PLoS ONE: A Novel Cellular Ældning Gene, Senex, er involveret i perifert Regulatory T Cells Ophobning i Aged Urinary Blære Cancer

Abstrakt

Regulatory T-celler (tregs) spiller en afgørende rolle for bevarelsen selv-tolerance og immun homøostase. Trods mange undersøgelser om sammenhængen mellem tregs akkumulation og alder, eller maligniteter, den relaterede mekanisme er ikke blevet godt undersøgt. For at finde ud den mekanisme af tregs ophobning i alderen urin blærekræft, undersøgte vi romanen cellulære degeneration gen

Senex

og relevant apoptose gen mRNA-ekspression i sorteres CD4 + CD25

hi tregs fra alderen UBC donorer, evalueres serum cytokin profiler relateret til tumor immunopatologi, og nærmere forholdet mellem

Senex

udtryk, apoptose genekspression og cytokin sekretion. Efter at have bragt til tavshed ned Senex genekspression med RNA-interferens, vi evalueret også den cellulære apoptose af tregs sorteret fra alderen UBC patienter som reaktion på H

2O

2-medieret stress. Vores data viste, at opreguleret

Senex

mRNA-ekspression i tregs af gamle UBC patienter blev korreleret med pro-apoptotisk genekspression og cytokin koncentration. Silencing

Senex

genekspression forøget cellulær apoptose og pro-apoptotiske genekspression af tregs, som svar på H

2O

2-medieret stress. Opreguleres

Senex

mRNA-ekspression sammen med nedsat pro-apoptotisk genekspression og uroligheder i cytokiner syntese kan bidrage til tregs spredning og fremme tumorgenese og metastase. Samlet set opregulering af cellulær ældning gen

Senex

, var forbundet til regulatoriske T-celler ophobning i alderen urinblære kræft. Vores undersøgelse giver en ny indsigt i forståelse af perifer tregs ophobning i alderen maligniteter

Henvisning:. Chen T, Wang H, Zhang Z, Li Q, Yan K, Tao Q, et al. (2014) A Novel Cellular Ældning Gene,

Senex

, er involveret i perifert Regulatory T Cells Ophobning i Aged Urinary blærekræft. PLoS ONE 9 (2): e87774. doi: 10,1371 /journal.pone.0087774

Redaktør: Pranela Rameshwar, Rutgers – New Jersey Medical School, USA

Modtaget: 3. september 2013; Accepteret: December 30, 2013; Publiceret: 5 feb 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Vare nr 81.141.104, No. 81.272.259), og Natural Science Foundation of Anhui provinsen (Item No.11010402168). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion Salg

regulatoriske T-celler (tregs) spiller en afgørende rolle for bevarelsen selvtolerance og immun homøostase ved at undertrykke en lang række fysiologiske og patologiske immunresponser mod selv og ikke-selv, såvel som kvasi-selv tumorantigener [1 ], [2]. Rekrutteret til tumorvæv, tregs udvide og blive aktiveret i tumorvæv og i de drænende lymfeknuder, undertrykke antitumor immunresponser [3]. Det konstateres, at perifert blod CD4 + CD25 + tregs akkumulere dramatisk hos raske ældre mennesker og gnavere [4] – [5]. Stigningen i tregs forhold bidrager til aldersrelateret immun-suppression, øger modtageligheden for infektionssygdomme og cancer [6]. Endvidere har øget antallet af tregs blevet observeret hos patienter med urin blærekræft (UBC), med tumor udtryk for foxp3, en specifikke tregs markør, korreleret med klinisk prognose [7]. Intratumoral ophobning af tregs er også observeret i kolorektal cancer, gliomer og hepatocellulært carcinom [8] – [10]. Undertrykkelse af anti-tumorrespons, findes dette akkumulerede intratumorale tregs at være relateret til dårlig prognose [8] – [10]. På trods af alle de ovennævnte forskning bestræbelser, de detaljerede mekanismer er ikke blevet godt belyst. En nylig undersøgelse nærmer tregs ophobning fra et nyt perspektiv, rapporterer, at cellulær apoptose er involveret i tregs akkumulering i aldringsprocessen. Efter 24 i kultur, tregs fra gamle dyr døde signifikant mindre i løbet af dette assay end gjorde tregs fra unge mus, hvilket antyder, at tregs fra ældre mus er mere resistente over for apoptose [11]. Men mekanismerne bag deres modstand mod apoptose i alderen mennesker, især hos patienter i alderen kræft endnu at blive udforsket.

Nylige undersøgelser har vist, at opreguleret cellulær degeneration kan bidrage til apoptose modstand ældede humane celler. En undersøgelse har gjort identifikationen af ​​et nyt gen,

Senex

, der regulerer stress induceret tidlig ældning veje (SIPS) i endotelceller (ECS) [12]. Interessant, disse aldrende celler induceret af

Senex

er resistente over for tumornekrosefaktor (TNF-α) inducerede apoptose [12]. Desuden under visse omstændigheder, nogle aldrende celler kunne endda ændre deres fænotyper i modsatte slægter. Ny mekanisme afslører, at humane tregs kunne inducere senescens men ikke apoptose i responder naive og effektor T-celler [13]. Disse ældede responder-T-celler induceret af tregs ændre deres fænotyper og cytokinprofiler, og har kraftig undertrykkende funktion. Stor opmærksomhed er for nylig blevet betalt til cellulær aldring, men den potentielle rolle for ældning genekspression i patienter i alderen cancer involveret i tregs ophobning forbliver stort set ukendt.

For at analysere potentielle bidrag ældning og apoptose genekspression til perifer tregs ophobning i alderen maligniteter, vi først sorteres CD4 + CD25

hi tregs i alderen UBC patienter, og derefter undersøgte transkriptionelle niveauer af relevante gen mRNA-ekspression i sorteres CD4 + CD25

hi tregs. Desuden blev serum cytokin profiler relateret til tumor immunopatologi vurderet som indirekte vurdering af T-celle funktion. Vi vurderede også forholdet mellem ældning gen

Senex

mRNA-ekspression og cytokin sekretion. Så vi vurderet den cellulære apoptose af kortfristede dyrkede tregs fra alderen UBC patienter som reaktion på H

2O

2-medieret stress efter

Senex

genekspression blev stille med RNA-interferens. Vore data beviser for, at opreguleres

Senex

mRNA-ekspression i tregs af gamle UBC patienter blev korreleret med cytokin koncentration og pro-apoptotisk genekspression. Silencing

Senex

genekspression forøget cellulær apoptose og pro-apoptotisk genekspression i kortsigtet dyrket tregs, som svar på H

2O

2-medieret stress. Opreguleres

Senex

mRNA-ekspression sammen med nedsat pro-apoptotisk genekspression og uroligheder i cytokiner syntese kan forklare udbredelsen af ​​tregs og fremme tumorgenese og metastase. Afslutningsvis vores undersøgelse giver et nyt indblik i forståelsen af ​​perifer tregs ophobning i alderen maligniteter.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle deltagere underskrevet en erklæring om skriftligt informeret samtykke. De er beskrevet i denne undersøgelse Reglerne blev godkendt af den etiske komité af Anden Hospital i Anhui Medical University.

Patienter og raske donorer

Perifert blod (PB) prøver fra 38 alderen UBC patienter (62 til 79 år, gennemsnitsalder 70,13), 34 alderen raske kontrolpersoner (60 til 74 år gamle, gennemsnitsalder 68,72) og 37 unge raske kontroller (22 til 56 år, gennemsnitsalder 43,25) blev undersøgt ved Second Hospital i Anhui Medical University 2010-2013. Ingen af ​​patienterne modtog anticancerterapi før bliver indskrevet. Samstemmende autoimmun sygdom, blev humant immundefektvirus (HIV) og syfilis udelukket for alle tilmeldte individer. Klinisk iscenesættelse blev udført efter præoperativ radiologisk undersøgelse og ved kliniske parametre i forbindelse med patologisk undersøgelse af transuretral resektion prøver i henhold til TNM klassifikation af 1997 (Union Internationale Contre le Cancer).

Antistoffer og flowcytometri

følgende monoklonale antistoffer (mAb’er) specifikke for humane overfladeantigener blev købt fra Beckman Coulter-Immunotech (Marseille, Frankrig): phycoerythrin (PE) -konjugeret anti-CD4-antistoffer (13B8.2 klon); fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret anti-CD25 (B1.49.9 klon); Peridinin klorofyl Protein-Cychrome5.5 (PerCP-Cy5.5) konjugeret anti-CD127 (SK3 klon); tre farvereagens kit til tregs indeholdende af PE-konjugeret anti-CD4, FITC-konjugeret anti-CD25, og PerCP-Cy5.5-konjugeret anti-127 (UCHT1, 13B8.2 og B911 klon); og dens isotypekontrolantistof. BU-Annexin V-FITC Apoptose Detection Kit (Biouniquer Nanjing, Kina) blev anvendt til Treg cellulære apoptose vurdering. Celler blev analyseret og sorteret ved hjælp af Coulter Epics XL flowcytometer (FCM) med systemet II software og COULTER EPICS ALTRA HyPerSortTM System med expo 32 multicomp Software (Beckman Coulter, Miami, FL, USA).

Undersøgelse af perifert CD4 + CD25 + CD127

lave Cells

om 2-5 ml PB blev indsamlet. Alle prøver blev antikoaguleret med heparin og undersøges inden 4 timer. Ca. 100 pi anti-koaguleret blod blev inkuberet ved 25 ° C i 15 minutter med 5 ul FITC-konjugeret CD25-specifikke mAb, 5 ul PE-konjugeret CD4-specifikt mAb, 5 ul PerCP-Cy5.5-konjugeret anti-127 mAb og deres behørige isotypekontroller. Efter inkubation blev røde blodlegemer lyseret og vasket i PBS to gange. Farvede celler blev hurtigt detekteret ved anvendelse FCM og analyseret under anvendelse systemet II software. Som beskrevet tidligere [14], hyppigheden af ​​CD4 + CD25 + CD127

lave tregs blev udtrykt som en procentdel af CD4 + T-celler ved sekventiel gating på lymfocytter og CD4 + T-celler.

Isolering af CD4 + CD25

høje og CD4 + CD25- Celler

om 15-20 ml PB blev indsamlet til celle sortering. Perifere mononukleære blodceller (PBMC’er) blev isoleret ved densitetsgradientcentrifugering separation under anvendelse CAPPEL LSM lymfocyt separationsmedium (MP Biomedicals, Solon, OH). Isolerede PBMC’er blev vasket 3 gange med PBS. Omkring 1 × 10

7 PBMC’er var overflade farvet med PE-konjugeret anti-CD4 og FITC-konjugeret anti-CD25. Så CD4 + CD25

høje og CD4 + CD25- celler blev sorteret ved hjælp af portene på en Becton Counter flowcytometrisk celle-sorter (ALTRA HyPerSortTM System). Som vi tidligere beskrevet [15], konsekvent renhed 93% blev opnået for både CD4 + CD25

høj T-celle og CD4 + CD25-celle fraktioner

Cell Kultur og behandling

Flowcytometri sorteres CD4 + CD25high tregs og CD4 + CD25- Teffs blev udsået i 24-brønds plader (Wuxi Nest Biotechnology Co., Ltd, Wuxi, Kina), og dyrket i RPMI-1640 (HyClone), der indeholder 10% FBS ( Gibco) og antibiotika i 24 timer. Derefter blev cellerne behandlet med en subcytotoxic koncentrationer af H

2O

2 (100 pM) i 2 timer som en stress inducer. Alle celler blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære inkubator. Salg

SiRNA Transfektion Salg

Sorted CD4 + CD25

høje og CD4 + CD25- celler fra alderen UBC patienter og raske donorer blev transficeret med siRNA ved anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen) ifølge producentens protokoller. Slutkoncentrationen af ​​siRNA var 33 nM. De rækkehuse af siRNA målretning

Senex

mRNA (sekvenserne er anført i Tab 1) og kontrol siRNA (krypteret sekvens) blev syntetiseret af Invitrogen (Shanghai, Kina).

Undersøgelse af Cellular Apoptose

Flowcytometri sorteres CD4 + CD25

høje tregs og CD4 + CD25- Teffs blev farvet med Annexin V-fluoresceinisothiocyanat (Annexin V-FITC) og propidiumiodid (PI, Biouniquer, Nanjing, Kina) ifølge producentens instruktioner. Celler blev derefter inkuberet i 15 minutter i mørke inden de er blevet analyse på et flowcytometer (FACSCalibur, Becton Dickinson).

Real-time kvantitativ PCR-analyse

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse RNeasy Kit (Qiagen). cDNA blev syntetiseret med Superscript III (Invitrogen) revers transkriptase-syntese kit. Kvantitativ real time PCR blev udført på de 7000 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) under anvendelse af Mesagreen qPCR Master Mix Plus for SYBR Assay (Takara). De anvendte primere og deres sekvenser er anført i tabel 1.

serumcytokiner

Serumprøver fra UBC patienter og raske kontroller blev opsamlet. Koncentrationen af ​​IL-2, IL-10, IL-17, blev TNF-α og TGF-β bestemt under anvendelse enzymkoblet immunosorbent assay (ELISA) kit (eBioscience) ifølge producentens instruktioner.

Statistiske analyser

Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SPSS 15.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL). Statistisk signifikans af forskelle blev bestemt ved den ikke parametriske uparrede Mann-Whitney

U

-test og den parametriske Students

t

test for parrede eller uparrede prøver, når det er relevant. Korrelationer blev vurderet ved anvendelse af Pearsons koefficient test. Forskelle blev betragtet som signifikante for p-værdier mindre end 0,05.

Resultater og Diskussion

Markant Øget CD4 + CD25 + CD127

lav treg Frekvens og Transskription Factor foxp3 mRNA ekspression i Aged UBC Patienter

i betragtning af den kritiske rolle perifer tregs ophobning i alderen maligniteter, CD4 + CD25 + CD127

lav treg frekvens blev undersøgt i perifert blod af alderen UBC patienter i alderen raske kontrolpersoner og unge raske kontrolpersoner. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser, blev en stigning i treg frekvens observeret i både ældre UBC patienter og ældre raske kontrolpersoner, sammenlignet med unge raske kontroller. I mellemtiden tregs frekvens var signifikant højere hos ældre UBC patienter end hos ældre (Figur 1). Øget tregs frekvens bidrager til aldersrelateret immunsuppression, øger forekomsten af ​​infektion og cancer, og forårsager morbiditet og mortalitet hos ældre [4] – [6]. En undersøgelse viste en aldersafhængig defekte tumor clearance, som blev korreleret med tregs elevation [16]. Vigtigere, CD25-depletion førte til tumor clearance, hvilket antyder, at alderen tregs grænse antitumorimmunitet [16].

Treg frekvens blev påvist under anvendelse af flowcytometri. En øget CD4 + CD25 + 127

lav tregs frekvens (10,67 ± 0,58%) blev observeret i Aged UBC Patienter i forhold til Aged raske kontrolpersoner (7,14 ± 0,41%) og Young raske kontrolpersoner (5,09 ± 0,37%). Udtrykkes som gennemsnit ± SD blev data analyseret med den parametriske Students t-test. ▴ vs Young Sund Controls, P 0,05; △ vs. Aged raske kontrolpersoner, P. 0,05

transskription faktor foxp3 spiller en afgørende rolle i opretholdelsen af ​​selv-tolerance og høj foxp3 udtryk er nødvendig for undertrykkende funktion i humane CD4 + tregs [17] – [19]. I denne undersøgelse blev foxp3 mRNA-ekspression i både alderen UBC patienter og raske individer undersøgt. Som forventet, foxp3 mRNA-niveauer steget betydeligt i CD4 + CD25

hi tregs sorteret fra alderen UBC patienter og ældre raske kontrolpersoner, sammenlignet med unge raske kontroller. Der var imidlertid ingen signifikant forskel i foxp3 mRNA-ekspression mellem tregs fra ældede UBC patienter og ældre raske kontroller (figur 2). Forskellen mellem tregs frekvens og Foxp3 mRNA-ekspression kan have været forårsaget af funktionelle forskelle, som tidligere undersøgelser demostrated at foxp3 + T-celler i mennesker er funktionelt heterogene [1]. Opreguleres foxp3 mRNA-ekspression, sammen med den øgede tregs frekvens, kan øge tumorer undslippe, immunsuppression og føre til ineffektive tumor clearance i alderen UBC patienter.

tregs blev sorteret ved FACS, foxp3 mRNA-niveau blev opdaget af real- time kvantitativ PCR. Foxp3 mRNA-ekspression blev øget i tregs både Aged UBC patienter (2

– △△ CT = 0,0272 ± 0,0081) og Aged raske kontrolpersoner (0,0184 ± 0,0059) sammenlignet med unge raske kontrolpersoner (0,0097 ± 0,0039) (p = 0,035 , 0,021 henholdsvis). Ingen forskel blev påvist i tregs foxp3 mRNA-ekspression mellem Aged UBC Patienter og Aged raske kontrolpersoner. Udtrykkes som gennemsnit ± SD, blev datoen analyseret med Mann-Whitney

U

-testen. ▴ vs. tregs sorteret fra Young Sund Controls, P . 0,05

opreguleret

Senex

mRNA ekspression og nedreguleret genekspression af

P53

,

P16

,

P21

Caspase-3

i CD4 + CD25

hi tregs af Aged UBC Patienter

for at evaluere den potentielle bidrag til perifere tregs ophobning,

Senex

mRNA ekspressionen af ​​CD4 + CD25

hi tregs og CD4 + CD25- effektor T (Teff) celler blev undersøgt. Betydelig stigning i

Senex

mRNA-ekspression blev påvist i CD4 + CD25

hi tregs sammenlignet med CD4 + CD25- Teffs i alderen UBC patienter, og denne stigning blev ikke observeret i andre grupper. I mellemtiden,

Senex

mRNA ekspressionen af ​​tregs i alderen UBC patienter signicantly højere end i alderen og unge raske kontroller (Figur 3). Desuden mRNA niveauerne af apoptose regulerende gen Caspase-3, P53, P16 og P21 (2

– △△ CT = 1183,42 ± 321,17, 15,66 ± 4,83, 23,06 ± 4,59 og 2415,85 ± 863,72, henholdsvis) blev signifikant reduceret i CD4 + CD25

hi tregs sorteret fra ældede UBC patienter, sammenlignet med CD4 + CD25- Teffs (figur 4). Der blev ikke påvist signifikante forskelle i apoptose regulatoriske genekspression i CD4 + CD25

hi tregs sorteret fra alderen og unge raske kontrolpersoner, i forhold til Teffs.

tregs blev sorteret ved FACS,

Senex

mRNA niveau blev påvist ved real-time kvantitativ PCR. En betydelig stigning i

Senex

mRNA-ekspression blev påvist i CD4 + CD25

hi tregs (2

– △△ CT = 0,8532 ± 0,1078) sammenlignet med CD4 + CD25- Teffs (0,1564 ± 0,0731 ) i Aged UBC patienter (

s

= 0,027), og denne stigning blev ikke observeret i andre grupper. Tregs

Senex

mRNA-ekspression i Aged UBC patienter signicantly højere end i Aged raske kontrolpersoner (0,0923 ± 0.0519) og Young raske kontrolpersoner (0,1455 ± 0.0792) (p 0,05 for hver Mann-Whitney

U

-test). Data blev udtrykt som middelværdi ± SD. ▴ vs Teffs sorteret fra Aged UBC patienter, P 0,05; △ vs. Tregs i Aged raske kontrolpersoner og Unge raske kontrolpersoner, P. 0,05

tregs blev sorteret ved FACS, blev mRNA-niveauer detekteret ved real-time kvantitativ PCR. I Aged UBC Patiens, apoptose regulatoriske gener caspase-3, P53, P16 og P21 mRNA-ekspression (2

– △△ CT = 1183,42 ± 321,17, 15,66 ± 4,83, 23,06 ± 4,59 og 2415,85 ± 863,72 henholdsvis) faldt i tregs af Aged UBC patienter (

s

0,05 for hver Mann-Whitney U-test). Data blev udtrykt som middelværdi ± SD. ▴ vs Teffs sorteret fra Aged UBC patienter, P . 0,05

Senex

gen har vist sig at give en unik gatekeeper funktion i SIPS og apoptoseveje i EC’er [12 ]. Overekspression af

Senex

gen kan forårsage EC’er senescens, og disse

Senex

-induceret aldrende celler var resistente over for tumornekrosefaktor (TNF-α) induceret apoptose, når EC’er blev udsat for subcytotoxic koncentrationer af H

2O

2. Endvidere

Senex

overekspression inducerede en stigning i både mRNA og protein niveauer for p16 og der var et fald i protein ekspression af hyperphosphoryleret Rb. Disse resultater er angivet som

Senex

aktiveret p16 /pRb [12]. Selv om den kritiske rolle

Senex

gen i at beskytte EC’er mod cellulære apoptose er blevet godt demonstreret, udtryk for

Senex

gen i tregs stadig stort set ukendt. I den foreliggende undersøgelse

Senex

gen-mRNA-ekspression viste sig at være signifikant opreguleret i perifere CD4 + CD25

hi tregs sorteret fra ældede UBC patienter, sammenlignet med Teffs. Den opreguleret

Senex

gen kan spille en lignende rolle inducere tregs senescenc og beskytte dem mod cellulær apoptose. Tidligere undersøgelser har vist, at aldrende vækst anholdelse etableres og vedligeholdes af p53 /p21 og /eller P16 /PRB tumor suppressor veje [20] – [22]. Det er kendt, at vildtype-p53-protein kan inducere celle apoptose [23]. Caspase 3 er en nedstrøms effektor cysteinprotease i apoptotiske vej, og det betragtes som et af de vigtigste udøvere af apoptose [24]. P16-genet og P21-genet kan inhibere cyclin-afhængige kinaser (CDK) og inducere standsning af cellecyklus ved G0-G1-fasen [25] – [26]. Vi ræsonnerede, at cellecyklusregulerende molekyler, herunder p53, p21, og p16 kan være involveret i tregs ophobning i alderen UBC patienter. Vores resultater viste, at ekspressionen af ​​apoptose regulerende gen

P53

,

P16

,

P21

Caspase-3

, som kunne fremme cellulære apoptose som tidligere beskrevet [23] – [26], nedreguleret i tregs af gamle UBC patienter. Den opreguleret

Senex

gen sammen med nedreguleret pro-apoptotisk gen kan føre til nedsat apoptose i tregs, og tregs ophobning i udviklingen og progressionen af ​​alderen urin blærekræft.

Øget Niveauer af TGF-β1, IL-10, IL-17 og TNF-α serum Koncentration og nedsatte niveauer af IL-2 serum Koncentration i Aged UBC Patienter

for en indirekte vurdering af T-celle funktion, vi evalueret serum cytokinprofiler relateret til tumor immunpatologi. Sammenlignet med alderen raske kontrolpersoner og unge raske kontroller (

s

0,05 for hver T Test), der var helt klart stigning i koncentrationen af ​​IL-10 (13,03 ± 2,16 pg /ml), IL-17 ( 18.29 ± 3.45 pg /ml), TGF-β1 (16,22 ± 3,35 ng /ml) og TNF-α (25.18 ± 5.74 pg /ml) i serum fra alderen UBC patienter. I mellemtiden var der et fald i IL-2 serumkoncentration både i alderen UBC patienter (165,29 ± 26,45 pg /ml) og alderen raske kontrolpersoner (196,69 ± 32,38 pg /ml), som, sammenlignet med unge raske kontroller (409,24 ± 90,81) . Der blev imidlertid ikke observeret nogen statistisk signifikant forskel i IL-2 serumkoncentration mellem alderen UBC patienter og ældede raske kontroller (p = 0,243) (figur 5).

udtrykkes som gennemsnit ± SD, blev analyseret med parametrisk Students t-test. ▴ vs. Aged raske kontrolpersoner og Unge raske kontrolpersoner, P 0,05; △ vs. Unge raske kontrolpersoner, P. 0,05

Som den primære kilde til TGF-β1 og IL-10 i vedligeholdelse af selv-tolerance og T-celle homeostase, regulatoriske T-celler hæmmer effektor T-celler primært gennem produktion af cytokiner, såsom TGF-β1 og IL-10 [27]. Denne undersøgelse viser, at serumkoncentrationer af både TGF-β1 og IL-10 steget markant i alderen UBC patienter. Forhøjede niveauer af TGF-β1 og IL-10 tyder på, at det akkumulerede tregs i alderen UBC patienter kan have høj undertrykkende kapacitet, inhiberer antitumor immunresponser og fremme tumor immune escape. TNF-α er den prototypiske proinflammatorisk cytokin. Selv om de oprindeligt vist at være toksisk for tumorceller i høje doser, har TNF-α viste sig at have tumor-fremmende funktion [28]. Ligeledes Cytokine IL-17, der udskilles af Th17 celler, er generelt at foretrække i genereringen af ​​T-celle-anti-tumor-immunitet, men disse virkninger overskygget af deres roller i væksten af ​​tumorer [29]. I den foreliggende undersøgelse kan høje niveauer af TNF-α og IL-17 i alderen UBC patienter fremme tumorigenese, som tidligere undersøgelse havde vist, at de kunne fremme tumorangiogenese.

Interleukin-2 fremstilles hovedsageligt ved CD4 + T hjælperceller og CD8 + T-celler i sekundære lymfoide organer og IL-2-produktion er stærkt induceres efter aktivering af antigen [30]. Stand til at aktivere flere immun-celle-undergrupper, herunder T-celler, interleukin-2 er afgørende for udviklingen, overlevelse og funktion af Treg celler [30] – [31]. Betydeligt fald i IL-2 med alderen er blevet beskrevet, hovedsagelig baseret på ex vivo assays, hvor T-celle produktion af IL-2 synes at være mangelfuld [6]. IL-2 virker på celler, der udtrykker enten høj-affinitet trimer IL-2R eller lav-affinitet dimer IL-2R. Høje niveauer af det trimere IL-2R transient udtrykkes af CD4 + og CD8 + T-celler efter TCR aktivering whileTreg celler konstitutivt udtrykker høje niveauer af rimeric IL-2R [30]. I vores undersøgelse, blev der observeret en tydelig nedgang i IL-2 serumkoncentration både i alderen UBC patienter og ældre raske kontroller. Lave koncentrationer af IL-2 kan fortrinsvis stimulere proliferation af Treg celler gennem høj affinitet trimer IL-2R, og bidrager til perifer tregs ophobning i den ældre befolkning.

Senex

Expression blev korreleret med P53, TGF-β1 og IL-2-ekspression i Aged UBC Patienter

Vi nærmere den potentielle sammenhæng mellem ældning gen

Senex

mRNA niveau og serum cytokin profiler eller apoptose regulerende gen mRNA-ekspression . Brug af Pearson korrelationsanalyse, vores data viste, at

Senex

mRNA-ekspression var negativt korreleret med P53 mRNA-ekspression (p = 0,012) og IL-2-koncentration (p = 0,026), mens en positiv sammenhæng mellem

Senex

mRNA-ekspression og TGF-β1 koncentration (p = 0,001) blev regnet ud i Aged UBC Patienter.

Senex

genekspression var negativt korreleret med

P53

mRNA-ekspression (figur 6A), hvilket indebærer, at

Senex

gen kan give sin særlige funktion ved nedregulering af pro-apoptotiske gen

P53

udtryk. Endvidere

Senex

genekspression var positivt korreleret med TGF-β1 niveau (figur 6B), tyder på, at opreguleret ekspression af

Senex

gen kan forklare den høje undertrykkende kapacitet af akkumuleret tregs i alderen UBC patienter. Endelig

Senex

genet blev negativt korreleret med IL-2 serumkoncentration (figur 6C). Spredningen af ​​tregs kan stærkt undertrykke CD4 + T-hjælper celler og CD8 + T-celler og inhiberer sekretionen af ​​IL-2 i alderen UBC patienter.

Brug Pearsons koefficient test,

Senex

ekspression var negativt korreleret med (A) P53-mRNA-ekspression (Pearson korrelationskoefficient = -0,405, p = 0,012) og (B) IL-2-koncentration (Pearson korrelationskoefficient = -0,362, p = 0,026) i Aged UBC Patienter. (C) positiv sammenhæng mellem

Senex

udtryk og TGF-β1 koncentration (Pearson korrelationskoefficient = 0,507, p = 0,001) blev regnet ud af Pearsons koefficient test.

Silencing Down

Senex

Gene Expression Øget tregs Apoptose i reaktion på H

2O

2-medieret Stress In vitro

Vores ovennævnte data antydede, at opreguleret Senex genekspression var negativt korreleret med

P53

mRNA-ekspression i CD4 + CD25

høje tregs, hvilket indebar, at

Senex

gen kan hæmme tregs cellulær apoptose ved at nedregulere den pro-apoptotiske genekspression. For at undersøge om tregs fra alderen UBC patienter har en lavere andel af celle apoptose, CD4 + CD25

høje tregs og CD4 + CD25- Teffs blev sorteret, efterfulgt af flowcytometrisk analyse efter at være farvet med Annexin V-FITC og PI. Annexin V binder specifikt til den udsatte phosphatidylserin på den apoptotiske celle overflade, medens PI kan trænge ind i døde celler og interkalerer med nukleinsyre [32]. Vores data rapporteres at tregs fra ældede UBC patienter havde færre Annexin V + apoptotiske celler (0,84 ± 0,34%) sammenlignet med Teffs (9.27 ± 3,66%) (figur S1). Dette er i overensstemmelse med den tidligere undersøgelse [11], hvilket tyder på, at tregs fra alderen UBC patienter er mere modstandsdygtige over for apoptose.

For yderligere at undersøge mulighederne rolle

Senex

gen i tregs apoptose i alderen UBC patienter, vi tavshed ned

Senex

genekspression med RNA-interferens i korte dyrkede tregs som reaktion på H

2O

2-induceret oxidativ stress. H

2O

2 er en kendt inducer af oxidativ stress, når den leveres i en subcytotoxic dosis [33]. I den foreliggende undersøgelse, sorteret CD4 + CD25

høje tregs og CD4 + CD25- Teffs blev udsat for subcytotoxic koncentrationer af H

2O

2 (100 pM) i 2 timer. Vores resultater viste, at 100 uM H

2O

2 behandling øget Annexin V + apoptotiske celler i både CD4 + CD25

høje tregs (11,2 ± 2,6%) og CD4 + CD25- Teffs (13,1 ± 4,3%), og ingen signifikant forskel blev observeret i H

2O

2 induceret cellulære apoptose mellem tregs og Teffs. Silencing ned

Senex

gen ved SiRNA pulje transfektion i 24 timer, efterfulgt af 100 uM H

2O

2 behandling i 2 timer, forøget Annexin V + apoptotiske celler i CD4 + CD25

høje tregs ( 21,5 ± 3,4%), men gennemgår de samme procedurer, blev Annexin V + apoptotiske celler ikke fundet at stige i CD4 + CD25-Teffs (13,9 ± 3,1%) (figur 7). Desuden blev ingen signifikant forskel observeret i cellulær apoptose i både tregs og Teffs når cellerne kun blev behandlet med SiRNA transfektion uden H

2O

2 behandling (figur 7). Desuden tavshed ned tregs

Senex

genekspression førte til opregulering af pro-apoptotisk gen,

P53

,

P16

,

P21

Caspase -3

mRNA-ekspression som reaktion på stress (figur 8). Den transfektion effektivitet var 45 ± 7,2%, hvilket blev bekræftet af fluorescens-mærket FAM-SiRNA. De

Senex

mRNA udtryk hæmning sats var mere end 90% i forhold til ikke-kodende RNA (ncRNA) (Figur S2).

Sorteret CD4 + CD25

høje tregs blev farvet med Annexin V FITC før Flowcytometrisk analyse. Celleapoptose blev påvist som Annexin V + apoptotiske celler. 100 uM H

2O

2 behandling i 2 timer øget apoptotiske celler i både tregs (11,2 ± 2,6%) og Teffs (13,1 ± 4,3%), med ingen signifikant forskel observeret i H

2O

2 induceret apoptose mellem tregs og Teffs. Silencing ned

Senex

gen med RNA-interferens (RNAi) i 24 timer, efterfulgt af H

2O

2 behandling i 2 timer, steg apoptotiske celler i tregs (21,5 ± 3,4%), men undergår samme procedurer, apoptotiske celler blev ikke fundet at stige i Teffs (13,9 ± 3,1%). Ingen forskel blev observeret i cellulær apoptose mellem tregs og Teffs når celler blev behandlet med SiRNA transfektion alene.

Gene mRNA niveauer blev opdaget af real-time kvantitativ PCR. Efter

Senex

gen blev stille ned i 24 timer, efterfulgt af H

2O

2 behandling i 2 timer, apoptose regulatoriske gener

Caspase-3

,

P53

,

P1

6 og

P21

mRNA-ekspression (2

– △△ CT = 6705,73 ± 1124,07, 253,08 ± 16,01, 154,58 ± 35,12 og 5135,79 ± 985,47 henholdsvis) opreguleret i CD4 + CD25

hi tregs (

s

0,05 for hver Mann-Whitney U-test). Data er udtrykt som middelværdi ± SD. ▴ vs H

2O

2-behandlede celler, P. 0,05

Forrige undersøgelse viste, at

Senex

gen bidrog til apoptose modstand human EC’er [ ,,,0],12]. I den foreliggende undersøgelse, tavshed ned

Senex

genekspression øget tregs apoptose som reaktion på H

2O

2-induceret oxidativ stress.