PLoS ONE: Intracellulær Propionibacterium acnes Infektion i kirtelepitel og Stromal Makrofager i prostata med eller uden Cancer

Abstrakt

Baggrund

De seneste rapporter om

Propionibacterium acnes

(

P. Acnes

) tyder på, at denne bakterie er fremherskende i prostata, er associeret med akut og kronisk prostata inflammation, og kan have en rolle i prostata carcinogenese.

Metoder

at evaluere den patogene rolle af denne indfødte bakterie, vi screenet for bakterien i radikal prostatektomi prøver vha enzym immunhistokemi med en roman

P. acnes

-specifikt monoklonalt antistof (PAL-antistof) sammen med et anti-nukleare faktor-kappa B (NF-KB) antistof. Vi undersøgte formalin-fikseret og paraffin vævssnit af radikal prostatektomi prøver fra 28 patienter med prostatakræft og 18 alders-matchede patienter kontrol med blærekræft, men uden prostatakræft.

Resultater

immunhistokemi med PAL antistof afslørede små runde organer inden visse ikke-kræft kirtelepitel og stromale makrofager i de fleste prostata prøver. Prostatakræft prøver havde højere frekvenser af enten cytoplasmatisk

P. acnes

eller nukleare NF-KB udtryk for kirtelepitel og højere antal stromale makrofager med

P. acnes

end kontrolprøver. Disse parametre var også højere i den perifere zone end i overgangszonen af ​​prostata, især i prostatacancer prøver. Nuclear NF-KB udtryk var hyppigere i kirtler med

P. acnes

end i kirtler uden

P. acnes

. Antallet af stromale makrofager med bakterien korreleret med graden af ​​kronisk inflammation i både PZ og TZ områder og med graden af ​​akut betændelse i TZ-området.

Konklusioner

immunhistokemisk analyse med et hidtil ukendt monoklonalt antistof til detektering

P. acnes

i prostata foreslået, at intraepithelial

P. acnes

infektion hos ikke-kræft prostata kirtler og inflammation forårsaget af bakterien kan bidrage til udvikling af prostatacancer

Henvisning:. Bae Y, Ito T, Iida T, Uchida K, Sekine M, Nakajima Y, et al. (2014) Intracellulær

Propionibacterium acnes

Infektion i kirtelepitel og Stromal makrofager af prostata med eller uden kræft. PLoS ONE 9 (2): e90324. doi: 10,1371 /journal.pone.0090324

Redaktør: Robert Hurst, Oklahoma University Health Sciences Center, USA

Modtaget: December 13, 2013; Accepteret: 29 Januar 2014; Udgivet: 28 februar 2014

Copyright: © 2014 Bae et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Japan Society for fremme af Science Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning 24659402 (YE). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den anden mest almindelige kræftform hos mænd over hele verden, med en anslået 900.000 tilfælde og 258.000 dødsfald i 2008 [1]. Mens flere risikofaktorer for prostatakræft er blevet identificeret, såsom etnisk oprindelse, alder, familie historie, og kost [2], den nøjagtige ætiologi af prostatakræft er fortsat ukendt. Mange nyere undersøgelser dokumenterer, at kronisk inflammation er en vigtig medvirkende faktor for prostata carcinogenese ved at forårsage DNA-skader, fremme cellulære omsætning, og skabe et væv mikromiljø, der øger celle replikation, migration og angiogenese [3], [4].

i den inflammatoriske reaktion, er transkriptionelle faktorer, såsom nuklear faktor-kappaB (NF-KB) aktiveres ved binding af mønster-genkendelse receptorer (Toll-lignende receptorer, nukleotid-bindende oligomeriseringsdomænet [NOD] lignende receptorer, og andre ), proinflammatoriske cytokinreceptorer (tumornekrosefaktor-α eller interleukin [IL] -1), og antigen-receptorer [5] – [8]. Selvom NF-KB ikke passer den klassiske definition af et onkogen, det er en kraftig aktivator af ondartet tilstand og regulerer ekspressionen af ​​målgener vigtige for celleproliferation, overlevelse, angiogenese, og vævsheling [8] – [12].

Udsættelse for miljøfaktorer, såsom smitstoffer, kosten kræftfremkaldende og hormonelle ubalancer, menes at føre til skade af prostata og udvikling af kronisk inflammation [3]. Nylige rapporter har vist, at

Propionibacterium acnes

(

P. Acnes

) er ofte påvist i prostatavæv fra patienter med prostatitis og prostatakræft, og at bakterien er associeret med akut og kronisk prostata inflammation og kan have en rolle i prostata carcinogenese [13] – [21]

P.. acnes

er en grampositiv, ikke-sporedannende, anaerob bacillus fundet overvejende Talgkirtel-rige områder af huden hos voksne [22]. Den oprindelige bakterie er også isoleret fra conjunctiva, mund, og tarm [23]. Historisk

P. acnes

blev anset for at have lav virulens, men blev for nylig vist sig at være det forårsagende middel i forskellige patologier.

P. acnes

er især impliceret i acne vulgaris [24], men bakterien kan også være forbundet med en række inflammatoriske tilstande, såsom endocarditis, fælles og centralnervesystemet infektioner, og sarcoidose [25] – [28].

Vi har tidligere rapporteret, at mange (71%) serotype kliniske isolater af

P. acnes

invadere epitelceller [29], og intraepithelial

P. acnes

infektion aktiverer NF-KB i både en NOD1- og NOD2-afhængig måde [30]. Trods akkumulere beviser for

P. acnes

infektion i prostata ved bakteriekultur eller polymerasekædereaktion metoder, er der kun få rapporter, hvori bakterien var placeret i prostatavæv ved in situ immunofluorescens metoder med et polyklonalt antistof mod

P. acnes

[31] eller flerfarvet fluorescens in situ hybridisering metoder rettet mod

P. acnes

23S rRNA [14].

For yderligere at undersøge ætiologiske sammenhæng mellem

P. acnes

og inflammation eller carcinogenese, ikke kun bakterien men også histologiske træk ved prostata væv skal analyseres i identiske histologiske snit. Formålet med den foreliggende undersøgelse var at lokalisere

P. acnes

i prostatavæv under lysmikroskopi af enzym immunhistokemi. Til dette formål har vi udviklet en ny anti

P. acnes

monoklonalt antistof, der reagerer med bakterierne i formalinfikserede og paraffin-embedded prostata vævssnit. For at evaluere den patogene rolle af denne oprindelige bakterie i udviklingen af ​​prostatacancer, undersøgte vi radikal prostatektomi prøver opnået fra patienter med eller uden prostatacancer ved immunhistokemi med det hidtil ukendte antistof til

P. acnes

og et antistof til NF-KB, der blev anvendt til at bestemme en mulig sammenhæng mellem

P. acnes

infektion og nuklear NF-KB udtryk i prostata kirtler. Desuden vi analyseret, om

P. acnes

infektion status var forbundet med risiko prostatakræft.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Tokyo Medicinsk og Dental University (CVR-nr 1373). Fordi Undersøgelsen omfattede immunfarvning af klinisk opnåede og arkiverede formalinfikserede og paraffinindstøbte vævsprøve, godkendte den etiske komité afkald på specifik informeret samtykke i overensstemmelse med etiske retningslinjer for kliniske studier (ændrede 31 juli 2008) af ministeriet for sundhed, arbejde og dyrevelfærd Japan. Dyret forsøgsprotokol anvendes i denne undersøgelse blev godkendt af Center for Eksperimentel Animal af Tokyo Medical og Dental University (registrering nr 0120203A) og blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i ovennævnte center.

Prøver

Vi undersøgte formalinfikserede og paraffin vævssnit af radikal prostatektomi prøver fra 28 patienter (alder: 50-78 år) med prostatakræft, som gennemgik kirurgi mellem 2008 og 2011 på Tokyo Medicinsk og Dental University Hospital, og fra 18 kontrolpatienter (alder: 50-80 år) med blærekræft, men uden prostatakræft, som blev opereret mellem 1994 og 2011 på det samme hospital. Patienter, der fik præoperativ behandling blev udelukket fra undersøgelsen. De clinicopathologic profiler af tilfældene er vist i tabel 1. Paraffinindstøbte vævsblokke blev udvalgt fra blokke forberedt til rutinemæssig patologisk undersøgelse. En vandret skåret sektion af prostata herunder verumontanum blev identificeret i hvert tilfælde, og prøverne blev indskrevet i undersøgelsen, når kræften spredt var begrænset til højre eller venstre lap i sektionen. En af de højre og venstre lapper i et afsnit fri af kræft blev analyseret for at undersøge fordelingen af ​​

P. acnes

og intraepithelial aktivering af NF-KB i ikke-cancervæv, og den anden lap blev analyseret for at detektere

P. acnes

i kræftvæv.

Produktion af monoklonalt antistof

En roman monoklonalt antistof blev udviklet for at lokalisere

P. acnes

i formalinfikserede og paraffin-embedded prostata vævssnit. Antistoffet blev frembragt ifølge protokollen beskrevet i et laboratorium manual [32] med modifikationer. BALB /c-mus (CLEA Japan, Tokyo, Japan) blev immuniseret med sonikerede hele bakterielt lysat af serotype I

P. acnes

isoleret fra human prostata i en tidligere undersøgelse [29]. Hybridoma cellelinier, der producerer anti-

P. acnes

antistoffer blev kontrolleret ved enzymkoblet immunosorbentassay med de bakterielle antigener anvendes som immunogener. Hybridomcellelinier med positive resultater blev screenet ved immunfarvning med formalinfikserede og paraffinindlejrede vævssnit af

P. acnes

-injiceret rottelever.

P. acnes

injiceret rottelever blev opnået ved intravenøs injektion af 30 mg varmedræbt

P. acnes

i Sprague-Dawley-rotter (CLEA Japan) 1 time, før aflivning rotten. Tilsvarende forberedt lever vævssnit af rotter injiceret af hver stamme af andre kontrol bakterier blev også undersøgt for at bekræfte specificiteten til

P. acnes

. Hybridomcellelinier, der producerer antistoffet, som genererede en stærk reaktion specifik for

s. acnes

i rottelever snit blev udvalgt og yderligere screenet ved immunfarvning med formalin-fikserede og paraffin-indlejrede prostata vævssnit af prøven fjernet ved prostatektomi, hvor et stort antal

P. acnes

blev dyrket i den tidligere undersøgelse [29]. Hybridomet der producerer antistof, som genererede den mest specifikke reaktionsprodukt mangler enhver krydsreaktivitet til humane prostatavæv, herunder lipofuscin pigmenter, blev udvalgt og klonet ved to runder af begrænsende fortynding. En enkelt hybridomklon blev derefter implanteret i intraperitoneal rum af alvorlig kombineret immundefekt-mus (CLEA Japan). Ved 1 eller 2 uger efter implantation, blev ascites opsamlet og anvendt som en ufortyndet antistof uden yderligere oprensning. Antistoffet blev opkaldt PAL.

Specificiteten af ​​PAL antistof blev undersøgt ved Western blot i overensstemmelse med den tidligere beskrevne metode [26] med serotype I

P. acnes

typen stammen (ATCC 6919 og ATCC 11827), serotype II

P. acnes

typen stamme (ATCC 11828), 19 kliniske isolater af

P. acnes Hotel (10 stammer af serotype I og 9 stammer af serotype II) fra prostata [29], andre kutan propionibakterier (

P. granulosum

ATCC 25.564,

P. avidum

, ATCC 25577, og

P. lymphophilum

ATCC 27520), og andre kontrol bakterier (

Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli

,

Bacteroides flagilis

, og

Enterrococcus faecalis

).

Immunhistokemi

Histologiske sektioner (3 um-tyk) blev skåret fra formalin-fikseret og paraffin-embedded vævsprøver og monteret på silan-coatede objektglas (Muto Pure Chemicals , Tokyo, Japan). Når alle dele blev de-paraffinized og rehydreret, blev de microwaved (Microwave Processor H2850, Energi Beam Sciences, East Granby, CT) i 40 minutter ved 97 ° C i 10 mmol /l citratbuffer (pH 6,0). Snittene blev derefter behandlet med 3% hydrogenperoxid i methanol i 10 min. Snittene blev først inkuberet med normalt hesteserum (Vectastain Universal Elite ABC Kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA) og derefter inkuberet natten over ved stuetemperatur med enten passende fortyndet PAL-antistof (1:60000) eller anti-NF-KB-antistof (1 :2000, EPITOMICS, Burlingame, CA), eller en blanding af disse to antistoffer til cocktail immunfarvning, i et fugtigt kammer. Snittene blev derefter inkuberet i 30 minutter med biotinyleret sekundært antistof, efterfulgt af 30 minutters inkubering med streptavidin-peroxidase-kompleks (Vectastain Universal Elite ABC Kit), både ved stuetemperatur. Før og efter hvert trin blev sektionerne vasket i phosphatbufret saltvand indeholdende 0,5% Tween-20. Signalet blev udviklet som et brunt reaktionsprodukt under anvendelse peroxidasesubstrat diaminobenzidin (HistofineSimplestain DAB opløsning; Nichirei Bioscience Inc., Tokyo, Japan). Alle prøver blev modfarvet med Mayers hematoxylin. Tilstødende sektioner blev også undersøgt med hæmatoxylin og eosin farvning for konventionel histopatologisk undersøgelse.

For samtidig identifikation af cytoplasmatisk

P. acnes

og nuklear NF-KB-ekspression i samme prostatavæv sektion, cocktail immunfarvning med en blanding af PAL-antistof og anti-NF-KB-antistof som det primære antistof blev udført i alle prøver. For at sikre pålideligheden af ​​denne metode blev to serielle sektioner af identiske prøver undersøgt ved cocktail immunfarvning og immunoenzyme dobbelt-farvning hhv. For immunoenzyme dobbelt-farvning blev snit først omsat med PAL-antistof anvendelse af avidin-biotin-kompleks fremgangsmåde med Vectastain ABC-AP kit (AK-5000, Vector) og vektoren Blå alkalisk phosphatase Substrate Kit III (SK-5300, Vector ), og derefter inkuberet i 5 minutter i denaturerende opløsning (denaturerende opløsning kit, BRR001DH, Biocare Medical) og yderligere inkuberet i 5 minutter i Dako REAL Peroxidase-blokeringsopløsning (S2023, Dako, Glostrup, Danmark). Efter disse procedurer, sektionerne undergik den sekundære reaktion med anti-NF-KB-antistof, efterfulgt af immunhistokemi hjælp af en polymer metode med EnVision + System-HRP Labelled Polymer (K4001, Dako) og HistofineSimplestain DAB Solution.

Den samme prøver, der anvendes til immunoenzyme dobbelt-farvning blev også analyseret ved immunfluorescens dobbelt-farvning at fænotype cellerne med intracellulær

P. acnes

anvendelse af antistoffer mod epitelceller og fagocytter; anti-cytokeratin monoklonalt antistof (AE1 /AE3, Dako) for epitelceller, anti-humant CD68-monoklonalt antistof (klon KP1, Dako) for makrofager, eller anti-humant fascin monoklonalt antistof (klon 55K-2; Dako) for dendritiske celler, i henhold til de tidligere beskrevne metoder [33].

for at bekræfte, at PAL-antistof ikke krydsreagerer med lipofuscin pigmenter, der ofte findes i prostata kirtler, immunofluorescensfarvning med eller uden PAL antistof blev sammenlignet ved hjælp af seriel prostata vævssnit og immunoenzyme farvning med PAL antistof blev efterfulgt af Fontana-Masson farvning eller fluorescens-mikroskopisk observation for identiske prostata vævssnit.

Evaluering af immunhistokemiske og histologiske fund

for at evaluere

P. acnes

infektion og nuklear NF-KB-ekspression i identiske histologiske snit blev lys-mikroskopiske billeder af sektionerne immunofarvede med en blanding af PAL-antistof og anti-NF-KB-antistof (cocktail immunfarvning) inkorporeret i virtuelle lysbilleder med Mirax MIDI BF /FL Digitizer for 12 Slides (Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Tyskland) og undersøges med Pannoramic Viewer 1.15 service Pack 2 (3DHISTECH, Budapest, Ungarn). Morfometrisk analyse af alle prostatakirtler indeholdt i sektionerne blev udført under høj effekt betragtning af de virtuelle objektglas. Hver prostata kirtel blev anset

P. acnes

-positiv når cytoplasmatiske positive signaler efter PAL-antistof blev observeret i mindst en epitelcelle af kirtlen. Som for nuklear NF-KB-ekspression, blev kirtlen anses for positivt, når nucleus-positive signaler blev observeret i mindst en epitelcelle. Cytoplasmatisk NF-KB-ekspression blev ikke betragtet som positive, fordi aktiveret NF-KB translokerer fra cytoplasmaet til cellekernen [34], [35]. Ifølge nærvær eller fravær af cytoplasmatisk

P. acnes

og nuklear NF-KB udtryk for hver kirtel, alle prostata kirtler (samlede antal kirtler per sektion spænder fra 933 til 5519 med en gennemsnitlig antal 2358) beliggende i de områder af perifere zone (PZ) eller overgangszone ( TZ) blev kategoriseret i fire grupper (

P acnes

/NF-KB:.. + /+, +/- – /+, og – /-), og kirtler kategoriseret til hver gruppe var præget af en anden farve på de virtuelle objektglas. Ifølge resultaterne er opnået ved de fire-gruppe klassificering, påvisning hyppigheden af ​​kirtler med enten cytoplasmatisk

P. acnes

eller nukleare NF-KB-ekspression blev beregnet for hvert enkelt tilfælde i PZ og TZ områder, hhv. Alle de prostata stromale celler med cytoplasmiske signaler fra PAL antistof blev talt i PZ og TZ områder, henholdsvis på den virtuelle slide sektioner, der blev immunofarvede med kun PAL-antistof. For at evaluere graden af ​​akut og kronisk inflammation, blev tilstødende sektioner undersøgt med hematoxylin og eosin-farvning og inddeles i fire kategorier (0, 1+, 2+, 3+) ifølge de kriterier, som Cohen et al. [13].

statistiske analyser

Frekvensen (%) af

P.acnes

-positive kirtler eller nukleare NF-KB-positive kirtler blev beregnet som antallet af positive kirtler divideret med antallet af samlede kirtler for hver patient; og antallet af

P. acnes

-positive makrofager blev talt for hver patient. Disse parametre blev opsummeret som median [25

th og 75

th percentiler] for hver PZ og TZ-området og sammenlignet mellem kontrol- og prostatakræft prøver ved hjælp af en Mann-Whitney U test. Parametrene i hver kontrol og prostatakræft prøve blev også sammenlignet mellem PZ og TZ områder ved hjælp af Wilcoxon svedet-rank test. Sammenhængen mellem disse parametre og kvalitet af akut eller kronisk inflammation blev analyseret under anvendelse af Spearman rang korrelationskoefficient. Kvalitet af akut eller kronisk inflammation blev også sammenlignet mellem kontrol- og prostatakræft prøver under anvendelse af en Mann-Whitney U test. Hyppigheden af ​​nukleare NF-KB udtryk i kirtler med

P. acnes

og kirtler uden

P. acnes

blev beregnet for hver patient, sammenfattes som median [25

th og 75

th percentiler], og sammenlignet ved hjælp af Wilcoxon svedet-rank test i PZ og TZ områder af kontrol- og prostatakræft prøver. Spearman rang korrelationskoefficient blev brugt til at vurdere sammenhængen mellem hyppigheden af ​​

P.acnes

-positive kirtler og antallet af

P. acnes

-positive stromale makrofager. Analyserne blev udført for PZ og TZ områder, hhv.

s

-værdier blev justeret for flere sammenligninger af Holms metode, hvor det er relevant. En

s

-værdi på mindre end 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant. StatView software (version 5,0; SAS Institute, Cary, NC). Blev anvendt til alle de statistiske beregninger

Resultater

Specificitet af monoklonalt antistof

PAL antistof reagerede med alle stammer af serotype i

P. acnes

og reagerede ikke med nogen stammer af serotype II

P. acnes

, anden kutan propionibakterier eller andre kontrol bakterier. Antistoffet genkendte et

P. acnes

-specifik epitop af lipoteichoinsyre almindeligvis deles af alle stammer af serotype I

P. acnes

.

Lokalisering af

P. acnes

i prostata

I de ikke-kræft prostata kirtler, PAL antistof reagerede med små runde organer i de epitelceller (figur 1). De små runde legemer blev observeret i hyperplastiske, normal, og atrofiske epitelceller, men oftere i hyperplastiske epitelceller (figur 2A-B) end i normale eller atrofiske celler (Figur 2C-D). I prostata stroma blev PAL-positive små runde legemer også påvist i makrofag-lignende celler, som er blevet distribueret tyndt i klynger i stroma. Disse celler viste sig i relativ høj tæthed nær de atrofiske kirtler, ledsaget af mononukleære inflammatoriske celler (Figur 2E-F). I nogle foci af alvorlig periglandular inflammation, makrofag-lignende PAL-positive celler infiltreret kirtler og blev til tider påvist i de luminale rum.

Antistoffet reagerede med små runde legemer (pile) i nogle ikke-kræft glandulær epitel celler.

Positive signaler fra antistoffet var hyppigere i kirtler med epitelial hyperplasi (A, B) end i normale eller atrofiske kirtler (C, D). I prostatas stroma blev positive signaler findes i makrofag-lignende celler ledsaget af mononukleære inflammatoriske celler (E, F). Et par positive signaler blev sjældent findes i nogle kræftceller (G, H). Større forstørrelse af området angivet med pilen er vist i det indsatte af hver figur.

Immunofluorescens dobbelt-farvning bekræftede, at alle af kirtel signaler detekteret af PAL-antistoffet var i cytoplasmaet i epitelcellerne farvet med anti-cytokeratin-antistof (AE1 /AE3) og alle de stromale signaler detekteret af PAL antistof i makrofager farvet med anti-CD68-antistof, men ikke med anti-fascin antistof (figur 3A-C). Lipofuscin pigmenter blev observeret i nogle prostata kirtler med intracellulær

P. acnes

. Disse lipofuscin pigmenter blev farvet mørk brun med Fontana-Masson og produceret stærk autofluorescens, og PAL-antistoffet ikke krydsreagerer med disse lipofuscin pigmenter (figur 3D-J).

Immunofluorescens dobbelt-farvning af

P. acnes

-positive celler i prostata væv (A-C). Grønt signal (FITC): PAL antistof; røde signaler (TRITC): anti-cytokeratin-antistof (A), anti-CD68 antistof (B), og anti-fascin antistof (C). Resultater af dobbelt-farvning er slået sammen i alle billederne. I prostata kirtler, alle

P. acnes

-positive signaler overlappede (gul) med cytokeratin-positive glandulær epitelceller (A). I prostata stroma, alle

P. acnes

-positive signaler overlappede (gul) med CD68-positive makrofager (B) og ikke overlapper på alle (grøn) med fascin-positive dendritiske celler (C). Immunfarvning med PAL antistof efterfulgt af Fontana-Masson-farvning (D). De fleste af de røde positive signaler ved PAL-antistof (pile) i prostata kirtler ikke overlapper lipofuscin pigmenter (pilespidser), der er mørkebrun med Fontana-Masson farvning. Immunoenzyme farvning af prostatavæv med eller uden PAL-antistof under anvendelse af seriel prostata vævssnit (E, F). Mange intracellulære mørke-brune signaler (pile) blev observeret i afsnittet med PAL antistof (E), men ikke sådanne signaler blev observeret i afsnittet uden antistof (F). Identisk del af prostata kirtel med eller uden immunoreaktive signaler med enzymet metode observeret af både lys og fluorescensmikroskopi (G-J). I den del af en prostata kirtel med mange positive antistof-signaler (pile) (G), lidt lipofuscin autofluorescens (pilespids) blev observeret i den identiske (H). I modsætning i den del af en prostata kirtel med ingen positive antistof-signaler (I), et større niveau af lipofuscin auto-fluorescens (pilespidser) blev observeret i den identiske område (J).

Vi også bekræftet, at afsløring resultaterne af cytoplasmatisk

P. acnes

og nuklear NF-KB-ekspression i prostata glandulær epitelceller var næsten den samme mellem immunoenzyme dobbelt-farvning og cocktail immunfarvning der blev anvendt til analyse af de virtuelle objektglas (figur 4). Samtidig evaluering af

P. acnes

og NF-KB-status i identiske sektioner ved cocktail immunfarvning afslørede en panoramisk fordeling af kirtler kategoriseret i fire grupper på de virtuelle slides (figur 5).

I dobbelt-farvning (venstre kolonne), de positive signaler detekteres af PAL-antistof (pile) og de positive nukleare signaler via anti-NF-KB-antistof (pilespidser) blev visualiseret ved blå og brune farver, hhv. I cocktail-farvning (højre kolonne), blev begge de positive signaler visualiseret ved den brune farve. Repræsentative kirtler, der blev kategoriseret i hver af fire grupper efter status intraepithelial

P. acnes

infektion og nuklear NF-KB-ekspression er vist i hver række. Resultaterne af disse parametre var det næsten samme mellem immunoenzyme dobbelt-farvning og cocktail immunfarvning. . NNF-KB: nukleare NF-KB

Venstre, prostatakræft prøve (A); højre, kontrolprøve (B). Røde cirkler, kirtler med både

P. acnes

og nuklear NF-KB-udtryk; gule cirkler, kirtler med

P. acnes

men ingen nukleare NF-KB-udtryk; blå cirkler, kirtler med nukleare NF-KB-udtryk, men ingen

P. acnes

; og hvide cirkler, kirtler med hverken

P. acnes

eller nukleare NF-KB-ekspression. Sorte linjer angiver grænsen mellem den perifere zone (PZ) og overgangszone (TZ). Samlet antal kirtler undersøgt af virtuelle slide analysator var 1894 i prøven (A) fra en af ​​prostatacancer patient og 1465 i prøven (B) fra en patient med blærekræft, men ingen prostatakræft. Bemærk, at flere røde og gule cirkler blev observeret i PZ område af prostatacancer prøve sammenlignet med både den PZ og TZ områder af kontrolprøven samt til TZ område af prostatacancer prøven.

Prostata kræftceller i de fleste tilfælde var negative for PAL-antistof, med tre undtagelsestilfælde (Figur 2G-H). Det besættelsesmagt område kræft kirtler med

P. acnes

infektion i hele området af kræft læsion i afsnittet var 5% i det ene tilfælde og mindre end 1% i de to andre tilfælde. PAL-positive stromale makrofager blev påvist i 13 (46%) af 28 kræft væv.

Detection hyppigheden af ​​

P. acnes

i prostata

intraepitelial

P. acnes

af de ikke-kræft prostata kirtler blev påvist i alle prøverne, og stromale makrofager med bakterien blev observeret i 27 af 28 kræft prøver og 14 ud af 18 kontrolprøver.

Den mediane [25

th og 75

th percentiler] frekvens (%) af prostata kirtler med intraepithelial

P. acnes

var 14,4 [8,8, 28,0] i PZ området og 4,9 [2,4, 9,1] i TZ området tumor prøver (figur 6A). I kontrolprøver, frekvensen var 4,3 [1,3, 8,1] i PZ området og 1,6 [1,1, 3,2] i TZ-området. Hyppigheden var signifikant højere i prøver kræft end i kontrolprøver i både PZ og TZ områder. I begge kræft og kontrolprøver, frekvensen var signifikant højere i PZ-området end i TZ-området.

Frekvens (%) af

P. acnes

-positive kirtler (A) eller nukleare NF-KB-positive kirtler (B), og det samlede antal

P. acnes

-positive stromale makrofager (C) i de perifere og overgangsbestemmelser zoner af prostatakræft (PCA) og kontrolprøver.

P

-værdier blev justeret for multiple sammenligninger (4 sammenligninger i hvert panel) ved Holms metode. NS:. Ikke signifikant

Den mediane antal stromale makrofager med

P. acnes

var 30 [10, 82] i PZ-området og 12 [3,35] i TZ-området af prøver kræft, mens det gennemsnitlige antal var 2 [0, 32] og 5 [0, 7] i kontrol prøver, henholdsvis (figur 6C). Antallet af stromale makrofager var signifikant højere i cancer prøver, end i kontrolprøverne i både PZ og TZ områder. I prøver cancer, antallet var signifikant højere i PZ område end i TZ-området. Antallet af

P. acnes

-positive stromale makrofager korrelerede med frekvenserne af

P. acnes

-positive kirtler i PZ område kræft prøver (Spearman rang korrelationskoefficient = 0,47,

s

= 0,015).

hyppigheden af ​​nukleare NF-KB udtryk

Detection

Nuclear NF-KB ekspression af glandulær epitelceller blev påvist i alle prøver. I cancer prøver, median frekvens (%) af NF-KB-positive kirtler var 17,1 [10,3, 31,4] i PZ området og 7,1 [2,8, 14,8] i TZ-området (figur 6B). I kontrolprøver, frekvensen var 7,3 [4,4, 11,1] i PZ-området og 4,4 [2,1, 11,3] i TZ-området. I PZ området, hyppigheden var signifikant højere i prøver cancer end i kontrolprøver. I prøver kræft, frekvensen var signifikant højere i PZ-området end i TZ-området.

Sammenhæng mellem

P. acnes

infektion og nuklear NF-KB udtryk

I prøver kræft, median frekvens (%) af nukleare NF-KB udtryk for kirtler med

P. acnes

var 27,6 [18,3, 47,5] i PZ-området og 14,0 [5,8, 25,6] i TZ-området, mens median hyppighed af kirtler med nukleare NF-KB-udtryk, men uden

P. acnes

var 15,9 [9,0, 27,2] i PZ området og 6,7 [2,7, 13,7] i TZ-området (figur 7A). I kontrolprøver, frekvensen i

P. acnes

-positive kirtler var 17,8 [8,9, 24,8] i PZ-området og 13,0 [1,3, 36,1] i TZ-området, mens frekvensen i

P. acnes

-negative kirtler var 7,2 [4,1, 10,9] på PZ-området og 4,1 [2,0, 10,7] i TZ-området (Figur 7B). Hyppigheden af ​​nukleare NF-KB udtryk var signifikant højere i

P. acnes

-positive kirtler end i

P. acnes

-negative kirtler i PZ og TZ områder i begge kræft og kontrolprøver.

Frekvens (%) af nukleare NF-KB udtryk i kirtler med eller uden cytoplasmatisk

P. acnes

i de perifere eller overgangszoner af prostatacancer (A) og kontrollere prostata (B) prøver.

P

-værdier blev justeret for multiple sammenligninger (2 sammenligninger i hvert panel) ved Holms metode.

Sammenhæng mellem betændelse og

P. acnes

infektion status eller NF-KB-aktivering

Grad af akut eller kronisk betændelse i PZ eller TZ områder af kræft og kontrolprøver er vist i figur 8. I både PZ og TZ områder, karakteren af inflammation var ikke signifikant forskellig mellem cancer og kontrolprøver. Karakteren af ​​akut eller kronisk inflammation korrelerede ikke med hverken hyppigheden af ​​kirtler med cytoplasmatisk

P. acnes

eller hyppigheden af ​​kirtler med nukleare NF-KB-udtryk.