PLoS ONE: Enhanced In Vivo aktivitet af kombinationen af ​​en MEK og en PI3K Inhibitor korrelerer med [18F] -FLT PET i Human Colorectal Cancer xenotransplantat Tumor-Bearing Mice

Abstrakt

Kombineret målretning af MAPK og PI3K signalveje i cancer kan være nødvendige for optimal terapeutisk aktivitet. At støtte kliniske studier af kombinationsbehandling, 3′-deoxy-3 ‘- [

18F] fluorthymidin ([

18F] -FLT) -optagelse målt ved Positron Emission Tomography (PET) blev evalueret som en ikke-invasiv surrogat respons biomarkør i prækliniske modeller.

in vivo

anti-tumor effekt og PK-PD egenskaber af MEK inhibitor PD 0325901 og PI3K inhibitor GDC-0941, alene og i kombination, blev evalueret i HCT116 og HT29 menneskelige kolorektal cancer xenograft tumor-bærende mus, og [

18F] -FLT PET undersøgt i mus med HCT116 implanteret. Dobbelt målretning af PI3K og MEK inducerede markant tumorvækstinhibering

in vivo

, og forøget anti-tumor-aktivitet blev forudsagt af [

18F] -FLT PET scanning efter 2 dages behandling. Farmakodynamiske analyser anvendes en kombination af PI3K-inhibitoren GDC-0941 og MEK-inhibitor PD 0.325.901 viste, at forøget effektivitet er forbundet med en øget inhibering af phosphorylering af ERK1 /2, S6 og 4EBP1, sammenlignet med den observeret med enten enkelt middel og fastholdt inhibering af AKT-phosphorylering. Farmakokinetiske undersøgelser indikerede, at der ikke var nogen markant PK interaktion mellem de to lægemidler. Tilsammen indikerer disse resultater, at kombinationen af ​​PI3K og MEK-inhibitorer kan resultere i signifikant effekt, og vise for første gang, at [

18F] -FLT PET kan korreleres til den forbedrede effektivitet af kombineret PI3K og MEK-inhibitor-behandling.

Henvisning: Haagensen EJ, Thomas HD, Wilson I, Harnor SJ, Payne SL, Rennison T, et al. (2013) Den Enhanced

In Vivo

aktivitet af kombinationen af ​​en MEK og en PI3K Inhibitor korrelerer med [

18F] -FLT PET i Human Colorectal Cancer xenotransplantat Tumor-bærende mus. PLoS ONE 8 (12): e81763. doi: 10,1371 /journal.pone.0081763

Redaktør: Seema Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, USA

Modtaget: Juli 5, 2013; Accepteret: 16 Oktober 2013; Udgivet: December 10, 2013 |

Copyright: © 2013 Haagensen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. HDT, IW, SJH, SLP, TR, KMS, RJM og DRN er finansieret af Cancer Research Storbritannien (CRUK) Drug Discovery, Imaging og medicinalkemi Training programmer (C240 /A15751 og C29821 /A10348) EJH var en Medical Research Council (MRC) CASE Award Ph.d.-studerende understøttet af UCB Celltech, Slough, UK. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Alle Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt relevante for indholdet af dette papir med undtagelse af David R. Newell, der er på den rådgivende bestyrelse Wilex AG Board. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om deling Cover Letter data og materialer

Introduktion

Der er udviklet Talrige småmolekyleinhibitorer af særlig signaltransduktion.; i særdeleshed har den PI3K vej, en større overlevelse vej, og MAPK vej, en stor mitogen vej, været mål i kræft. Men enkeltstof klinisk aktivitet med disse inhibitorer har generelt været beskeden, og dermed kombinationer er ved at blive evalueret [1]. Mange kombinationer af PI3K og MAPK inhibitorer har udvist lovende aktivitet

in vitro

men nogle af de mest imponerende resultater er set

in vivo

.

Som en enkelt agent, pan PI3K inhibitor GDC-0941 har beskedne præklinisk

in vivo

virkningsfuldhed, med dosisafhængig aktivitet over området 25-150 mg /kg /dag i U87MG glioblastoma xenograft model [2]. Efterfølgende er doser på 75-150 mg /kg vist sig at resultere i tumorvækstinhibering i en række humane tumor xenograftmodeller herunder tumorer, der er

PIK3CA

mutant,

PTEN

null,

EGFR

mutant eller vildtype, med en tilhørende fald i AKT og S6 phosphorylering [2], [3], [4], [5], [6]. GDC-0941 viste lovende prækliniske farmakokinetik med god oral biotilgængelighed (78% i mus), og på grundlag af disse data og de forudsagte farmakokinetik hos mennesker [2], [7], er nu gennemgår fase I og II kliniske undersøgelser som en enkeltstof eller i kombination med kemoterapeutiske stoffer [8], [9].

allosterisk MEK inhibitor PD 0.325.901 også udstillet lovende selektiv præklinisk anti-cancer effekt

in vivo

som en enkelt agent, doser på 10-25 mg /kg forårsagede signifikant tumor væksthæmning og i mange tilfælde regression, i en række murine og humane tumor xenograftmodeller, herunder dem, der var

BRAF

eller

KRAS

vildtype eller mutant [6], [10], [11], [12], [13], [14]. Vækstinhibition, der opnås med høje doser af PD 0325901 var ledsaget af et fald i ERK1 /2 phosphorylering, som blev opretholdt, selv når anvendtes lavere doser af 1,5-3 mg /kg PD 0325901; men disse lavere doser var kun i stand til at forårsage en beskeden tumorvækstforsinkelse [6], [10], [11], [12]. Oral og intravenøs doser af PD 0325901 viste sig at have sammenlignelig biotilgængelighed, var ikke-toksiske ved 100 mg /kg, og resulterede i en dosisafhængig inhibering af ERK1 /2 phosphorylering i rotte lever og lunger skyldes hæmning af MEK [15]. Men afslørede kliniske forsøg, at enkeltstof PD 0.325.901 var forbundet med okulær og neurologisk toksicitet, såsom retinal vene okklusion [16], og dermed kliniske forsøg med monoterapi PD 0.325.901 er blevet opsagt [8].

Som MEK inhibitor PD 0325901 optrådte lovende som et enkelt middel men viste toksicitet i kliniske forsøg, og tumor væksthæmning var beskeden med PI3K inhibitor GDC-0941 selv ved høje doser, disse og andre PI3K og MEK-inhibitorer bliver nu undersøgt klinisk i kombination undersøgelser [8]. Til dette formål, er PD 0325901 blive undersøgt i kombination med PI3K /mTOR-hæmmer PF-04.691.502, og GDC-0941 er i et klinisk forsøg i kombination med MEK-inhibitor GDC-0973 [8].

In vivo

prækliniske undersøgelser har vist, at kombinationer af PI3K og MEK-inhibitorer konsekvent resultere i forbedret tumor væksthæmning i forhold til enten enkeltstof, og i mange tilfælde forårsage regression i en række human tumor xenograft og mus tumormodeller med en række genetiske baggrunde, herunder dem med

KRAS

,

BRAF

og /eller

PIK3CA

mutationer, og /eller

PTEN

sletninger [6 ], [12], [17], [18], [19]. Desuden de observerede med kombinationsbehandling svar var ofte holdbare, trods relativt lave doser af begge hæmmere, der anvendes i mange undersøgelser. Kombination af PI3K og MEK-inhibitorer er blevet vist at nedsætte phosphorylering af S6, AKT og ERK1 /2 [12], [19], og intermitterende dosering undersøgelser har afsløret langvarig virkning på downstream markører for celleproliferation og apoptose, såsom en vedvarende nedgang i cyclin D1 og en stigning i Bim niveauer, som kan være ansvarlig i del til forbedret reaktionstid set med kombinationsbehandlingen [6], [19].

Farmakodynamiske biomarkører for MAPK og PI3K pathway modulation, såsom de ovennævnte, kræver gentagne invasive biopsier og dermed kan ikke være klinisk mulig. Desuden ændringer i tumorstørrelse eller stabilisering sygdom, som målt ved volumetrisk billeddiagnostiske metoder såsom CT og MR kan ikke vise sig efter mange ugers terapi, som kan forsinke den kliniske beslutningsproces og potentielt resultere i patienter uhensigtsmæssigt tilbage på ineffektiv og giftige behandlinger for længere tid. For at løse de begrænsninger af konventionelle volumetrisk billedbehandling, er positronemissionstomografi (PET), der anvendes i prækliniske undersøgelser og kliniske forsøg som et funktionelt surrogat svar imaging biomarkør [13], [14].

fluor- modificeret thymidinanalog, 3′-deoxy-3 ‘- [

18F] fluorthymidin ([

18F] -FLT) er en PET radiotracer, der bruges til at påvise anti-proliferative virkninger, som akkumulation i celler bestemmes ved ekspression og aktivitet af enzymet thymidinkinase 1 og specifikke nukleosid transportører, som begge er under kontrol af S-fase cellecyklus regulatorer [13], [14], [20], [21], [22], [ ,,,0],23]. Desuden optagelsen af ​​[

18F] -FLT har vist sig at korrelere med standard proliferationsmarkører, såsom Ki67, TK1 og BrdU optagelse [24], [25], [26], [27], [28] , [29]. Brug [

18F] -FLT PET, ændringer i proliferation i forhold til baseline er blevet påvist i en række humane tumorxenografter så tidligt som 18, 24 og 120 timer med enten enkelt agent GDC-0941 eller PD 0.325.901 [13], [14], [30], [31]. Derudover [

18F] -FLT PET er allerede blevet brugt til at forudsige effekten af ​​kemoterapi og strålebehandling [32], [33], [34], og nylig to kliniske forsøg er begyndt med MEK-inhibitor AZD6244 som et enkelt middel inkorporerer [

18F] -FLT PET [8], [35].

Formålet med undersøgelserne, der er beskrevet i denne rapport var at undersøge, om [

18F] -FLT PET kan anvendes som et surrogat svar biomarkør til kombineret MEK og PI3K-hæmmer, som en optakt til kliniske forsøg.

Metoder

Etik Statement

Alle forsøg blev revideret og godkendt af Newcastle University (UK) udvalg dyrevelfærd, og blev udført i henhold til retningslinjerne for velfærd og anvendelse af dyr i kræftforskningen [36] og den nationale lovgivning, i henhold til projektet licens (PPL60 /4442), udstedt af den britiske regering Home Office under dyrene ( videnskabelig procedure) handle 1986.

Cell Lines Reagenser

HCT116 og HT29 humane kolorektal cancer celler blev opnået fra ATCC (American Type Culture Collection). Alle cellelinier blev dyrket i RPMI-1640-medium (suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum, 1% (v /v) penicillin (50 U /ml) – streptomycin (50 mg /ml) og 2 mM L -glutamine) og blev bekræftet fri for forurening med mycoplasma ved regelmæssig test med Mycoalert (Cambrex, Iowa, USA).

Inhibitors

MEK inhibitor PD 0.325.901 er venligst leveret af UCB Celltech, Slough, Berkshire, UK. Den PI3K inhibitor GDC-0941 blev enten syntetiseret i hus [37] eller købt fra Stratech Scientific Ltd, Newmarket, Suffolk, UK. Alle partier af GDC-0941 var fuldt karakteriseret ved anvendelse af traditionel kemiske analyser, vist sig at være 99% ren, og omsatte biologiske resultater i overensstemmelse med ægtheden af ​​forbindelsen. Begge lægemidler blev suspenderet i 0,5% hydroxypropylmethylcellulose (vægt /volumen) og 0,2% Tween 80 (v /v) i sterilt destilleret vand (MCT).

Dyr

Dyreforsøg blev alle udføres under anvendelse af kvindelige athymiske CD1 nøgne mus (Charles River, Kent, UK), implanteret med HCT116 eller HT29 xenotransplantater (1 × 10

7-celler i 50 pi medier injiceret subkutant i den højre flanke), vedligeholdes og håndteres i isolatorer under specifikke patogenfrie forhold.

farmakokinetiske (PK) og farmakodynamiske (PD) Undersøgelser

Mus bærer HCT116 human tumorxenoplantater blev behandlet med enten 1 mg /kg PD 0.325.901, 100 mg /kg GDC -0941 eller kombinationen af ​​1 mg /kg PD 0.325.901 og 100 mg /kg GDC-0941, og blev åreladet ved hjertepunktur under terminal anæstesi på udvalgte tidspunkter efter-behandling (0.25-24 timer, 3 mus /tidspunkt). Blod blev opsamlet i hepariniserede rør, og plasmaet blev fraskilt og opbevaret ved -20 ° C indtil analyse. Tumorer blev fjernet, lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C inden PK og PD analyser, som beskrevet nedenfor.

I PK analyser, blev lægemidlet ekstraheret fra 60 pi alikvoter af prøver ved proteinfældning med 9 volumener acetonitril (MeCN). Prøverne blev centrifugeret ved 3000 g i 5 minutter ved 4 ° C, og 500 pi af supernatanten inddampet til tørhed under nitrogengas ved 30 ° C ved anvendelse af en Zymark Fordamper (Caliper Life Sciences Limited, Cheshire, UK). Prøver blev rekonstitueret i 100 gi HPLC mobil fase bestående af 40% acetonitril og 60% (v /v) 0,1% myresyre pH 4,0 (v /v), og 50 pi af supernatanten påført på en 10 cm Xterra Waters 186.000.436 C18 3.5 um søjle (Waters, Hertfordshire, UK) forsynet med en in-line filter. Forbindelser blev elueret med den ovenstående mobil fase ved 1 ml /min under anvendelse af en Waters Millennium Chromatography-system (Waters, Hertfordshire, UK). Analytter blev påvist ved UV-absorbans ved 275 og 315 nm ved retentionstider på 6,8-7,3 og 3,9-4,3 minutter for PD 0.325.901 og GDC-0941 hhv. Til analyse af lægemiddel i tumorvæv blev tumorer homogeniseret i 3 volumener PBS (vægt /volumen) og 50 pi prøver ekstraheret med 9 volumener MeCN og centrifugeret, inddampet og analyseret som beskrevet ovenfor. Total (frit og proteinbundet) lægemiddelkoncentrationer blev bestemt ved anvendelse af standard kurver (0,1-10 ug /ml, r

2 0,98 i alle tilfælde), der genereres ved at ekstrahere forbindelser fra den givne matrix ekstraktionseffektiviteten er 97% for alle matricer. Parret t tests blev anvendt til at sammenligne de forskellige behandlingsgrupper og forskelle med ap værdi. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

For PD analyser, tumorer (2 til 4~2.5 mm

3 stk) var opdelt i 1 ml PhosphoSafe ™ udvinding reagens (Merck Chemicals Ltd, Nottingham, Nottinghamshire, UK), der indeholder en proteasehæmmer cocktail (Pierce, Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA) på producentens anbefalede fortynding ved hjælp af en Medimachine ™ (BD Biosciences, Oxford, UK), centrifugeret, og supernatanten blev fjernet og analyseret ved Western blotting. Proteiner blev løst på Novex® 4-12% (w /w) Tris-glycin geler (Invitrogen Ltd, Renfrew, Paisley, UK) og elektrooverført på Hybond C nitrocellulose membran (GE Healthcare Life Sciences, Hatfield, Hertfordshire, UK). Membraner blev inkuberet med phospho-4EBP1 (Thr37 /46) (# 2855), phospho-p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) (# 4370), phospho-Akt (Ser473) (# 4060) eller phospho-S6 ribosomal protein ( Ser235 /236) (# 4858) monoklonale antistoffer opnået fra Cell Signalling Technology (New England BioLabs (UK) Ltd, Hitchin, Hertfordshire, UK). Antistofbinding blev detekteret ved inkubation med et HRP-konjugeret gede-anti-kanin-polyklonalt antistof (Dako, Glastrop, Danmark). Blots blev udviklet ved hjælp af Pierce ECL (forøget kemiluminescens) western blotting substrat (Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA), eller SuperSignal® West Dura udvidet varighed substrat (Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA), og Kodak røntgenfilm ( Genetisk Research Instrumentering Ltd, Braintree, Essex, UK) på en MediPhot 937 film udvikler (Colenta, Weiner Neustadt, Østrig), derefter digitalt scannet.

Bestemmelse af anti-tumor Aktivitet

Mus bærende HCT116 eller HT29 humane tumor xenografter blev randomiseret i behandlingsgrupper at undgå enhver skævhed og sikre inter-gruppe konsistens, og derefter behandlet ved oral sondeernæring med enten MCT køretøj (10 ml /kg), 1 mg /kg PD 0.325.901, 100 mg /kg GDC-0941 eller kombinationen af ​​1 mg /kg PD 0.325.901 og 100 mg /kg GDC-0941 én gang dagligt i 14 dage. Tumor volumen blev overvåget af kaliberen måling ved hjælp af ligningen

en

2 ×

b

/2, hvor

en

er den mindste måling og

b

den største. Data er præsenteret som median relative tumorvolumener (RTV), hvor tumorvolumen i hver mus på den oprindelige behandlingsdag (dag 0) er tildelt en RTV på 1. Tiden til RTV3 og RTV4 for hver enkelt tumor blev beregnet på basis på en standard punkt til punkt kurve med 1000 segmenter anvendelse af GraphPad Prism software (CA, USA). Mann Whitney U test blev anvendt til at sammenligne de forskellige grupper, dvs. kontrol

versus

hver behandlingsgruppe, de enkelte agenter

versus

hinanden, og hver agent

versus

deres kombination. Forskelle med ap værdi. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

[

18F] -FLT PET Studies

Før behandling og efter 2 dages behandling som beskrevet ovenfor, mus, der bærer HCT116 menneske tumorxenoplantater (7-9 mus /gruppe) blev bedøvet, kanyle

via

deres hale vene og placeres i liggende stilling på en skræddersyet opvarmet seng, der holdt tre mus på en gang, inden en mosaik PET-scanner (Philips, Eindhoven, NL). [

18F] -FLT blev opnået fra PETNET (PETNET, Nottingham, UK), og radioaktivitet blev målt ved hjælp af en Capintec godt counter (Capintec, NJ, USA). Ca. 10 MBq [

18F] -FLT blev indgivet intravenøst, og en 1 times dynamisk PET-scanning blev udført, består af ti 1 minut, seks fem minutter og to 10 minutter tidsrammer. Mus blev udvundet efter scanning og modtog fortsat behandling i resten af ​​undersøgelsen. Data blev analyseret ved anvendelse Imalytics software (Philips, Aachen, Tyskland); et 3D område af interesse blev trukket rundt om tumoren og den standardiserede optagelse værdi (SUV) blev beregnet ved at dividere vævskoncentration (MBq /ml) ved den injicerede dosis (MBq) /g legemsvægt. Mean SUV-værdier blev derefter plottet mod tid, og arealet under kurven (AUC) og den procentvise ændring i arealet under kurven i forhold til baseline scanningen blev beregnet. Parret t tests blev anvendt til at sammenligne dag 2

versus

de baseline SUV AUC-værdier for hver enkelt mus i hver behandlingsgruppe og forskelle med ap værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater.

farmakokinetik og farmakodynamik af PI3K og MEK-inhibitorer, som enkelte midler og i kombination, i HCT116 human tumorxenoplantater

En enkelt dosis PK /PD studie blev udført ved hjælp af PI3K inhibitor GDC-0941 og MEK inhibitor PD 0325901, som enkelte midler og i kombination, i HCT116 human tumor xenograft-bærende mus over et tidsforløb for 0.25-24 timer. Koncentrationerne af lægemidlerne i plasmaet og tumorvævet blev målt ved anvendelse af HPLC (figur 1 og tabel 1). Koncentrationer af GDC-0941 og PD 0.325.901 i plasmaet faldt over 24 timer efter en enkelt dosis af inhibitor (figur 1). En 10-fold forøgelse i GDC-0941 dosis, dvs. 100

versus

10 mg /kg, opnåede plasma AUC-værdier, der var 7 gange højere. I tilfælde af PD 0325901, en sammenlignelig stigning dosis, dvs. 10

versus

1 mg /kg, resulterede i en 15 gange stigning i plasma AUC (tabel 1). Koncentrationer af GDC-0941 og PD 0.325.901 i tumoren var mere variabel, og niveauer af PD 0.325.901 var målbart i plasma på 24 timer (detektionsgrænse: 100 nM) efter behandling med 1 mg /kg og i tumorvæv på alle tidspunkter (detektionsgrænse: 0,4 nmol /g tumor materiale eller 100 nM i tumor homogenatet fortyndet fire gange). Tumor GDC-0941 AUC værdier (tabel 1), viser, at der var en 15 gange stigning i AUC efter en 10-dobling i dosis.

Plasma og tumor koncentrationer af PI3K inhibitor GDC-0941 (GDC ) (a) og MEK-inhibitor PD 0.325.901 (PD) (B) målt ved HPLC i prøver fra HCT116 tumor xenograft-bærende mus i de angivne tidspunkter efter en enkelt po dosis på enten 100 mg /kg GDC-0941 alene, 1 mg /kg PD 0.325.901 alene eller kombinationen af ​​1 mg /kg PD 0.325.901 og 100 mg /kg GDC-0941. Data er præsenteret som den gennemsnitlige koncentration fra 3 mus i hver gruppe ± standardfejl. Den vandrette stiplede linje angiver

in vitro

GI

50 koncentration (tidligere bestemt i [38]).

Interessant, plasma AUC-data tyder på, at der kan være en beskeden stigning i koncentrationerne af PD 0325901 i plasmaet efter samtidig indgift med GDC-0941 (tabel 1), og selv om denne forskel var begrænset (2-3 gange), der var en konsekvent og statistisk signifikant forskel mellem AUC af PD 0325901 ved dosering alene på 1 eller 10 mg /kg PD 0325901, eller samtidig med 100 mg /kg GDC-0941 (p 0,01). GDC-0941 administration syntes også at have en effekt på tumor fastholdelse af PD 0.325.901, hvor det kunne måles (dvs. efter 10 mg /kg PD 0.325.901), da der var igen en statistisk signifikant forskel mellem tumor AUC efter dosering med 10 mg /kg PD 0325901 alene eller samtidig med 100 mg /kg GDC-0941 (p = 0,01). Men i modsætning til plasmaet data, efter kombinationsbehandling tumor koncentrationer af både PD 0325901 og GDC-0941 var, lavere end efter en enkelt behandling med middel, når en signifikant forskel blev observeret. Således forøget anti-tumoraktivitet observeret med kombinationen af ​​MEK og PI3K-inhibitorer (se nedenfor) skyldtes ikke en farmakokinetisk interaktion resulterer i øgede tumor lægemiddelniveauer. Samlet set farmakokinetiske data viser, at der ikke var nogen markante farmakokinetiske interaktioner (dvs. 3-gange ændring i AUC). Når GDC-0941 og PD 0.325.901 blev givet i kombination

Efter en enkelt dosis på 100 mg /kg GDC-0941, alene eller i kombination med 1 mg /kg PD 0.325.901, koncentrationer af GDC-0941 i plasma og tumor væv konsekvent overskredet den for

in vitro

GI

50 værdi på 1081 nM (tidligere bestemt i [38]) over 6 timer (figur 1A). Tilsvarende, efter en enkelt dosis på 1 mg /kg PD 0.325.901, alene eller i kombination med 100 mg /kg GDC-0941, koncentrationer af PD 0.325.901 i plasmaet konsekvent oversteg

in vitro

GI

50 værdi på 21 nM [38] i løbet af de første seks timer; dog niveauer var upåviselige i plasma efter 24 timer og i tumorvævet på alle tidspunkter (figur 1b). Ikke desto mindre, da detektionsgrænsen for PD 0325901 i både plasma ( 100 nM) og tumorvæv ( 0,4 nmol /g) var større end

in vitro

GI

50 værdi (21 nM) har de farmakokinetiske data ikke nødvendigvis, at farmakologisk aktive stof koncentrationer blev ikke opnået

Selv efter 1 mg /kg PD 0.325.901, koncentrationerne var under detektionsgrænsen i tumoren ( . 0,4 nmol /g), denne dosis var i stand til at reducere (1 time) og fuldstændigt ablatere (3 og 6 timer) phosphorylering af ERK1 /2, med meget lidt genopretning i 24 timer. Som forventet var der ingen markant effekt af PD 0325901 om AKT, S6 eller 4EBP1 fosforylering (figur 2A). GDC-0941 ved 100 mg /kg var tilstrækkelig til at forårsage en reduktion i phosphoryleringen af ​​AKT, S6 og 4EBP1 over tidsforløbet undersøgt, selvom reduktionen var ufuldstændig, og omfanget af inhibering varierede inden for grupper (figur 2B). Interessant nok var også en reduktion i phosphorylering af ERK1 /2 efter en dosis på 100 mg /kg GDC-0941. Kombinationen af ​​1 mg /kg PD 0.325.901 og 100 mg /kg GDC-0941 forårsagede tidligere fuldstændig inhibering af ERK1 /2 phosphorylering, sammenlignet med behandling med den enkelt middel MEK-inhibitor, og større hæmning af S6 og 4EBP1 phosphorylering sammenlignet med behandling med den enkeltstof PI3K inhibitor (Figur 2C). Der var imidlertid ingen markant forskel mellem inhiberingen af ​​AKT-phosphorylering med kombination sammenlignet med enkelt middel PI3K-inhibitor-behandling.

Virkning på MAPK og PI3K /AKT signaltransduktionsveje efter HCT116 tumor xenograft-bærende mus blev behandlet med en enkelt po dosis af enten 1 mg /kg af MEK-inhibitor PD 0.325.901 alene (A), 100 mg /kg af PI3K-inhibitoren GDC-0941 alene (B) eller en kombination af 1 mg /kg af MEK-inhibitor PD 0325901 og 100 mg /kg af PI3K-inhibitoren GDC-0941 (C). Efter 0.25-24 timer blev tumorer fjernet og lysater underkastet elektroforese, efterfulgt af Western blotting under anvendelse af det angivne phospho-specifikt antistof. Blots blev derefter strippet og re-probet med det tilsvarende totalt protein antistof for at bekræfte lig protein loading. A-C repræsenterer prøver fra de tre mus i hver behandlingsgruppe.

Effekten af ​​PI3K og MEK-inhibitorer, som enkelte midler og i kombination, i HCT116 og HT29 menneskelig tumorxenoplantater

baseret på resultaterne af PK /PD studie blev virkningen af ​​100 mg /kg af PI3K-inhibitoren GDC-0941 og 1 mg /kg af MEK-inhibitor PD 0.325.901 gives oralt som enkelte midler og i kombination, blev vurderet i HCT116 og HT29 human tumor xenograft-bærende mus (figur 3). De enkelte doser af PI3K og MEK-inhibitorer blev valgt til at være equi-aktiv, for at afspejle

in vitro

betingelser, hvorunder synergi tidligere var blevet påvist i disse cellelinjer [38]. I denne undersøgelse blev mus behandlet dagligt i 14 dage og tumorvolumener blev målt tre gange om ugen. Figur 3A og 3B viser, at behandling med 100 mg /kg GDC-0941 og 1 mg /kg PD 0.325.901, alene og i kombination, forårsaget tumorvækstforsinkelse sammenlignet med vehikelbehandlede kontrolgruppe tumorer, og denne forsinkelse vækst var større med kombinationen. Endvidere blev legemsvægt monitoreret dagligt for at vurdere tolerabiliteten af ​​terapien, og begge enkeltstof og kombinationsbehandlinger blev fundet at være ikke-toksiske, har dvs kropsvægt ikke falde til under 90% af udgangsvægten (figurerne 3C og 3D).

HCT116 (A, C, E) og HT29 (B, D, F) tumorxenografter blev behandlet med enten bærerkontrol, 1 mg /kg af MEK-inhibitor PD 0.325.901 og 100 mg /kg af PI3K inhibitoren GDC-0941 alene, eller 1 mg /kg af MEK-inhibitor PD 0.325.901 og 100 mg /kg af PI3K-inhibitoren GDC-0941 i kombination, po en gang dagligt i 14 dage. [A-B] Tumor vækstkurver: Data er præsenteret som median relative tumorvolumen (RTV), hvor væksten beregnes for hver tumor i forhold til dets størrelse på dag 0. punkter repræsenterer medianen af ​​de 10 mus i hver gruppe. Den stiplede linie viser det punkt, hvor tumorerne nåede fire gange det oprindelige volumen (RTV4). [C-d] Virkninger på legemsvægt: Data er præsenteret som en procentdel af udgangsmateriale kropsvægt. Punkter repræsenterer gennemsnittet af de 10 mus i hver gruppe ± standardfejl. [E-F] Tid før xenotransplantater at nå fire gange det oprindelige volumen (tid til RTV4): Data er præsenteret som den tid, som hver enkelt tumor i hver gruppe at firedoble i størrelse, og linjerne repræsenterer middelværdien af ​​musene i hver gruppe ± standardfejl. P-værdier er givet hvor kombinationen er signifikant forskellig fra enten agent alene (p ≤ 0,05).

Tiden for tumorer at firedoble i størrelse (tid til RTV4) blev beregnet (figur 3E og 3F og tabel 2), og statistiske analyser ved anvendelse af en Mann-Whitney-test viste, at der var en signifikant forskel mellem vehikelbehandlede kontrolgruppe tumorer og kombinationen (P 0,01) og mellem den enkelt middel inhibitoren og kombinationsgrupperne (p≤ 0,01), i begge HCT116 og HT29 tumor xenograftmodeller. Derudover var der en signifikant forskel mellem vehikelbehandlede kontrolgruppe tumorer og agenten inhibitorer i HCT116 tumorxenoplantater single (p 0,01), men ikke i HT29 tumorxenotransplantater på 5% niveau (p = 0,06)

.

[

18F] -FLT PET-scanning på dag 2 som en surrogat reaktion biomarkør for PI3K og MEK-inhibitor effektivitet som enkelte agenter og i kombination i HCT116 human tumorxenoplantater

Det har været foreslog, at [

18F] -FLT PET kan bruges som et surrogat biomarkør for tumor respons på behandlingen, og dynamiske PET scanninger blev derfor udført efter to dages behandling, på hvilket tidspunkt var der ingen signifikante forskelle i tumor volumen mellem kontrol eller nogen af ​​de behandlede grupper. Desværre, [

18F] -FLT optagelse af HT29 tumorer var lav, og denne tumor kunne ikke bruges til [

18F] -FLT PET undersøgelser. I modsætning hertil HCT116 tumorer var [

18F] -FLT ivrig og figur 4A-C viser, at der ikke var nogen forskel efter 2 dage i [

18F] -FLT tumor optagelse efter behandling med kontrol køretøj, 1 mg /kg PD 0325901 alene eller 100 mg /kg GDC-0941 alene, i forhold til baseline. Men der var et signifikant fald i [

18F] -FLT HCT116 tumoroptagelse efter 2 dages PI3K /MEK-inhibitor kombinationsbehandling (figur 4D).

[A-D] HCT116 tumor xenograft [

18F] -FLT optagelse i løbet 1 time dynamiske PET scanning ved baseline og efter behandling med enten vehikel kontrol (A) 100 mg /kg af PI3K-inhibitoren GDC-0941 alene (B), 1 mg /kg af MEK-inhibitor PD 0325901 alene (C) eller kombinationen af ​​1 mg /kg af MEK-inhibitor PD 0325901 og 100 mg /kg af PI3K-inhibitoren GDC-0941 (D), po en gang dagligt i 2 dage. Data er præsenteret som det gennemsnitlige standardiserede optagelse værdi (SUV), hvor koncentrationen af ​​bindevæv beregnes i forhold til injiceret dosis og kropsvægt. Punkter repræsenterer gennemsnittet for 5-7 mus i hver gruppe ± standardafvigelse. [E] Procentvis ændring HCT116 tumor xenograft [

18F] -FLT optagelse ved 1 time før og efter behandling med enten vehikel kontrol eller kombinationen af ​​1 mg /kg PD 0.325.901 og 100 mg /kg GDC-0941, p.o. en gang dagligt i 2 dage. Data er præsenteret som den procentvise ændring i arealet under kurven (AUC) i forhold til den tilsvarende baseline AUC, afledt af figurerne A-D, og ​​bjælker repræsenterer gennemsnittet for 5-7 mus i hver gruppe ± standardfejl. * Angiver, at [

18F] -FLT SUV AUC i kombinationen behandlede gruppe var signifikant forskellige efter 2 dages behandling i forhold til baseline (p 0,01).

Baseret på data i figur 4A-D, den procentvise ændring i området under [

18F] -FLT SUV

versus

(AUC) i HCT116 tumorer blev beregnet for hver enkelt mus. Figur 4E viser, at der ikke var nogen signifikant forskel (p = 0,95) mellem [

18F] -FLT optagelse ved baseline og efter 2 dages behandling i kontrollen eller enkeltstof PD 0325901- eller GDC-0941-behandlede mus. I modsætning hertil var der et statistisk signifikant fald på 18% i tumoren [

18F] -FLT optagelse efter 2 dage i PI3K /MEK-inhibitor kombination behandlede mus (p 0,005). Disse data viser, at ændringer i [

18F] -FLT optagelse forud virkninger på tumorvolumen, og at [

18F] -FLT PET er en gyldig tidlig surrogat respons biomarkør til detektering af forbedret effektivitet af kombineret PI3K og MEK-inhibitor behandling.

diskussion

Med nogle bemærkelsesværdige undtagelser, f.eks imatinib i behandlingen af ​​kronisk myeloid leukæmi og vemurafenib

BRAF

-mutant melanom, enkeltstof klinisk aktivitet med målrettede behandlinger er beskeden, formentlig på grund af tilstedeværelsen af ​​flere driver genetiske læsioner og den hurtige udvikling af resistensmekanismer. Kombinationer af målrettede behandlinger er derfor i vid udstrækning undersøgt. Men i udviklingen af ​​optimale kombinationer, konventionel metode kliniske forsøg har betydelige begrænsninger som det store antal lægemidler, patient numre kræves, og den tid, respons og overlevelse endpoints, der skal nås udelukker rettidig evaluering af alle potentielle kombinationer.