater blev opnået ved anvendelse af 100 nM wortmannin eller 1 uM ZSTK474 som PI3K-inhibitorer (fig. S1). Som kontrol blev udført de samme PA-Rac1 aktivering eksperimenter under anvendelse af celler behandlet med 0,1% DMSO, køretøjet af inhibitorerne. PA-Rac1-induceret lamellipodial dannelse blev ikke hæmmet af DMSO (fig. S2).

PA-Rac1 Fotoaktivering kan Lokalt Aktiver PI3K og Recruit Wave2

Da PA-Rac1-induceret lamellipodial forlængelse var hæmmet af de PI3K inhibitorer, vi forsøgt at præcisere, at PA-Rac1 aktivering førte til PI3K aktivering. For at overvåge produktionen af ​​PI (3,4,5) P

3 ved PI3K-aktivitet, blev PC-3 celler cotransficeret med pmCitrine-AKT-PH og pTriEx /mCherry-PA-Rac1Q61L og observeret ved hjælp af en Zeiss LSM700 (Fig . 4). Fluorescensintensiteten af ​​mCitrine-AKT-PH på lamellipodial forkant efter 5 min af PA-Rac1photoactivation blev målt under anvendelse MetaMorph imaging software og blev kvantitativt sammenlignet med den samme region, før fotoaktivering. Efter 5 min af lokal aktivering af PA-Rac1, fluorescensintensiteten af ​​mCitrine-AKT-PH viste en 125,4% ± 22,3% stigning (n = 16) sammenlignet med målt før fotoaktivering, hvilket antyder, at niveauerne af PI (3,4 , 5) P

3 i de strækker lamellipodia blev stærkt forøget af den lokale fotoaktivering af PA-Rac1. I nærvær af LY294002, udviste ingen celler en stigning i fluorescensintensitet mCitrine-AKT-PH efter bestråling. Dette fund tyder på, at Rac1 fotoaktivering aktiverer PI3K at producere PI (3,4,5) P

3 fra PI (4,5) P

2 ved membran strækker lamellipodia.

PC -3-celler blev co-transficeret med pTriEx /mCherry-PA-Rac1 og mCitrine-AKT-PH. Phase-kontrast, mCherry-PA-Rac1 (rød fluorescens), og mCitrine-AKT-PH (gul fluorescens) billeder blev erhvervet før og efter PA-Rac1 fotoaktivering. PA-Rac1 fotoaktivering blev gentaget i den samme celle region i fravær (kontrol) eller tilstedeværelse af 50 uM LY294002. Niveauerne af PI (3,4,5) P

3 blev forøget i at udvide lamellipodium ved fotoaktivering (pilespidser). I nærvær af LY294002, PI (3,4,5) P

3 blev ikke øget i den region, hvor PA-Rac1 var foto-aktiveret. Den blå-stiplede rektangel angiver fotoaktivering område. Den strækker sig lamellipodium er skitseret i rødt. Scale barer, 10 um.

Desuden undersøgte vi dynamikken i Wave2 under lamellipodia frembringende proces, fordi Wave2 spiller en stor rolle i Rac1-induceret actin reorganisering i forbindelse med PI (3,4 , 5) P

3 [17] – [19]. Efter 5 min på bestråling med 445 nm lys, EGFP-Wave2 lokaliseret som en stiplet linie ved forkanten af ​​den udragende lamellipodial (fig. 5). Fluorescensintensiteten af ​​EGFP-Wave2 efter fotoaktivering viste en 315,1% ± 54,4% stigning (n = 17) på forkant af strækker lamellipodia. Efter tilsætning af LY294002, blev hverken EGFP-Wave2 rekruttering eller lamellipodial forlængelse induceret af PA-Rac1photoactivation (fig. 5). Disse resultater viser, at Wave2 er rekrutteret af PI (3,4,5) P

3 og bidrager til Rac1-afhængige lamellipodial udvidelse gennem actin polymerisering.

PC-3 celler blev cotransficeret med pTriEx /mCherry-PA-Rac1 og pEGFP-N1-Wave2. Phase-kontrast, mCherry-PA-Rac1 (rød fluorescens), og EGFP-Wave2 (grøn fluorescens) billeder blev erhvervet før og efter PA-Rac1 fotoaktivering. PA-Rac1 fotoaktivering blev gentaget i den samme celle region i fravær (kontrol) eller tilstedeværelse af 50 uM LY294002. De gule pilespidser indikerer, at Wave2 blev rekrutteret til den forreste kant af strækker lamellipodium. Ved tilstedeværelse af LY294002 blev Wave2 ikke rekrutteret til periferien af ​​de celler, hvor PA-Rac1 blev fotoaktiverede. Den blå-stiplede rektangel angiver fotoaktivering område. Scale bar, 10 um.

PI3K hæmmere påvirker ikke Extended lamellipodia men gør Forbedre Peripheral ruffling

For at klarlægge effekten af ​​PI3K hæmning om opretholdelse af udvidet lamellipodia, vi anvendte LY294002 til PC-3 celler, der udtrykker mCitrine-Rac1Q61L, et konstitutivt aktiv Rac1 mutant. De mCitrine-Rac1Q61L-udtrykkende celler havde godt spredt lamellipodia omkring hele deres omkredse. Når vi tilføjet 50 pM LY294002 til disse celler, den udvidede lamellipodia krympede kun lidt, selv efter 30 min. Overraskende blev perifer ruffling aktivitet markant forbedret ved PI3K inhibering i Rac1Q61L-udtrykkende celler (fig. 6 og Movie S3). Kvantitativ analyse af ændringerne i maksimal diameter celle indikerede, at denne faktor ikke var væsentligt påvirket af nogen PI3K-hæmmer, mens antallet af perifere flæser blev stærkt forøget efter 30 min af PI3K hæmning (tabel 1).

PC- 3 celler blev transficeret med pmCitrine-Rac1Q61L. De time-lapse billeder af fase-kontrast og mCitrine-Rac1Q61L fluorescens blev fanget før (til venstre) og efter (højre) tilsætning af LY294002. Kymographs blev skabt for at vise ændringer i længden af ​​en lamellipodium ved positionen for de to hoveder linie. Den mCitrine-Rac1Q61L-udtrykkende celle havde et forlænget lamellipodium omkring hele dens omkreds. Efter tilsætningen af ​​50 pM LY294002, havde den udvidede lamellipodium skrumpet kun lidt, men den perifere ruffling var udtalt. De kymographs viser dynamiske ændringer i længde som følge af forbedret ruffling efter tilsætning af LY294002. Scale barer, 10 um

Diskussion

lamellipodia kan inddeles i tre typer:. Den tynde forkant af en celle, der strækker membranen langs underlaget, det perifere flæser dannet ved den opadgående bøjning af forkanten, og de vertikalt dorsale ruffles der vises bag den forreste kant på den dorsale overflade af cellen [9], [20]. Imidlertid har de forskellige mekanismer, der regulerer disse lamellipodial bevægelige processer ikke afklaret. PC-3-celler og andre prostatacancerceller ikke udviser dorsal ruffling, der er observeret i RAW264 makrofager efter PA-Rac1 aktivering [15]. Denne forskel er mest sandsynligt på grund af forskellene mellem disse celletyper. PC-3 celler viste bemærkelsesværdig lamellipodial udvidelse og perifer ruffling på PA-Rac1 aktivering. Den foreliggende undersøgelse blev foretaget for at karakterisere lamellipodial dynamik og deres regulering i PC-3-cancerceller, som lamellipodial motilitet spiller en central rolle i invasionen og metastase af prostatacancerceller.

Tidligere rapporter har bemærket, at inhiberingen af PI3K-aktivitet hindrer al blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF) -induceret lamellipodial bevægelige processer i fibroblaster, herunder udvidelse, perifer ruffling, og dorsale flæse dannelse [19]. Fordi PI3K er involveret i den tidlige fase af signaltransduktion fra PDGF-receptoren i fibroblaster [21], kunne alle reaktioner på PDGF blive opfanget af PI3K hæmning. Men PI3K aktivitet er efter sigende unødvendig for M-CSF-induceret ruffling og EGF-induceret dorsal ruffling i A431 celler [22], [23]. Således signalering fra distinkte receptorer fører til pjuske dannelse i forskellige celletyper. I vores forsøg under anvendelse af optogenetic kontrol med Rac1 aktivitet, vi direkte induceret Rac1-medieret lamellipodial aktivitet uden opstrøms signalering fra receptorer. Fordi inddragelse af PI3K tidligt signaltransduktion fra forskellige typer af receptorer derfor kunne ignoreres, kunne vi belyse den rolle, PI3K i lamellipodial motilitet nedstrøms Rac1. Brug live-cell imaging kombineret med PA-Rac1 billedmanipulation, kunne vi tydeligt vise, at lamellipodium først strækker sig udad parallelt med underlaget, og at den fuldt udstrakte lamellipodium viser derefter ruffling aktivitet ved curling op forkanten. Endvidere fandt vi, at den lamellipodial forlængelse induceret af PA-Rac1 aktivering var alvorligt perturbed af PI3K-inhibitorer mens perifer ruffling ikke blev inhiberet. Disse resultater antyder, at to typer af lamellipodial motilitet, udvidelse og rynkning, differentielt reguleret af PI3K-afhængige og PI3K-uafhængige signalveje.

Wiskott-Aldrich syndrom protein (WASP) og WASP-familie verprolin-homologt protein (WAVE) familie proteiner er aktivatorer af ARP2 /3-afhængige polymerisering [17]. WAVE familie proteiner er forbundet med lamellipodial dannelse gennem Rac1 signalvejen. For at forhindre uorganiseret actin polymerisering, eksisterer WAVE familie proteiner heteropentameric proteinkomplekser, der hindrer deres egne aktive steder. Selvom Bølger er funktionelt aktiveret af GTP-bundne Rac1 når actin polymerisering startes, kan bølger ikke binde direkte til GTP-bundet Rac1. I stedet IRSp53 (insulin receptor tyrosin kinase substrat p53) virker som et linkermolekyle til at forbinde Rac1 og WAVE komplekset [18]. GTP-bundet Rac1 inducerer en allosterisk ændring i WAVE kompleks, der udsætter sit aktive sted; Wave2 derefter aktiverer ARP2 /3-kompleks, som bliver en kerne for actin polymerisering på forkant af lamellipodium [24] – [26].

I vores PA-Rac1-aktivering eksperimenter, Wave2 blev lokaliseret til forkanterne af at udvide lamellipodia. hverken Wave2 rekruttering eller lamellipodial forlængelsen blev imidlertid observeret, når PI3K-aktivitet blev inhiberet. Disse resultater antyder, at PI (3,4,5) P

3 er påkrævet for Wave2 rekruttering og for lamellipodial forlængelse. Fordi Wave2 har en PI (3,4,5) P

3-bindende sekvens [19], PI (3,4,5) P

3 kan rekruttere Wave2 til forkanten. Suetsugu et al. [18] rapporterede, at aktiviteten af ​​Wave2 komplekset blev optimeret ved IRSp53 i samarbejde med aktiveret Rac1 og PI (3,4,5) P

3. Endvidere er de samtidig binding af GTP-bundne Rac og sure phospholipider, såsom PI (3,4,5) P

kræves 3 til Wave2 for den effektive rekruttering og aktivering af Wave2 [17]. Disse tidligere rapporter styrke vores påstand om, at hæmning af lamellipodial forlængelse af PI3K hæmmere resulterer fra den forstyrrelse af Wave2 rekruttering.

I denne undersøgelse aktiveringen af ​​PA-Rac1 inducerede produktion af PI (3,4,5 ) P

3 og rekruttering af Wave2 når lamellipodial udvidelse blev indledt. Desuden PI3K inhibitorer hindrede rekruttering af Wave2 og PI (3,4,5) P

3 og undertrykt lamellipodial forlængelse. Disse resultater viser, at PI3K spiller en væsentlig rolle som initiativtager lamellipodial forlængelse. Endvidere har vi anvendt konstitutivt aktive Rac1Q61L-udtrykkende celler at observere responset af den udvidede lamellipodia til inhibering af PI3K-aktivitet. I celler, der udtrykker Rac1Q61L, den udvidede lamellipodia var relativt resistente over for PI3K-inhibitorer.