PLoS ONE: A Novel Cancer Vaccine strategi baseret på HLA-A * 0201 Matchet Allogen Plasmacytoide Dendritic Cells

Abstrakt

Baggrund

Udviklingen af ​​effektive cancervacciner stadig en udfordring. På trods af den afgørende rolle, som plasmacytoide dendritiske celler (pdCs) i anti-tumor responser, deres terapeutiske potentiale endnu ikke er blevet udarbejdet. Vi udforskede relevansen af ​​HLA-A * 0201 matchede allogene pdCs som vektorer for immunterapi.

Metoder og Resultater

Stimulering af PBMC fra HLA-A * 0201

+ donorer ved HLA A * 0201 matchede allogene pdCs pulseret med tumorafledte peptider udløste høje niveauer af antigen-specifik og funktionelle cytotoksiske T-cellereaktioner (op til 98% tetramer

+ CD8 T-celler). PDC-vaccinen viste stærk anti-tumor terapeutiske in vivo-effektivitet, som vist ved inhibering af tumorvækst i et humaniseret musemodel. Det fremkaldte også yderst funktionel tumor-specifikke T-celler ex vivo fra PBMC og TIL af fase I-IV melanom patienter. Responser mod Mela, gp100, tyrosinase og MAGE-3-antigener nået tetramer niveauer op til 62%, 24%, 85% og 4,3% henholdsvis. pdc vaccine-primede T-celler specifikt dræbt patienternes egne autologe melanom tumorceller. Denne semi-allogen pDC vaccine var mere effektiv end konventionelle myeloide DC-baserede vacciner. Desuden pDC vaccine design forlener den med et stærkt potentiale for klinisk anvendelse i kræftbehandling.

Konklusioner

Disse resultater fremhæver HLA-A * 0201 matchede allogene pdCs så potente inducere af tumor immunitet og give en lovende immunterapeutisk strategi for bekæmpelse af kræft

Henvisning:. Aspord C, Charles J, Leccia MT, Laurin D, Richard MJ, Chaperot L, et al. (2010) A Novel Cancer Vaccine strategi baseret på HLA-A * 0201 matchede Allogen Plasmacytoide dendritiske celler. PLoS ONE 5 (5): e10458. doi: 10,1371 /journal.pone.0010458

Redaktør: Graham Pockley, University of Sheffield, England

Modtaget: December 4, 2009; Accepteret: April 7, 2010; Udgivet: Maj 4, 2010

Copyright: © 2010 Aspord et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Institut National du Cancer (ACI-63-04 og canceropole 2004-05) og Etablissement Français du Sang. J. Charles var en modtager af tilskud fra National Academy of Medicine og canceropole 2004-05. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

udviklingen af ​​effektive vacciner til behandling af kræft er et stort problem for folkesundheden [1]. Fordi cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) er i stand til at genkende og lysere maligne celler, har mange terapeutiske forsøg designet til at potensere CTL-responser. Myeloide dendritiske celler (MDC) -baserede vacciner lykkedes at inducere specifikke T-celler i patienter, men uden tilstrækkelig klinisk virkning [2], [3]. Adoptiv cellulær overførsel af anti-tumor effektor T-celler forstærket ex-vivo fra TIL induceret objektiv tumor regression [4], [5], men kompleksiteten af ​​denne strategi har hindret bred udvikling. Der er derfor et stærkt behov for nye immunterapeutiske strategier for at overvinde begrænsningerne ved de nuværende protokoller.

Indtil nu induktionen af ​​specifikke T-celle-reaktioner for adopterer og aktive immunterapeutiske strategier har været baseret på MDC’er [6 ] – [8]. -plasmacytoide Dendritiske celler (PDC) er dog centrale aktører i immunitet [9], [10] med en rolle i tumor-specifikke immunreaktioner [11]. pdCs afviger fra MDC’er i mange aspekter såsom TLR-ekspression, migration profil og immunresponser udløser. pDC er også i stand antigen registrering, behandling og præsentation [12] – [15]. Antigen-pulset pDC kan stimulere specifik primær (Mela) og hukommelse (Flu) autologe CD4 og CD8 T-celle-immunresponser in vitro [16] – [19] og prime funktionelle T-celle responser in vivo som vist efter vaccination af mus med CpG eller virus-aktiverede pDC [20] – [21]. pDC findes inden mange tumorer hos mennesker [22] – [26], hvor de menes at være umodne, tolerogene eller associeret med dårlig prognose. Men i melanom, kunne pDC aktivering ved TLR-L udløse potente anti-tumor-virkninger. Hos mus, Imiquimod ansøgning (TLR7-L) [27] eller intratumoral injektion af CpG (TLR9-L) [28] vendt den funktionelle inhibering af pDC, og derved fremme tumorregression. Desuden lokal CpG administration i melanom patienter inducerede rekruttering og aktivering af PDC skildvagtslymfekirtel [29] og efterfølgende tumor-specifikke CD8 T-celler, der er forbundet med klinisk fordel [30]. Potentialet af PDC for generering af effektive tumor-specifikke immunreaktioner er også blevet påvist i en musemodel [31]. pDC-baserede tilgange og TLR agonister [32] er derfor lovende for behandling af human cancer.

tumorantigener normalt udløse svage reaktioner. I modsætning hertil allogene responser rettet mod ikke-selv-MHC er ekstremt potent. Interessant nok allogene respons medieret af MHC klasse II-begrænsede CD4 + -T-celler fremmer bystander specifik T-celle-induktion [33], [34] som allerede vist med virale peptider [35] og tumorregression følgende allogen hudtransplantat [36]. Allogeneicity kunne derfor udnyttes til at fremme immunogenicitet mod tumorantigener [37], når de overvejer en delvis HLA match mellem vaccinen og patienten, yderligere benævnt HLA matchede allogeneicity.

Fordi pdCs spiller en afgørende rolle i at udløse T celle responser, kunne deres anvendelse være lovende som nye immunterapeutiske strategier. Imidlertid er anvendelsen af ​​autologt pDC for cancerimmunterapi er vanskelig på grund af knapheden af ​​disse celler [38] og eventuel funktionel ændring af pdCs høstet fra tumorbærende patienter. Vi undersøgte derfor potentialet af HLA-A * 0201 matchede allogene pDC at inducere HLA-A * 0201-begrænset anti-tumor-immunitet. Vi brugte en unik human pDC cellelinje (GEN) etableret fra leukæmisk HLA-A * 0201

+ pDC med fænotypiske og funktionelle egenskaber lukket til primære pdCs [39], [40], [41]. Strategien bestod i anvendelse af de peptidbelastede pdCs at inducere HLA-A * 0201-begrænset antigenspecifik CTL. Vi demonstrerer her ved hjælp tumor og viral model antigener potentialet i den bestrålede peptid-pulserede humane HLA-A * 0201 matchede allogene pDC linje (GENiusVac) in vitro, at den terapeutiske virkning in vivo i humaniserede mus, og den kliniske relevans ex-vivo med melanom patienternes celler. Vores resultater fremhæve HLA-A * 0201 matchede allogene pdCs som potente inducere af anti-tumor-immunitet og giver en lovende ny immunterapeutisk strategi for bekæmpelse af kræft.

Materialer og metoder

cellelinjer og reagenser

kulturer blev udført i RPMI 1640 Glutamax suppleret med 1% ikke-essentielle aminosyrer, 1 mM natriumpyruvat (Sigma), 100 pg /ml gentamycin og 10% FCS (alle fra Invitrogen medmindre anmeldt). Melanom line Me275 blev leveret af Pr J-C Cerottini (Ludwig Institute for Cancer Research, Epalinges, Schweiz). Melanom linjer COLO829 og A375, T2 og K562 linjer blev købt fra ATCC (LGC standarder, Molsheim, Frankrig). Melanoma line Mel89 blev dannet i vores laboratorium (fig S1). Anti-human CD45, CD3, blev CD8 Abs købt fra Beckman Coulter. Anti-HLA-A2 Abs blev købt fra BD Biosciences og anti menneskelig mela fra Sigma.

Peptider og tetramerer

Vi brugte følgende virus- og tumor-afledt HLA-A * 0201 begrænsede peptider (NeoMPS) og de tilsvarende iTag HLA-A * 0201 tetramerer (Beckman Immunomics): Mela

26-35 (ELAGIGILTV), gp100

209-217 (IMDQVPFSV), tyrosinase

369-377 (YMDGTMSQV ), MAGE-3

271-279 (FLWGPRALV), FluM1

58-66 (GILGFVFTL), CMVpp65

495-503 (NLVPMVATV).

PBMC, pDC linje, primær pDC isolation og MDC’er generation

Humant PBMC blev opnået fra HLA-A * 0201

+ raske donorer ved Ficoll-Hypaque densitetsgradientcentrifugering (Eurobio). Den humane pDC line GEN2.2 blev dyrket som tidligere beskrevet [39]. Primær pDC blev isoleret fra blodet af HLA-A * 0201

+ raske donorer. DC’er blev først beriget ved depletering af uønskede celler ved anvendelse af Pan DC inden tilsætning kit (StemCell). Indvundne celler blev enten indgivet til BDCA4 + selektion (Miltenyi) eller mærket med en Lineage cocktail, CD123, HLA-DR og CD11c antistoffer (BD) og sorteres på en BD FACSAria på grundlag af CD123 og HLA-DR ekspression og manglende Lin og CD11c markører. Renheden af ​​pDC efter sortering var over 98%. MDC’er blev differentieret fra blodmonocytter hjælp 500 U /ml GM-CSF og 10 ng /ml IL-4 (Tebu Prepotech, Frankrig) i 6 dage. Denne undersøgelse blev gennemført under en procedure, der er godkendt af det franske Blood Agency Board Institutional Review. Alle donorer underskrevet informeret samtykke formularer.

Melanom patientprøver

Prøver blev opnået fra trin I-IV HLA-A * 0201 melanom patienter, der har underskrevet informeret samtykke formularer. Vi brugte ekstra materiale, som ikke var forpligtet til patienternes diagnose eller analyse og ikke krævede supplerende procedurer. Derfor vil der i overensstemmelse med den franske lovgivning, blev der ikke etik godkendelse påkrævet, men information og underskrevet samtykke af patienterne. Kliniske parametre er vist i tabel S1. Blodprøver blev opnået fra 12 patienter og PBMC oprenset ved gradient densitet. Friske tumorprøver blev opnået fra 6 patienter, som gennemgik kirurgi for i-transit metastaser. Prøver blev dilacerated og spaltet i 2 mg /ml collagenase D (Roche Diagnostics) 20 U /ml DNase (Sigma). Derefter blev tumorceller isoleret fra cellesuspensionen ved adhærens og TIL beriget fra det ikke-klæbende fraktion ved densitetsgradient.

specifik T-celle-respons-induktion in vitro

GEN-celler blev først fyldt med en eller flere peptid (er) af interesse. Kort fortalt blev cellerne vasket 3 gange med serumfrit RPMI og resuspenderet ved 1,10

6 celler /ml. β2-mikroglobulin (0,1 ug /ml til slut) (Sigma) og peptid (er) (1-10 uM endelig) (NeoMPS) blev tilsat. Efter 3 timers inkubation ved 37 ° C blev cellerne vasket to gange, bestrålet med 30Gy og resuspenderet ved 2.10

5 celler /ml i RPMI med 10% FCS. Peptid-loaded GEN blev derefter co-dyrket med semi-allogen HLA-A * 0201 PBMC ved en 1:10 forhold i RPMI + 10% FCS i mindst 7 dage. Kulturer blev ugentligt restimuleret med peptid-belastet GEN og 200 U /ml IL-2 (Proleukine; Chiron). I nogle forsøg stimulerede primære pdCs eller MDC’er modnet med LPS (1 ug /ml) blev anvendt efter de samme betingelser. I nogle eksperimenter, anti-IFNa (50.000 U /ml) og anti-IFNp (25.000 U /ml) antistoffer (PBL Medicinske laboratorier) eller kontrol gede-IgG blev tilsat på dag 0 og dag 2 i kultur. Specifikke CD8 T-celle-responser blev målt ved tetramer mærkning af PBMC indledningsvis og ved forskellige trin af kulturen. Cellerne blev resuspenderet i HBSS med 2% FCS, farvet med CD45 FITC, iTag HLA-A * 0201 tetramer PE, CD3 PC7, CD8 APC antistoffer og analyseret ved flowcytometri analyse under anvendelse af et FACSCalibur and Cell Quest software (Becton Dickinson). For at bestemme de første tetramer niveauer, mindst 1-2,10

6 hændelser blev erhvervet.

In vitro funktionelle assays

IFNy sekretion og CD107 ekspressionen ved tetramer + CD8 T-celler.

T-celler blev først mærket med iTag HLA-A * 0201 tetramer PE i 30 minutter ved stuetemperatur, vasket og restimuleret med peptid-pulserede T2-celler (10:01 forhold) for 5 H30. For IFNy sekretion, 1 pl /ml brefeldin A (BD Biosciences) tilsat til den sidste 3 timer. Celler blev derefter overfladebehandlet mærket med anti-CD3 PC7 og anti-CD8 APC antistoffer og forelægges IFNy intracellulær farvning (BD Biosciences). For CD107 detektering, anti-CD107a og CD107b FITC-antistoffer (10 pl /1.10

6 celler) (BD Biosciences) tilsat i mediet ved begyndelsen af ​​restimulering in nærvær af Golgi STOP (0,67 pl /ml) i den sidste 4 timer. Celler blev derefter mærket med anti-CD3 PC7 og anti-CD8 APC-antistoffer. IFNy og CD107-farvning blev analyseret på tetrameren

+ CD8 + T-celler, tetramer

-.. CD8 + T-celler og CD4 + -T-celler

Cytotoksicitetsassay

Antigen-specifik cytotoksisk aktivitet blev målt ved at udføre en standard

51Cr frigivelsesassay. Effektor-T-celler blev sorteret fra co-kultur under anvendelse af et EasySep human T-celle berigelse kit (Stem Cell). Målceller (peptidpulserede T2-celler, K562, allogene eller autologe tumorceller) blev mærket med 50 uCi i 1 time ved 37 ° C, vasket 3 gange og udpladet med effektor T-celler ved den angivne E: T-forhold i rundbundet 96 Tja plader. Efter 4 timers inkubation blev radioaktiviteten målt på 30 pi af supernatanter på en mikroplade-scintillationstæller Top Count NXT (Perkin Elmer). Gennemsnittet af tredobbelte målinger blev udtrykt som en procentdel af specifik lyse ved hjælp af formlen:. (Prøve release – spontan frigivelse) /(maksimal frigivelse – spontan frigivelse) × 100

In vivo funktionelle assays i humaniseret mus

NOD-SCID β

2m

– /- immundefekte mus (NOD.Cg-Prkdc

SCIDβ

2m

Tm1Unc /J) blev købt fra Jackson ImmunoResearch Laboratories (Bar Harbor , USA) og opdrættet på Plateforme de Haute Technologie Animale (PhtA, La Tronche, Frankrig). For aktive terapi eksperimenter blev HuPBL mus konstrueret ved at transplantere intraperitonealt (ip) 50.10

6 PBMC fra raske donorer i subletalt bestrålede NOD-SCID β

2m

– /- mus (120-150 cGy). Mus blev yderligere vaccineret med 5.10

6 bestrålede peptidpulserede GEN-celler ved ip eller sc ruter en gang om ugen. Respons på vaccination blev analyseret på forskellige tidspunkter i blod, peritoneal lavage, milt og lymfeknuder. Organer blev spaltet i 30 minutter ved 37 ° C med 2 mg /ml collagenase D (Roche Diagnostics). Resulterende cellesuspensioner blev vasket med HBSS + 2% FCS, farvet under anvendelse af de følgende anti-humane antistoffer (CD45 FITC, iTag HLA-A * 0201 tetramer PE, CD3 PC7, CD8 APC) og underkastes flowcytometrianalyse. For at vurdere terapeutisk effektivitet, blev 1,10

6 humane tumorceller implanteret subkutant i flanken af ​​de humaniserede mus enten 5 dage efter (profylaktisk) eller 4 dage før (terapeutisk) den første vaccination. Vaccination blev gentaget hver uge. Tumorstørrelse blev overvåget hver 2-3 dage, og tumorvolumen beregnet efter formlen: (kort diameter)

2 × lang diameter /2. At analysere specifikke T-celler på tumorstedet og i DLN, blev vævene spaltet som beskrevet tidligere og cellesuspensioner blev forelagt tetramer mærkning og flowcytometrianalyse. Alle in-vivo-forsøg er blevet godkendt af det regionale udvalg for Animal Etik Rhône-Alpes (CREEA) tilknyttet CNRS.

Statistisk analyse

De statistiske analyser blev udført ved hjælp af Mann-Whitney ikke parametrisk U-test og uparret t-test under anvendelse af Prism software.

Resultater

humane HLA matchede allogene pdCs inducere antigen-specifikke T-celle responser fra rask donor PBMC med en stærk virkning in vitro

for at undersøge potentialet af HLA matchede allogen PDC for antigen-specifik T-celle-responser induktion sammenlignede vi evnen hos peptid-belastet primære pDC sorteret fra raske donorers blod til at inducere specifikke T-celle responser i autologt og allogene HLA-A * 0201-matchede indstillinger. pDC førte til en signifikant højere specifik T-celle-induktion i HLA-A * 0201 matchede allogene indstillinger sammenlignet med autologe betingelser (opformering af det absolutte antal Mela-specifikke T-celler i 7 dage: 35,6 ± 8,9 vs 17,9 ± 8,7, middel ± SEM , p = 0,02) (figur 1A og 1B, fire forsøg udført med tre forskellige donorer). Som knapheden af ​​primær pDC forhindrer deres brede terapeutiske anvendelse, brugte vi den humane pDC cellelinje (GEN) etableret fra leukæmisk HLA-A * 0201

+ pDC som en kilde til HLA-A * 0201 matchede allogene pdCs. For at vurdere om den bestrålede HLA-A * 0201

+ pDC linje kan inducere specifikke T-celle-responser som primær pDC in vitro, allogene HLA-A * 0201

+ PBMC fra raske donorer blev stimuleret med bestrålede peptid-loaded GEN-celler. For både tumor (Mela) og virale (Flu)-afledte peptider, opnåede vi en massiv forstærkning af specifikke T-celler efter kun 7 dages kultur som påvist ved tetramer mærkning (figur 1C, Figur S2). Denne induktion blev yderligere forstærket af serielle stimuleringer hver 7 dage med peptid-belastet pDC linje, i kombination med IL-2. Vi rutinemæssigt opnået 5-25% tetramer

+ CD8 T-celler efter 7 dage, 40-60% efter 15 dage og op til 98% efter 40 dage (figur 1C). Sådanne høje responser blev gengivet med celler fra 14-20 raske donorer og med forskellige melanom tumorafledte antigener, såsom Mela, gp100, TYR, MAGE-3 (figur 1 D) samt virusafledte antigener (Figur S2). Tumorspecifik tetramer

+ T-cellereaktioner nåede gennemsnit på 22% for Mela (interval 2-60%), 0,3% for gp100 (interval 0-3%), 1,2% for TYR (interval 0-8%) og 0,84% for MAGE-3 (interval 0-4%) i 20 dage. Multi-specifikke responser blev også induceret ved hjælp af GEN-celler forsynet med flere forskellige peptider (ikke vist). Således HLA matchede allogene primære pdCs eller pDC linje fremkalde stærke primære og hukommelse antigenspecifikke T celle responser in vitro fra raske donorer.

(A, B) autologe eller allogene HLA-A * 0201

+ primære pDC sorteret fra blod fra raske donorer blev pulseret med Mela peptid og anvendes til at stimulere HLA-A * 0201

+ PBMC. Den specifikke T-celle-respons blev analyseret på d7 ved tetramer mærkning. (A) Procentdel Mela specifikke T-celler (gated på CD8 + T-celler). Et repræsentativt eksperiment er vist. (B) Opformering af det absolutte antal af specifikke T-celler fra d0 til d7 (4 uafhængige forsøg udført med 3 forskellige donorer). (C, D) allogen HLA-A * 0201

+ PBMC fra raske donorer blev stimuleret med bestrålede peptidladede HLA-A * 0201

+ pDC linje og ugentlige restimuleret i nærvær af IL2. Specificitet af T-cellerne blev bestemt ved tetramer mærkning og flowcytometrianalyse. (C) Repræsentative dotplots gatet på CD8 + T-celler (venstre felt) og procentdele (højre panel) af Mela tetramer

+ T-celler i kulturen første gang og på forskellige tidspunkter efter stimulering med pDC linje fyldt med Mela peptid. Influenza tetramer blev anvendt som kontrol. (D) Repræsentative dot plots gatet på CD8 + T-celler (venstre felt) og den procentvise tetramer

+ CD8 + T-celler opnået på dag 7, 14 og 20 i kulturen i retning Mela (n = 18), gp100 (n = 16 ), TYR (n = 16) og MAGE-3 (n = 16) tumorantigener.

De specifikke T-celler induceret af HLA matchede allogen pDC udstillet i vitro funktionel HLA-begrænset aktivitet

Vi undersøgte yderligere funktionaliteten af ​​specifikke T-celler induceret af HLA-A * 0201 matchede allogen pDC linje. Vi først analyseret evne tumorspecifikke T-celler til at udskille IFNy og udtrykke CD107 upon restimulering. Når co-dyrket med peptid-loaded T2-celler, Mela-specifikke T-celler udskilte IFNy og udtrykt CD107 i nærværelse af den relevante, men ikke kontrol-peptid (figur 2A). Vi opnåede inden tumor-reaktive T-celler gennemsnit på 25% IFNy

+ tetramer

+ CD8 T-celler på specifik restimulering forhold til 5% under kontrolbetingelser (p = 0,007), og 50% CD107

+ tetramer

+ CD8 T-celler på specifik restimulering sammenlignet med 24% under kontrolbetingelser (p = 0,02) (data ikke vist). Vi næste testede deres cytotoksicitet ved at udføre

51Cr frigivelsesassay under anvendelse peptidbelastede T2-celler og melanom tumorlinjer var mål. Mela-specifikke T-celler udviste en stærk cytotoksisk aktivitet over T2-celler forsynet med relevante, men ikke med kontrolpeptid (figur 2B). Vi opnåede 88% af specifikt drab versus 13% under kontrolbetingelser (gennemsnit af 8 forsøg, s 0,001) (ikke vist). Desuden Mela-specifikke T-celler var i stand til at lysere HLA-A * 0201

+ Mela

+ (Me275) men hverken HLA-A * 0201

+ Mela

– (A375) eller HLA -A * 0201

-MelA

+ (COLO829) melanom tumorceller (figur 2B, figur S1) demonstrerer HLA-A * 0201-begrænsning og antigen-specificitet af denne aktivitet. Endvidere var dette lysis inhiberet af EGTA-MgCI2 eller af CD8 T-celle depletion (ikke vist), som sammen med CD107 overfladeekspression på specifik restimulering, foreslår en mekanisme, der involverer cytolytisk granula exocytose fra CD8 T-celler. Sådanne funktionelle kapacitet blev observeret med T-celler udtaget på forskellige tidspunkter af 7-40 dages kultur. Lignende analyse udført med virus-specifikke T-celler demonstrerede kapacitet Flu tetramer

+ T-celler til at udskille IFNy og udtrykke CD107 på specifik restimulering, og deres cytotoksiske egenskaber (fig S3a og S3B). Vigtigt er det, vi observerede kun en mindre allogene respons induktion afsluttet med den dårlige aktivering af ikke-specifik tetramer

– CD8 + T-celler og CD4 + T-celler mod GEN celler. Dette blev observeret efter én stimulering (Flu reaktion) (fig S3C og S3D), men også efter gentagne stimuleringer med pDC linje (Mela respons), ved at måle IFNy-secernerende (figur 2C) og CD107-udtrykkende T-celler (Figur 2D) på restimulering med T2 eller GEN celler. Vi observerede også fraværet af tetrameren

+ T-celle-aktivitet over GEN-celler forsynet med et irrelevant peptid. Således pDC linje fremkalder fuldt funktionelle antigen-specifikke T-celler med mindre bystander allogene responser.

(A) Mela-specifikke T-celler induceret af PDC linien secernerer IFNy og udtrykke CD107 på overfladen på specifik restimulering. Celler fra kulturen (dag 14) blev forelagt tetramer mærkning og restimuleret med T2 celler pulset med et relevant eller kontrol peptid. IFNy produktion blev vurderet ved intracellulær farvning og CD107 udtryk ved at tilføje anti-CD107a + b antistoffer under restimulering. Dotplots er gatet på tetramer

+ CD8 + T-celler. Repræsenterer 8 eksperimenter udført med 3 donorer på dag 8-40 af kulturen. (B) Mela-specifikke T-celler induceret af PDC linje er cytotoksiske. T-celler blev selekteret fra kulturen og underkastes en

51Cr frigivelsesassay under anvendelse peptidbelastede T2-celler og melanoma-tumorceller som mål. Repræsenterer 8 forsøg udført med 4 donorer ved d13-40 af kulturen. (C, D) blev IFNy sekretion og CD107 ekspression vurderes som beskrevet i (A) efter tre stimuleringer af PBMC og analyseret på tetrameren

+ CD8 + T-celler (hvide søjler) og på den ikke-specifikke tetramer

– CD8 + T-celler (grå søjler) og CD4 + T-celler (sorte søjler) efter restimulering med peptid-pulserede T2 eller GEN-celler (4 forsøg for hver betingelse).

peptid-loaded HLA matchede allogen pDC linje fremkalder stærke in vivo antigen-specifikke T-celle-responser i humaniseret mus

anvendelsen af ​​HLA matchede allogene pdCs som en vaccine kræver induktion af antigenspecifikke T celle responser in vivo. Derfor har vi vurderet vaccinen potentiale pDC linie i et humaniseret musemodel [42] konstrueret ved xenotransplanting human PBMC i immundefekte NOD-SCIDβ

2m

– /- mus (HuPBL SCID model). Fireogtyve timer efter intraperitoneal overførsel blev menneske CD45

+ hæmatopoietiske celler fundet på injektionsstedet, men også i kredsløbet og lymfoide organer (ikke vist). En enkelt intraperitoneal injektion af bestrålede peptidladede HLA-A * 0201 matchede allogen pDC linje induceret stærke antigenspecifikke T celleresponser i retning viral (FluM1, CMVpp65) og tumor (Mela) antigener i HuPBL mus (Figur 3A). Human tetramer

+ CD8 T-celler viste sig ikke kun ved stedet for immunisering (peritoneal lavage), men også i kredsløbet (blod) og lymfoide organer (milt, lymfeknuder) (figur 3A). Vi evaluerede derefter, om flere ugentlige injektioner af peptid-pulserede pDC linje kunne øge niveauet af responset. Interessant viralt antigen (Flu) inducerede en høj respons, der toppede 7 dage efter den første vaccine og faldt efterfølgende, hvorimod svar på tumorantigen (mela) holdes stigende ved senere restimuleringer (Figur S4). Inden alle vaccineret HuPBL mus (n = 22, 18 og 38) rekonstitueret med humant PBMC (baseline niveauer af tetramer + CD8 + T-celler var 0,11% (FluM1), 0,12% (CMVpp65) og 0,01% (Mela) tetramer

+ T celler) niveauer af specifikke T-celler inddrevet i de forskellige organer varierede fra 0,7 til 1,9% for FluM1, 1,1 til 5,9% for CMVpp65, og 0,2 til 1% for Mela (figur 3B). Således peptid-pulserede pDC linje fremkalder stærke og udbredte antigenspecifikke T-celle responser in vivo

(AB) immundeficient NOD-SCIDβ

2m

-. /- Mus blev rekonstitueret intraperitonealt med 50.10

6 humant HLA-A * 0201

+ raske donorers PBMC og vaccineret ad samme vej med 5.10

6 bestrålet peptidbelastede GEN-celler. Specifik T-celle-induktion blev analyseret på injektionsstedet (lavage), i kredsløbet (blod) og lymfoide organer (milt, LN) ved tetramer mærkning af humane T-celler i cellesuspensioner. (A) Vaccination med peptidbelastede GEN-celler induceret specifikke T celle responser in vivo. Repræsentative dot plots af tetramer mærkede T-celler induceret efter en enkelt vaccination med peptid-belastet GEN-celler i forskellige organer på dag 8 for anti-viral vaccine (Flu, CMV) og dag 10 for anti-tumor-vaccine (Mela) (gated på CD8

+ T-celler). En mus pr gruppe er vist. Indledende niveauer af specifikke T-celler inden PBMC var 0,04%, 0,14% og 0,003% hhv. (B) Niveauer af specifikke T-celler før (dag 0) og efter vaccination med GEN ladet med FluM1 (n = 22 mus, 4 donorer, 1 vaccine), CMVpp65 (n = 18 mus, 2 donorer, 1 vaccine) og Mela ( n = 38 mus, 4 donorer, 2-3 vacciner) peptider ved de angivne tidspunkter i forskellige organer. Hver prik repræsenterer en vaccineret HuPBL mus (barer på middelværdi).

Vaccination med peptid-loaded HLA matchede allogen pDC linje beskytte humaniseret mus fra tumor progression i både profylaktiske og terapeutiske indstillinger

Vi næste undersøgt det terapeutiske potentiale af denne strategi i humaniseret mus yderligere transplanteret med human tumor. NOD-SCIDβ

2m

– /- mus blev rekonstitueret intraperitonealt med humane HLA-A * 0201

+ PBMC og ugentlige vaccineret subkutant med bestrålede peptid-pulserede GEN celler før eller efter at blive udfordret med melanom tumor celler. I en profylaktisk indstilling, injektion af HuPBL mus med Mela-loaded GEN celler sammenlignet med Flu-loaded GEN celler, hæmmede HLA-A * 0201

+ Mela

+ tumorvækst (Me275) på fem uafhængige forsøg (tumor størrelse på dag 27 = 12 vs 77 mm

3, s 0,0001) (Figur 4A og 4C). Derimod væksten af ​​HLA-A * 0201

-MelA

+ (COLO829) og HLA-A * 0201

+ Mela

– (A375) melanom tumorer blev ikke påvirket efter injektion af Mela eller Flu-loaded GEN-celler i tre uafhængige forsøg (figur 4C), hvilket viser HLA-A * 0201-restriktion og antigenspecificitet af terapien. Desuden peptidladede pDC også fremkalde beskyttende immunresponser mod allerede etablerede tumorer. Vaccination af tumor-bærende HuPBL mus med Mela-loaded GEN celler hæmmede tumorvækst i forhold til Flu-loaded GEN celler (tumorstørrelse på dag 25 = 6 vs 36mm

3, p = 0,01) (Figur 4D-4F). Især tetramer

+ CD8 + T-celler blev fundet på tumorstedet og i dræning LN (figurerne 4B og 4F), hvilket antyder, at tumor-reaktive T-celler induceret af HLA matchede allogen pDC havde migreret til stedet for antigen udtryk og T-cellerne var i stand til at dræbe tumorceller

(AC) immundefekt NOD-SCID β

2m

-. /- mus rekonstitueret intraperitonealt med humane HLA-A * 0201

+ PBMC (HuPBL mus) blev ugentligt vaccineret subkutant med bestrålede mela eller Flu-loaded GEN-celler og udfordret 5 dage senere med melanoma-tumorceller i flanken. (A) Opfølgning af tumor progression. Et eksperiment repræsentativt for 5. (B) Tetramer mærkning af tumor og drænende LN cellesuspensioner fra HuPBL mus vaccineret med Mela-loaded GEN-celler, der viser tilstedeværelsen af ​​Mela-specifikke T-celler (gated på CD8 + T-celler). (C) De terapeutiske virkninger af vaccinen er HLA-A * 0201-begrænset, og antigen-specifikke. Sammenlignende tumorstørrelse 27 dage efter implantation af Me275, COLO829 og A375-melanomceller i HuPBL mus vaccineret med Mela eller Flu-loaded GEN-celler (pulje af 3 uafhængige forsøg for hver tumortype udført med 6 til 14 mus pr gruppe). (DF) immundefekt NOD-SCID β

2m

– /- mus rekonstitueret intraperitonealt med humane HLA-A * 0201

+ PBMC (HuPBL mus) blev først udfordret med melanom Me275 tumorceller i flanken og derefter vaccineret subkutant med bestrålet mela eller Flu-loaded GEN celler ugentlig starter 4 dage senere. (D) Opfølgning af tumor progression. Et repræsentativt eksperiment ud af 2. (E) Komparativ tumorstørrelse 25 dage efter tumorimplantation (pulje af 2 uafhængige eksperimenter, 8 mus /gruppe). (F) Tetramer mærkning af tumor og dræning LN cellesuspensioner fra HuPBL mus vaccineret med Mela-loaded GEN-celler, der viser tilstedeværelsen af ​​Mela-specifikke T-celler (gated på CD8 + T-celler).

HLA matchet allogen pDC linje fyldt med melanom-afledte peptider inducerer multi-specifikke og yderst funktionel T-celle responser ex-vivo fra trin i-IV melanom patienter

Vi næste undersøgt relevansen af ​​denne strategi i kræftpatienter. Vi testede evnen af ​​peptid-pulserede pDC line at udløse ex-vivo tumorspecifikke responser fra PBMC og tumor-infiltrerende lymfocytter (TIL) isoleret fra trin IV HLA-A * 0201

+ melanompatienter (tabel S1 og S2 ). Ugentlige stimuleringer af patienters PBMC med pDC linje pulseret med enten Mela, gp100, Tyr eller MAGE-3-peptidet førte til massiv amplifikation af specifikke CD8 + T-celler i mindst 2 ud af 4 melanom antigener (figur 5A og 5B). Det tumorspecifikke tetramer

+ CD8 T-cellereaktioner nået gennemsnit på 23% for Mela (interval fra 0,4 til 62%), 1,2% for gp100 (interval 0,05-3,5%), 0,3% for TYR (interval 0,01-2,5% ) og 0,2% for MAGE-3 (interval 0,03-0,72%) efter 20 dage (baseline tetramer + CD8 + T-celler mellem 0,02 til 0,03% ved d0). En patient blev udelukket fra analysen på grund af en ekstremt intens respons (85% tetramer

+ T-celler på dag 14) mod TYR (figur S5). Endvidere gentagne stimulationer af patients’TIL med pDC linje pulseret med en blanding af de 4 melanoma peptider medførte massive amplifikation af specifikke T-celler i mindst 3 antigener (figur 5C og 5D). Tumorspecifik tetramer

+ CD8 T-cellereaktioner nået gennemsnit på 39% for Mela (interval 12-59%), 7,4% for gp100 (interval fra 0,2 til 24%), 0,3% for TYR (interval 0,05-1,2%) og 1,1% for MAGE-3 (interval 0,1-4,3%) efter 20 dage med basislinieniveauer format dag 0 1,7, 0,2, 0,05 og 0,3%, henholdsvis.