PLoS ONE: p53 Øger Intra-Cellular Calcium Frigivelse ved transkriptionel regulering af Calcium Channel TRPC6 i GaQ3-behandlet Cancer Cells

Abstrakt

p53 og calcium signalering er indbyrdes afhængige og er kendt for at vise både synergistisk og antagonistiske virkninger på hinanden i det cellulære miljø. Men ingen molekylære mekanisme eller cellulær sti er kendt, hvilket viser direkte regulering mellem disse vigtige cellulære signalmolekyler. Her har vi vist, at i cancerceller behandlet med anti-neoplastisk lægemiddel GaQ

3, p53, er der en stigning i intracellulære calciumniveauer ved transkriptionel regulering af en hidtil ukendt calciumkanal gen TRPC6. p53 binder direkte til en 22 bp-responselement i TRPC6 genpromotoren og øge dets mRNA og proteinekspression. Over-ekspression af TRPC6 resulterer i calcium-afhængig apoptotisk død og aktivering af apoptotiske gener i en række forskellige cancerceller. Denne forskning viser, at p53 og dets transkriptionel aktivitet er kritisk i reguleringen af ​​calcium signalering og en stigning i den intracellulære calcium niveauet kan være en af ​​de anti-cancer strategier til at inducere apoptose i cancerceller

Henvisning:. Madan E, Gogna R, Keppler B, Pati U (2013) p53 Øger Intra-Cellular Calcium Frigivelse ved transkriptionel regulering af Calcium Channel TRPC6 i GaQ

3-behandlet kræftceller. PLoS ONE 8 (8): e71016. doi: 10,1371 /journal.pone.0071016

Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: April 15, 2013; Accepteret: 30 jun 2013; Udgivet: 16 august, 2013 |

Copyright: © 2013 Madan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Schweiziske Cancer League, Josheph Steiner tilskud tildeling og indiske råd for Mecical Research (ICMR). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Gallium og dens organiske derivater har vist høj konsistens og effektivitet som anti-cancer medicin [1] – [5]. Vi har for nylig etableret et nyt organisk derivat af gallium “GaQ

3″ [tris (8-quinolinolato) gallium (III)] (KP46) som en effektiv anti-cancer lægemiddel i kræftceller med Wt-p53 eller Mt-p53 protein [6]. Vi observerede, at GaQ

3 inducerer calcium signalering i kræftceller ved at øge de intracellulære calcium. Stigning i cellulære Ca

2+ aktiverer p53 protein og øger p53 cellulære niveauer. GaQ

3-induceret intracellulær calciumfrigivelse var signifikant højere i cancerceller med vildtype p53 end i cancerceller med mutant p53 eller med p53 gendeletion [6]. Interessant nok blev det observeret, at stigningen i intracellulært Ca

2+ udgivelse var p53-afhængig og hæmning af p53 transkriptionel aktivitet ved hjælp pifithrin-α afskaffet intracellulære Ca

2+ frigivelse. Denne observation tydede på, at p53 transkriptionelt kunne regulere intracellulære Ca

2 + release og Ca

2+ signalering i GaQ

3-behandlede cancerceller. p53 og calcium er kendt for at fungere i synergi, men der ikke er etableret direkte forbindelse mellem p53 aktivering og p53-afhængig regulering af calcium signalering på cellulært, biokemisk eller molekylært niveau. I visse rapporter Ca

2 + induceret signaler som Ca

2 + -aktiverede RAF /MEK /ERK veje medieret p53-uafhængig apoptose [7]. Det er også forudsagt, at p53 arbejder tæt relation med cellulære calcium signalering, da intracellulær calcium release spiller en vigtig rolle i at fremkalde Bd-2, ROS og mitokondrie vej af apoptose [8]. Imidlertid ingen molekylær mekanisme eller vej for p53-medited regulering af intracellulær calcium frigivelse kendt.

I denne undersøgelse har vi vist, at den cellulære calcium signalering og intracellulært calcium frigivelse er under transkriptionel kontrol af p53-protein. p53 transkriptionelt regulerer en hidtil ukendt calciumkanal TRPC6 ved direkte binding til en 22 basepar p53-RE nuværende 400 basepar opstrøms for en transskriptionsstartstedet (TSS) ved TRPC6 promotoren. Vi observerede, GaQ

3 inducerer apoptose via p53-afhængig opregulering af TRPC6 genet i cancerceller med wt p53. Over-ekspression af TRPC6 resulterer i signifikant apoptose i cancerceller. Yderligere TRPC6 ekspression initierer en calcium-afhængig regulering af ekspressionen af ​​gener involveret i apoptose.

Materialer og metoder Salg

Cellekultur

MCF-7, U2OS, HCT, A -431, PC3 og H1299 celler blev opnået fra Nationalt Center for Cell Science, Pune (Indien) og blev opretholdt i DMEM-medium. Cellerne blev dyrket som monolag i DMEM-medium suppleret med 10% (vol /vol) varmeinaktiveret føtalt bovint serum og antibiotika og inkuberet ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO

2 Alle transfektionerne blev udført under anvendelse Effectene transfektionsreagens (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. For tidsforløbsanalyse 5 petriskåle for hvert tidspunkt blev anvendt.

Plasmider og reagenser

p53-TRPC6 fuldlængde-promotor, p53-TRPC6 minimale promotor og p53-TRPC6 mutant minimal promotor blev klonet i pGL3 luciferase vektor. p53 si-RNA blev også anvendt som tidligere beskrevet af [9] – [11].

Assay for Ca

2 + mobilisering

Ca

2+ blev målt under anvendelse af celle permeable Ca

2+ fluorescensfarvestof Fluo- 3 acetoxymethyl ester. Hvor det er angivet, blev BAPTA acetoxymethylester (10 uM) tilsættes til dyrkningsmediet for celler i 10 cm plast vævsdyrkningsplader for en 1-timers udsættelse inden pålæsningen procedure med Fluo-3 acetoxymethylester. Mediet blev fjernet fra vævskulturplader og erstattet med 4 pM Fluo-3 acetoxymethylester fortyndet i Krebs-Ringer-buffer (KRB) (10 mM D-glucose, 120 mM NaCl, 4,5 mM KCI, 0,7 mM Na2HPO4, 1,5 mM NaH2PO4 og 0,5 mM MgCl2 (pH 7,4 ved 37 ° C)) (Sigma) i 20 min. Skålene blev vasket en gang med 5 ml KRB at fjerne det resterende farvestof. Cellerne blev høstet ved trypsinisering, vasket i 5 ml Ca

2+ frit PBS ved 37 ° C, pelleteret ved centrifugering, resuspenderet i 1 ml Ca

2+ frit PBS ved 37 ° C, og analyseres straks for Fluo-3 fluorescensintensitet ved flow-cytometri.

der henvises til fil S1 komplet beskrivelse af materialer og metoder.

Resultater

GaQ

3 inducerer TRPC6 genekspression i cancerceller med vildtype p53

Vi havde tidligere observeret, at GaQ

3 inducerer høj intracellulær calcium release selektivt i kræftceller med vildtype p53 protein [6]. Silencing af p53-genet ved anvendelse p53 SiRNA og inhibering af p53 transkriptionel aktivitet under anvendelse pifithrin-α både afskaffede GaQ

3-induceret stigning i intracellulært calcium release [6]. Disse data antydede, at intracellulær stigning i calciumniveauer i cancerceller blev reguleret af p53 og var afhængig af p53 transkriptionel aktivitet. Men den er involveret i reguleringen af ​​dette observerede fænomen mekanisme er ukendt [6]. Da GaQ

3-inducerede signifikant stigning i calciumoptaget anvendelse qPCR analyserede vi ekspressionen af ​​et stort antal kendte calciumkanaler i GaQ

3-behandlede MCF-7-celler. Vi observerede signifikant høj ekspression af TRPC6 genet i GaQ

3-behandlede celler. Siden udtryk for TRPC6 calcium kanal var høj, vi spurgte, om TRPC6 kan være involveret i stigningen i de cellulære calcium niveauer i GaQ

3-behandlede cancerceller. Ekspressionen af ​​TRPC6 mRNA og protein blev observeret i GaQ

3-behandlede MCF-7, H1299 og PC3-celler (figur 1 A). Den qPCR-analyse viser, at TRPC6 mRNA blev øget væsentligt i GaQ

3-behandlede MCF-7 (p53 Wt) celler (figur 1A). Stigningen i p53 mRNA niveau blev ikke observeret i H1299 (p53 null) og PC3 (p53 mut) celler (Bars 3-6, figur 1A). Tilsvarende p53-protein-niveau blev analyseret i de ovennævnte cancerceller og kun MCF-7 udviste signifikant stigning i p53-protein niveau upon GaQ behandling

3 (figur 1A). Disse data antydede, at p53 spillet vigtig rolle i GaQ

3-medieret opregulering af TRPC6. Yderligere relationen mellem p53-ekspression og TRPC6 ekspression observeres. Tidsforløbet analyse af TRPC6 mRNA-niveau (real-time PCR) i GaQ

3-behandlede MCF-7, H1299 og PC3-celler viser, at TRPC6 mRNA var signifikant høj i p53 (+ /+) MCF-7-celler ( Figur 1B sort linje). Time-kursus analyse viser, at GaQ

3 inducerer ekspression af TRPC6 inden 6 timer af sin inkubation og TRPC6 udtryk stiger fra 6

th til 24

th HR i et lignende mønster, hvor p53 udtryk stigning i GaQ

3-behandlede celler [6] Dommeren nu placeret. Disse data tyder på, at p53 og TRPC6 viser tidsmæssig relation i deres mRNA-ekspression profilering. Den direkte rolle af p53 i ekspressionen af ​​TRPC6 i GaQ

3-behandlede MCF-7-celler observeres ved silencing p53-gen i GaQ

3-behandlede MCF-7-celler (figur 1C). Resultaterne viser, at TRPC6 proteinekspression var signifikant høj upon GaQ

3 behandling (bane 2); men dette GaQ

3-induceret stigning i TRPC6 blev fuldstændig vendt på p53 silencing (bane 3). Disse data antyder, at p53 har en vigtig rolle i reguleringen af ​​TRPC6 genet. Vi analyserede yderligere effektiviteten af ​​TRPC6 siRNA og TRPC6 cDNA (2 uM) i MCF-7-celler.

A) Virkningen af ​​GaQ

3 ved ekspressionen af ​​TRPC6 mRNA i p53 (+ /+) MCF-7, p53 (- /-) H1299 og p53 (mt /mt) PC3-celler observeres ved anvendelse qPCR. Resultater viser, at GaQ

3 kan inducere opregulering af TRPC6 kun i MCF-7-celler med wt p53 (bane 2). Tilsvarende GaQ

3 kan inducere ekspressionen af ​​TRPC6 protein kun i MCF-7-celler (n = 5). B) Real-time PCR viser tidsforløbet analyse af TRPC6 mRNA-ekspression i GaQ3-behandlede MCF-7 (sort linje), H1299 (grøn linje) og PC3 (rød linje) celler. Resultater viser, at TRPC6 mRNA kun er opreguleret i MCF-7-celler og ikke i H1299 og PC3-celler. Endvidere er stigningen i TRPC6 mRNA observeret på 6

th hr af GaQ3 inkubation. Stigningen i TRPC6 mRNA tidsmæssigt relateret med stigningen i p53 mRNA i GaQ3-behandlede MCF-7 celler (* (rød) repræsenterer signifikant forskel i resultaterne mellem rød, grøn og sort linje på 9

th hr tidspunkt , p 0,028), n = 5, Anova, fejl søjler repræsenterer SD). C) rolle p53 i GaQ

3-induceret opregulering af TRPC6 overholdes. p53 gene silencing hjælp p53 siRNA i GaQ

3-behandlede celler vende stigningen i TRPC6 proteinniveau (bane 3) (* (rød) repræsenterer signifikant forskel i resultaterne mellem bane 1 og 2., s 0,036 og bane 2 3, s 0,042). Effektiviteten af ​​TRPC6 siRNA og TRPC6 cDNA er vist i bane 4 og 5.

p53 transkriptionelt aktiverer TRPC6 promotor

TRPC6 (kromosom 11q22.1, omvendt streng) og p53 viste tidsmæssige relationer i deres udtryk profil i GaQ

3-behandlede cancerceller, derfor var det interessant at definere den rolle af p53 i reguleringen af ​​TRPC6. Den TRPC6 promotorregionen blev identificeret som 650 bp DNA-sekvens opstrøms for en transkriptionsstartstedet, ved hjælp matrix kampe bestemt ved Mat inspektør (Genomatix). TRPC6 promotoren blev givet locus ID GXP_193240 af Mat inspektør. Denne region ligger mellem regionerne 101,374,672-101,375,321 (TSS ref punkt repræsenteret ved Mat Inspector er 101.374.772) og er repræsenteret ved ENST00000527240 og AK027769. Bioinformatik analyse af TRPC6 promotoren under anvendelse Mat inspektør modul genomatix database viste formodede p53 DNA bindingssted (matrix sim; score 0,9) (figur 2A) tyder på, at p53 kunne være en potentiel TRPC6 regulator. For at etablere denne, vi klonede en 0,65 kb formodet TRPC6 promotor bærer p53 respons element (p53RE) i en pGL3 grundlæggende vektor til at generere pTRPC6p-luc1. Den pTRPC6p-luc1 blev transficeret i ubehandlet og GaQ

3-behandlede MCF-7, H1299 og PC3 celler. GaQ

3 behandling induceret 5-fold stigning i TRPC6 promotoraktivitet i MCF-7-celler i sammenligning med de ubehandlede celler (figur 2B; bar 2 og 3). Stigningen i TRPC6 promotor-aktivitet var p53-afhængig, da p53 gendæmpning hjælp p53 siRNA vendt GaQ

3-inducerede stigning i TRPC6 promotor-aktivitet. GaQ

3-behandling var ikke i stand til at inducere TRPC6 promotoraktivitet i H1299 og PC3-celler (bar 5, 6, 8 9). TRPC6 promotoren blev aktiveret i GaQ

3-behandlede H1299 celler, som blev transficeret med p53-cDNA (bar 7). Disse data viste, at TRPC6 blev reguleret af p53 i GaQ

3-behandlede celler. For yderligere at bekræfte rolle p53RE i p53-medieret regulering af TRPC6 promotoren, blev regionen mellem basepar -74 til -99 (med henvisning til TSS seq (101.374.772) i TRPC6 promotoren bærer p53RE klonet ind i en pGL3-vektor til generere minimal pTRPC6p-luc2. denne TRPC6 minimal promotor blev induceret ved GaQ3-behandling i MCF-7-celler og p53 silencing afskaffet den forhøjede promotoraktiviteten (figur 2C, bar 2-4). for at fastslå den rolle, nyligt identificerede p53RE i p53-medieret regulering af TRPC6 gen blev p53RE sekvens muteret og klonet i pGL3 vektor for at generere mutant minimal mmpTRPC63p-luc2. Transfektion af mmpTRPC63p-luc2 i GaQ

3-behandlede MCF-7, PC3 og H1299-celler viste ingen stigning i TRPC6 promotoraktivitet (figur 2D). Disse data fastslår, at p53 transkriptionelt regulerer TRPC6 i GaQ

3-behandlede cancerceller.

A) En formodet p53 bindingssted er observeret i den TRPC6 promotoren under anvendelse Genomatix, Matlnspector modul. TRPC6-p53RE ligger mellem -422 til -400 bp på 0,6 kb TRPC6 promotor. DNA seq af TRPC6 promotor sammen med placeringen af ​​p53 RE (vist med rødt) er skematisk repræsenteret. B) pTRPC6p-luc1 (TRPC6 0,6 kb-promotor-luciferase-konstruktion) transficeres i GaQ

3-behandlede MCF-7-celler og virkning af p53 på luciferaseaktivitet måles. GaQ

3-induceret p53 genaktivering inducerer 8 gange stigning i pTRPC6p-luc1 luciferaseaktivitet (bar 3). p53-gen silencing hjælp p53 siRNA vender denne effekt og TRPC6 promoter aktivering afskaffes (bar 4). Transfektion af pTRPC6p-luc1 i H1299 og PC3 celler i fravær eller tilstedeværelse af GaQ

3 har ingen effekt på aktiviteten af ​​TRPC6 promotor. Ved exogen tilsætning af vildtype p53 cDNA i GaQ

3-behandlede H1299 celler TRPC6 promotoren viser 9-gange stigning i luciferaseaktivitet (bar 7). Disse data viser, at p53 regulerer TRPC6 promotor transkriptionelt. (C) pTRPC63p-luc2, den TRPC6-p53RE (-422 til -400) klonet i luciferase vektor transficeres i GaQ

3-behandlede MCF-7-celler. Resultater viser, at p53 inducerer en 6-fold forøgelse i TRPC6-p53RE luciferaseaktivitet (bar 3). p53 gene silencing hjælp p53 siRNA afskaffer stigning i luciferaseaktivitet (bar 4). Stigningen i TRPC6 promotor-aktivitet er fraværende i H1299 og PC3 celler. Dataene viser, at p53 regulerer TRPC6 promotor via TRPC6-p53RE. (D) Den mmpTRPC6p-luc2 konstruere med muteret sekvens af TRPC6-p53RE transficeres i GaQ

3-behandlede MCF-7 celler. er ikke observeret nogen stigning i luciferaseaktiviteten, der viser specificitet TRPC6-p53RE. For figur 2b-2d, (* (rød) repræsenterer signifikant forskel i resultaterne alle værdier p 0,05), n = 7, Anova, fejl søjler repræsenterer SD)

WT p53 direkte binder sig til. responselementet ved TRPC6 promotoren

bindingen af ​​p53 ved 22 basepar region i TRPC6 promotoren blev analyseret under

in vitro Salg betingelser under anvendelse EMSA (figur 3A). Dataene viste binding af p53 ved TRPC6-p53-RE sekvens som et klart skift og super-shift af komplekset blev observeret (bane 2). Bindingen mellem p53 og responselementet derfor blev tabt efter varmedenaturering p53-protein (bane 3). Bindingen mellem p53 og responselementet derfor var meget specifikt, da mutation af 22 basepar p53 RE sekvens afskaffede binding mellem p53 og dets RE (bane 5-8). Bindingen mellem p53 og responselementet derfor på p21 5′-promotoren element tjener som positiv kontrol (bane 9-12). For yderligere at definere den rolle, TRPC6-p53RE i p53-medieret TRPC6 induktion under

in vivo

betingelser, vi udførte kromatin immunofældning (chip) analyser i GaQ

3-behandlede MCF-7 celler. I overensstemmelse med luciferase resultater, vi har registreret en specifik PCR-produkt afledt TRPC6-p53RE (figur 3B, øverste panel). Input tjener som kontrol, i mangel af GaQ

3 behandling p53 viste ingen binding til p53RE på TRPC6 promotor. Ved behandling af MCF-7-celler med GaQ

3, viser p53 binding til dets RE på TRPC6 promotoren, PCR med scrambled primere tjener som negativ kontrol. På den anden side ingen binding mellem p53 og p53RE på TRPC6 promotoren observeres i H1299 og PC3-celler (figur 3B, nedre panel). Disse resultater godtgjort, at TRPC6-p53RE var ansvarlig for p53-medieret induktion af TRPC6 promotor-aktivitet, og at p53 transkriptionelt inducerer TRPC6 gennem promotor bindende i GaQ

3-behandlede celler. Da GaQ

3 inducerer en eksponentiel stigning i den intracellulære calcium udgivelse i kræftceller med Wt p53 og p53 er nu vist transkriptionelt regulere calcium kanal TRPC6 i GaQ

3-behandlede celler, rolle TRPC6 i p53-medieret calciumfrigivelse observeres. Flow-cytometri af den intracellulære calcium frigivelse viser, at GaQ

3 behandling inducerer en eksponentiel stigning i frigivelsen af ​​intracellulær calcium på 8

th hr sin inkubation (figur 3D, rød linje), når lyddæmpende TRPC6 gen hjælp TRPC6 siRNA vi observeret, at 8 timers eksponentiel stigning i de intracellulære calcium niveauer blev vendt og stigningen i calcium niveauer blev lineær som tidligere observeret i p53 null (H1299) og p53 mutant (PC3) celler. Disse data viser, at GaQ

3-induceret og p53-medieret stigning i intracellulært calcium frigivelse skyldes p53-afhængige transkriptionelle opregulering af TRPC6 protein i de behandlede cancerceller.

A) EMSA udføres for at undersøge bindingen mellem p53 og dens reaktion element ved TRPC6 promotor under

in vitro

betingelser. Et skift og en super-shift af p53, p53AB og p53-RE er observeret i bane 2. Bindingen mellem p53 og dens RE er tabt efter en mutant p53 RE sekvens bruges til EMSA, der viser høj specificitet af denne interaktion ( bane 6), Binding mellem p53 og dets kendte p215’RE anvendes som en kontrol (bane 9-12). (B) kromatin immunofældning udføres i GaQ

3-behandlede MCF-7-celler for at bekræfte

in vivo

binding af p53 til p53RE på TRPC6 promotoren. p53 viser positiv TRPC6-p53RE bindende udelukkende GaQ

3-behandlede celler. Input tjener blev anvendt som positiv kontrol og scrambled primere til PCR som negativ kontrol (n = 5). (C) Bindingen mellem TRPC6 og p53 RE observeres ikke i H1299 og PC3-celler, selv i nærvær af GaQ

3 (n = 5). (D) Tidsforløb analyse af intracellulær calcium frigivelse observeres i GaQ

3-behandlede MCF-7 celler (rød linje) og GaQ

3-behandlede MCF-7 celler, hvor TRPC6 gen tavshed ved hjælp TRPC6 siRNA ( sort linje). Resultaterne viser, at GaQ

3 inducerer den kraftige stigning i den intracellulære calcium frigivelse i p53 (+ /+) MCF-7 celler med 6

th hr sin inkubation. Den lyddæmpning af TRPC6 afskaffer denne 6

th hr stigning i den intracellulære calcium frigivelse (* (rød) repræsenterer signifikant forskel i resultaterne mellem rød og sort linje på 8

th hr tidspunkt, s 0,029) , n = 5, Anova, fejl søjler repræsenterer SD).

TRPC6 inducerer calcium-afhængig apoptose i cancerceller

Vi analyserede den fysiologiske relevans af denne p53-afhængig regulering af yderligere TRPC6 udtryk og de intracellulære calcium. Da p53 er en central aktør i styrende cellulære apoptotiske strategier i kræftceller. Vi antager, at p53-afhængig ekspression af TRPC6 kan være en anden cellulær vej, hvorigennem p53 kan inducere apoptose i cancerceller. Således den virkning TRPC6 ekspression på cellulært apoptose blev analyseret i p53 vildtypeceller (MCF-7, U2OS, HCT p53 (+ /+)), p53 mutantceller (A-43, PC3) og p53 null (H1299) celler . Disse cellelinier blev ektopisk udtrykt med TRPC6 cDNA (figur 4a) og det cellulære apoptose blev sammenlignet med kontrolgruppen (un-transficerede celler) celler under anvendelse af annexin-V-farvning og flowcytometri. Resultaterne viste en signifikant stigning i den apoptotiske fraktion af TRPC6 overudtrykkende cancerceller, uanset status for p53-genet. Næste observerede vi rollen af ​​intracellulær calcium i TRPC6-medieret apoptose ved bratkøling intracellulært calcium frigivelse via TMB-8. Resultaterne viste, at quenching af den intracellulære calcium-frigivelse via TMB-8 afskaffet TRPC6-medieret apoptose i cancerceller. Disse data antydede, at TRPC6-afhængig stigning i intracellulær calcium frigivelse var afgørende for apoptose, således p53-afhængig stigning i TRPC6 ekspression i cancerceller kan være en strategi til at inducere apoptose via calcium-medierede pathways. Dette kan være en anden cellulær pathway vedtaget af p53 til at fremkalde den apoptotiske respons og funktion som den primære tumor suppressor molekyle i cancerceller. Disse data etablerer TRPC6 som en potentiel apoptotisk protein, der i fremtiden kan sow potentiale til at fungere som et anti-cancer-gen-terapi-molekyle. For at forstå TRPC6-induceret apoptose i detaljer observerede vi aktiveringen og undertrykkelse af en nøgle sæt af 84 gener (SA-Bio videnskaber, PAHS012) involveret i både induktion og hæmning af apoptose. MRNA-ekspression analyse af disse gener blev udført i p53 vildtypeceller (MCF-7, U2OS, HCT p53 (+ /+)), p53 mutantceller (A-43, PC3) og p53 null (H1299) celler (figur 4b). I den eksperimentelle oprettet blev disse celler overudtrykt med den apoptotiske TRPC6 cDNA. Resultaterne var konsistente i alle cellelinier og viste, at TRPC6 overekspression resulterede i nedregulering af de involveret i inhibering af apoptose gener og opreguleres de gener involveret i at inducere cellulær apoptose (figur 4b (bane 1, 5, 7, 8, 11 12)). Interessant, ved ektopisk ekspression af TRPC6 cDNA i cancerceller, hvor intracellulært calcium blev standset via TMB-8 behandling blev genekspression mønster ændres, og udtrykkene for de involveret i cellulær apoptose gener var konsekvent lav (figur 4b (bane 17, 18 , 19, 20, 22 24)). Behandling med doxorubicin, anvendt som positiv kontrol, resulterede i opregulering af gener involveret i apoptose (figur 4b (bane 2, 3, 4, 6, 9 10)). Ubehandlede cancerceller tjener som kontroller (figur 4b (bane 13, 14, 15, 16, 21 23)). Disse data antyder, at TRPC6 inducerer apoptose via forhøjelse af intracellulære calciumniveauer og gennem denne vej det ændrer ekspressionen af ​​gener involveret i apoptose, hvilket tyder på, at TRPC6 er en potentiel kandidat til pro-apoptotiske anticancerstrategier. Denne hidtil ukendte molekylære pathway hvorigennem p53 efter aktivering af GaQ

3 transkriptionelt regulerer ekspressionen af ​​pro-apoptotiske TRPC6 calcium kanal, som igen påfører calcium-medieret apoptose er en interessant strategi, som p53 kan fungere som en tumorsuppressor. Yderligere denne vej kan udnyttes til at opnå anti-cancer fordele i fremtiden.

A) Virkningen af ​​TRPC6 over-ekspression observeret ved cellulær apoptose i p53 vildtypeceller (MCF-7, U2OS, HCT p53 (+ /+)), p53 mutant celler (A-431, PC3) og p53 nul-celler (H1299) ved hjælp af annexin-V farvning og strømmen-cytometri. Signifikant stigning i apoptotisk del af TRPC6 over-udtrykkende celler ses uafhængigt af p53-genet status. Intracellulært calcium quenching via TMB-8 afskaffer TRPC6-medieret apoptose; ubehandlede celler tjener som negativ kontrol, doxorubicin tjener som positiv kontrol (* repræsenterer signifikant forskel mellem TRPC6-behandlede celler og TRPC6-behandlede og TMB-8-behandlede celler; alle p-værdier 0,05, n = 7; S.A., ANOVA). (B) TRPC6 inducerer ekspression af apoptotiske gener i cancerceller. PCR-gen array til gener involveret i regulering af cellulær apoptose foregår i TRPC6 cDNA transficerede p53 vildtypeceller (MCF-7, U2OS, HCT p53 (+ /+)), p53 mutantceller (A-431, PC3) og p53 nul-celler (H1299) celler. Over-ekspression af TRPC6 resulterer i nedregulering af gener inhiberer apoptose og opregulering af pro-apoptotiske gener (bane 1, 5, 7, 8, 11 12). Intracellulært calcium quenching i TRPC6 overudtrykker celle resulterer i inhibering af apoptotiske gens og stigning i ekspressionen af ​​anti-apoptotiske gener (bane 17, 18, 19, 20, 22 24). Ubehandlede celler tjener også som kontroller (bane 13, 14, 15, 16, 21 23); doxorubicin behandling tjener som positiv kontrol, som fører til opregulering af gener involveret i apoptose (bane 2, 3, 4, 6, 9 10). (n = 10)

Diskussion

i denne forskning arbejde, vi har vist, at den intracellulære calcium-frigivelse er under transskriptionen kontrol af p53 tumor suppressor, via p53-afhængig transkriptionel regulering af TRPC6 genet. Genom bred analyse af p53-bindingssteder i promotorregionerne af calciumkanaler viste tilstedeværelsen af ​​p53 RE i TRPC6 genet. Vi har vist, at GaQ3 inducerer ekspression af TRPC6 kun i cancerceller med vildtype p53 og p53 gendæmpning vender GaQ3-inducerede stigning i TRPC6 ekspression. Disse data fastslår også, at TRPC6 er en direkte transkriptionel mål af p53 og p53 binder sig til sit svar element i TRPC6 promotor. Vi har fundet p53 bindingssted i 0,6 Kb TRPC6 genpromotor, der ligger 400 basepar opstrøms for en transkriptionsstartstedet. Den pludselige stigning i intracellulært calcium frigivelse og calcium-medieret cellulær apoptose i GaQ

3-behandlede cancerceller skyldes p53-afhængig transskriptionel aktivering af TRPC6 genet. I denne forskning har vi vist en direkte sammenhæng mellem p53 transkriptionel evne og calcium signalering.

Forståelse relationen mellem calcium signalering og p53 er vigtig i cancer perspektiv da begge disse faktorer regulerer cellevækst, differentiering, aldring , proliferation ved fysiologiske, cellulære og molekylære niveau [12], [13]. I forbi en Ca

2 + -permeable trpC kanal har vist sig at deltage i en bred vifte af cellulære funktioner ved at regulere intracellulære Ca

2 + signalering [14]. TRPC6-medieret Ca

2+ signalering aktiverer celle-proliferation genet som calmodulin-afhængig proteinkinase og mitogenaktiveret proteinkinase [15]. Rolle TRPC6 i vækst og udvikling af kræft er ikke klar; dog flere mekanismer er involveret i TRPC6 kanal aktivering og regulering i kræftceller. De fysiologiske og cellulære faktorer involveret i cancer sygdomsprogression vides også at regulere den cellulære TRPC6 ekspression [16] – [20]. De cellulære faktorer som membran receptoraktivering via TFN-α og cellulær Ca

2+ butik udtømning involveret i cancer progression har været kendt for at inducere TRPC6 ekspression [16] – [20]. For nylig observeres rolle en vigtig signalmolekyle ROS i TRPC6 aktivering [18]. Da ROS er involveret i både kræft progression og dens regulering, og dermed er det vigtigt at identificere den rolle TRPC6 protein i kræftsygdommen udvikling eller regulering. Nylige undersøgelser har vist, at adskillige pro-apoptotiske faktorer, herunder medlemmer af Bcl-2-familien proteiner og reaktive oxygenarter (ROS) regulerer Ca

2+ følsomhed af både Ca

2 + frigivelse kanaler i ER og mitokondrier [21]. Yderligere ingen data vedrørende forholdet mellem tumor suppressor p53 og regulering af calcium signalering transkriptionel regulering af TRPC6 gen i cancerceller er til rådighed. Det er vigtigt at identificere forholdet mellem p53 og dens kontrol af det intracellulære calcium frigivelse og den rolle, som TRPC6 gen spiller i GaQ

3-behandlede cancerceller. P53 og TRPC6 induceret da ændringer i de cytosoliske koncentrationer af Ca

2+ kan fremkalde signalveje, der regulerer en bred vifte af cellulære begivenheder, herunder dem vigtige i tumorigenese [21].

Yderligere en ny relation mellem den intracellulære Ca

2+ frigivelse og p53 iagttoges hvor Ca

2+ frigivelse stabiliserede bindingen af ​​p53 til dens transkriptionelle co-aktivator p300 og også stabiliserede bindingen af ​​p53-p300 transkriptionel komplekset til p53-DNA bindende site på p53-minimal promotor [22]. I denne forskning har vi belyst tilstedeværelsen af ​​et cellulært krydstale mellem p53 og calcium-signalering, hvor calcium signalering aktiverer p53 transkriptionelt [6] og den aktive p53 forøge den intracellulære calcium-frigivelse ved transkriptionelt regulere promotoren for TRPC6 genet. Således calcium-afhængig apoptose kan være medieret af p53 og calcium signalering kan spille en afgørende rolle i p53-medieret apoptose. Senest TRPC6 genet har vist afgørende rolle i patologisk hjertehypertrofi og remodellering som reaktion på stress [23], [24]. Deletion af TRPC6 forhindrer stressinduceret overdrevet cardiac remodeling og overekspression af TRPC6 udvikle spontan hjertehypertrofi i musemodel, hvilket tyder i retning af en mulig forbindelse mellem TRPC6 ekspression og celledød og division, da kardial remodellering indebærer begge disse processer. TRPC6 ekspression vides også at inducere podocyte cytoskeletal remodeling [25], human keratinocytdifferentiering [26], og hippocampus neuron differentiering [27]. En vigtig rolle for TRPC6 er også blevet opdaget i sårheling, hvor et genom-wide screen identificeret TRPC6 vigtigt for myofibroblastdifferentiering transformation og TRPC6 gen-slettede mus viste forringet dermal og hjerte sårheling efter skade. De tidligere rapporter tyder i retning af en sammenhæng mellem TRPC6 udtryk og regulering af celle-division og celle-død relaterede processer, i denne betænkning, vi antyder en stærk rolle TRPC6 som p53-reguleret pro-apoptotisk protein i kræft model. Afslutningsvis her har vi belyst en hidtil ukendt rolle TRPC6 calciumkanal at fungere som en p53 nedstrømseffektor protein, som inducerer apoptose ved at regulere cellulære calciumniveauer i cancerceller. Denne vej synes at være en strategi, som p53 protein til at udnytte calcium signalering som en effektiv pro-apoptotisk anti-cancer mener med transkriptionelt regulere TRPC6 calcium kanal, og dermed bruge TRPC6 som en mulig mekanisme til at fungere som en tumor suppressor.

Støtte Information

File S1.

Supplerende materiale og metoder

doi:. 10,1371 /journal.pone.0071016.s001

(DOC)