PLoS ONE: den hæmmende virkning af doxycyclin på cisplatin-Sensitive og -bestandige epithelial æggestokkene Cancer

Abstrakt

Baggrund

Afsløring af en ny effektiv og hypotoxic anticancer narkotika er en spirende ny strategi for kræft kemoterapi. Doxycyclin (DC) er en slags antibiotika, men også hæmmer tumorigenese.

Metoder

MTT og celleinvasion assay, flowcytometri, blev western-blot-analyse og nøgne mus anvendes til at undersøge virkningerne og underliggende mekanismer af doxycyclin på epitelial kræft i æggestokkene celler

Resultater

doxycyclin hæmmede spredning og invasion af SKOV3 og SKOV3 /DDP.; induceret moderat apoptose af SKOV3 /DDP. CXCR4 ekspression både mRNA og protein niveauer blev nedreguleret i begge cellelinier, når de behandles med doxycyclin. Akt og ERK1 /2 var involveret i doxycyclin effekt på celleproliferation af SKOV3 men ikke af SKOV3 /DDP. Akt og EKR1 /2 phosphorylering blev aktiveret ved SDF-1α, som derefter blev inhiberet af doxycyclin i SKOV3. Pro-caspase-3-ekspression var betydeligt højere i SKOV3 end den SKOV3 /DDP, som blev opreguleret ved behandling med doxycyclin. In vivo, doxycyclin inhiberede peritoneal tumor xenograft og nedsat malign ascites.

Konklusion

Doxycyclin ikke kun har en inhiberende virkning på ovariecancer, men også kan øge følsomhed over for cisplatin. SDF-1α /CXCR4-regulerede Akt og ERK 1/2 aktiveringer er formentlig involveret i antitumorvirkningen af ​​doxycyclin på SKOV3 celler, mens opregulering af pro-caspase-3 kan være den vigtigste mekanisme er involveret i SKOV3 /DDP celler.

Henvisning: Wu W, Yu Lh, Ma B, Xu Mj (2014) hæmmende effekt Doxycyclin på cisplatin-Sensitive og -bestandige epithelial kræft i æggestokkene. PLoS ONE 9 (3): e89841. doi: 10,1371 /journal.pone.0089841

Redaktør: Han-Ming Shen, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, Singapore

Modtaget: Juli 20, 2013; Accepteret: 27 Jan 2014; Udgivet: 5 mar 2014

Copyright: © 2014 Wu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Videnskab og Teknologi Kommissionen for Shanghai kommune (nr 10411960100) og Changhai Hospital (nr CH125510105). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epithelial ovariecancer (EOC) tegner sig for over 90% af alle æggestokkene maligniteter og er primært en sygdom af postmenopausale kvinder, der forekommer hyppigst i sjette og syvende årtiers livet [1]. Den repræsenterer den mest almindelige dødsårsag blandt kvinder med gynækologiske maligniteter og den samlede 5-års overlevelse er kun 30% [2].

På nuværende standard behandling for kræft i æggestokkene involverer tumor debulking og platinbaseret kemoterapi [3]. Svaret på dette regime er mindst 70% af tilfældene, dog vil 60-80% af første respondenter tilbagefald inden for 18 måneder med en platin-resistent sygdom [4].

Cisplatin (DDP), en noncycle -afhængige cytotoksisk platin derivat, er ofte blevet brugt i forskellige solide tumorer, herunder gastrisk, testikelkræft, urologiske, hoved, hals, og ovariecancer [5]. Platinforbindelser udøver deres cytotoksiske effekt ved at danne intrastrand platin-DNA tværbindinger. Dette hæmmer DNA-replikation og i sidste ende fører til apoptose [6]. Men ligesom andre lægemidler mod cancer, cisplatin-resistens stadig en væsentlig hindring for dets kliniske succes. De fleste patienter med tilbagevendende kræft i æggestokkene i sidste ende vil udvikle platinresistent sygdom [7], hvilket gør tumorceller refraktære over for behandling. Derfor er det nødvendigt at søge nye økonomiske og effektive kemoterapi narkotika, som har antitumor aktiviteter og /eller øge antitumor svar til platinbaseret kemoterapi.

Doxycyclin (DC) er en slags anden generations tetracykliner, som er almindeligt anvendes til behandling af forskellige infektioner. Aktuelle undersøgelser har vist, at doxycyclin er en pluripotent lægemiddel, der påvirker mange anticarcinogenic funktioner, herunder anti-tumorvækst virkning på menneskers oral pladecellekræft og hæmning af migration af melanomceller [8] – [9]. Doxycyclin har også et potentiale for øget terapeutisk aktivitet af biologiske behandlinger mod kræft [10]. Men virkningen af ​​doxycyclin på epitelial kræft i æggestokkene celler og de underliggende mekanismer fortsat ukendt.

Derfor, i vores eksperiment, vi sigter mod at vise, at doxycyclin har en anticancer aktivitet på epitelial kræft i æggestokkene celler, og til yderligere at udforske de underliggende mekanismer involveret.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Alle procedurer i denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Second Military Medical University. Alle operation blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Cell kultur og reagenser

Humane æggestokkene kræftceller HO8910 blev opnået fra afdelingen for patofysiologi Second Military Medical Universitet. SKOV3 og dens beslægtede cisplatin-resistente celler SKOV3 /DDP blev opnået fra ATCC (American Tissue Culture Collection). SKOV3.ip celler blev leveret af Institut for Gynækologi og Obstetrik, Shanghai First Folkets Hospital (opnået fra ATCC). Celler blev opretholdt i RPMI-1640 medium med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære. Cisplatin, doxycyclin, SDF-1α, antistof mod β-actin blev indkøbt fra Sigma-Aldrich. Antistoffer mod CXCR4, fosfor-Akt, total Akt, phosphor-ERK, total ERK, MMP-2, MMP-9, blev caspase-3 indkøbt fra Cell Signaling Technology. Transwell kit blev købt fra BD, USA. ELISA-kit blev indkøbt fra R β-actin, 5-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 (fremad) og 5-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3 (revers). Real-time PCR blev udført under anvendelse af rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Sydney, Australien) i en 25-pi reaktionsblanding. 2 × Taq PCR Master Mix og 0,2 pmol /l hver primer blev anvendt. Real-time PCR blev optimeret ifølge de foreløbige eksperimenter for at opnå et lineært forhold mellem RNA-koncentrationen og PCR-produkter. Specificiteten af ​​primerne blev bekræftet ved at undersøge den smeltende kurve samt efterfølgende sekventering af real-time RT-PCR-produkter. Destilleret vand blev anvendt i stedet for cDNA som en negativ kontrol. Alle prøver blev normaliseret mod indvendig β-actin kontrol. Genekspression blev beregnet ved hjælp af sammenlignende tærskelcyklus (Ct) metode.

Western-blot-analyse

Som vi tidligere rapporteret [11], blev celler høstet og homogeniseret i kold lysebuffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% deoxycholsyre natriumsalt, 0,1% SDS og en proteasehæmmer blanding) under anvendelse af en homogenisator. Total proteinkoncentration blev bestemt ved Bradford-metoden under anvendelse af bovint serum som en standard. Lige store mængder proteiner blev separeret ved 10% SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid-membraner. Efter blokeret i blokerende buffer bestående af 20 mM Tris-HCI, pH 7.4,137 mM NaCl, 0,1% Tween 20 og 5% fedtfri mælk i 2 timer ved stuetemperatur blev membranerne inkuberet natten over ved 4 ° C i primært antistof (anti -β-actin 1:1000, anti-CXCR4 1:1000, anti-phosphor-Akt 1:1000, anti-total-Akt 1:1000, anti-phosphor-ERK 1:1000, anti-total-ERK 1:1000 , anti-MMP-2 1:1000, anti-MMP-9 1:1000). Blottene blev derefter inkuberet med HRP-konjugeret sekundært antistof (1:1000, Santa Cruz) i 2 timer ved stuetemperatur, og endelig visualiseret i ELC opløsning. I 1 min og eksponeret på Kodak film til 1-30 min. For kontrol af korrekt gel påsætning blev β-actin kvantificering anvendes. For at kvantificere Western blot-signaler, blev bandet densitet målt ved anvendelse UMAX PowerLook III og normaliseres med hensyn til kontrollen.

ELISA-assay

Mængderne af SDF-1 i de konditionerede medier blev bestemt ved anvendelse sandwich ELISA (følsomhed 15 pg /ml) i overensstemmelse med producentens protokoller.

Cell invasion assay

SKOV3 og SKOV3 /DDP celle invasioner blev vurderet ved anvendelse 24 brønde transwell cellekultur kamre med 8,0 um porestørrelse polycarbonat filterindsatse. Filtrene blev først overtrukket med BD matrigel. Stamopløsningen af ​​matrigel blev fortyndet under anvendelse af serum-frit RPMI-1640 medium (01:01). En mængde af fortyndet matrigel blev malet i hver filterindsats og opholdt ved stuetemperatur i 10-15 minutter for at tørre. Derefter blev dyrkede celler trypsiniseret og suspenderet i serum-frit RPMI-1640 medium ved en koncentration på 2 × 10

5 ml. I alt 500 pi 10% FBS /RPMI-1640 medium eller 500 pi 50 ng /ml SDF-1-opløsning blev tilsat til det nederste kammer og 100 pi cellesuspension blev påført overtrukne insert filtre. Kammeret blev inkuberet i 3 timer for at tillade cellevedhæftning derefter celler blev behandlet med doxycyclin. Kammeret blev inkuberet i 36 timer for at tillade celleinvasion; insertet blev derefter fikseret med dehydreret alkohol i 15 minutter, og derefter farvet med 0,1% krystalviolet i 15 minutter og vasket med 1 × PBS. De overflødige celler på den øvre eller nedre side af filteret blev skrabet. Membranen blev monteret på en rutsjebane og derefter undersøges under et mikroskop med 20 × forstørrelse. Invasion blev kvantificeret ved måling af farvede celler i tre tilfældige områder pr membran.

Flowcytometrisk analyse af celleapoptose

Celler blev opsamlet og dobbelt farvet med phycoerythrin-konjugeret Annexin V og PE ifølge den producentens anvisninger. Annexin V-positive celler blev anset apoptotisk, og deres procentdel af det samlede antal celler blev beregnet. Ti tusind hændelser blev indsamlet for hver prøve ved hjælp af en Becton Dickinson FACScan (flowcytometri Facility, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY), og data blev analyseret ved hjælp af Winlist programmet (VeritySoftware House, Topsham, ME).

siRNA transinfected teknologi

De målsekvenser for ERK var 5’GUGCUCUGCUUAUGAUAAUTT-3 ‘(sense) og 5’AUUAUCAUAAGCAGAGCACTT -3’ (antisense). AKT siRNA var: 5- GACGGGCACAUUAAGAUCATT-3 (sense) og 5- UGAUCUUAAUGUGCCCGUCTT -3 (antisense). Scramble siRNA-duplexer blev udformet (5- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 og 5- ACGUGACACGUUCGGAGAATT -3) som en negativ kontrol (NC). Celler blev transficeret med 25 nM mål-siRNA’er eller kontrol siRNA hjælp Xfect Transfektion Middel ifølge producentens anvisninger, og transfektion blev udført i 24 timer (for AKT og ERK). Efterfølgende blev dyrkningsmediet erstattet med 1640-medium suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS. Efter 48 timer blev MTT-assays udført for at vurdere cellernes levedygtighed.

peritoneal tumor xenograft i nøgne mus Salg

Nude (BALB /c-nu) mus (4 uger, 18-20 g, forudsat ved Chinese Academy of Science, Beijing) blev inddelt i tre grupper: en kontrolgruppe, en tumor gruppe og en doxycyclin-behandlede tumor gruppe. For tumoren gruppen injicerede vi SKOV3.ip celler til musene bughulen ved en tæthed på ca. 8 × 10

6 /ml. Cellerne blev resuspenderet i 400 pi serumfrit RPMI-1640 medium og derefter injiceres. For doxycyclin-behandlede tumor-gruppe, efter injiceret tumorceller i 14 dage, doxycyclin (3 mg /mus) blev i.p. injiceret hverdagen til at undertrykke tumorvækst. For kontrolgruppen blev mus behandlet med samme volumen PBS. Alle mus blev aflivet på dag 21 efter den første injektion. Mus vægt blev tumor størrelser og ascites evalueret i alle tre grupper.

Statistisk analyse

Alle data er vist som middelværdier ± S.E.M. Eksperimenter blev uafhængigt udført tre gange. Uparrede Students ‘test blev anvendt til to grupper af data. En måde ANOVA blev anvendt til flere sammenligninger (SPSS softwareversion 16,0), P-værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Doxycyclin hæmmer spredning af epitelial kræft i æggestokkene celler

.

Efter 48 timer behandling med cisplatin og doxycyclin i forskellige koncentrationer, blev cellelevedygtighed faldt på en dosis-afhængig måde i HO8910 (fig. S1A, B), SKOV3 (fig. 1A, C) og SKOV3 /DDP (fig. 1B, D). IC

50 af doxycyclin i SKOV3 blev sammenlignet med den i SKOV3 /DDP. Resultaterne viste, at IC

50 var 16,33 ug /ml i SKOV3 (fig. 1C) og 8.53 ug /ml i SKOV3 /DDP (fig. 1D) henholdsvis som indikerede, at SKOV3 /DDP-celler var mere følsomme over for doxycyclin behandling end SKOV3-celler.

SKOV3 (a, C) og SKOV3 /DDP (B, D) cellelevedygtigheden blev inhiberet på en dosis-afhængig måde ved behandling med cisplatin og doxycyclin. E viste F, at samtidig behandling med cisplatin (1,5 ug /ml og 2,5 ug /ml) og doxycyclin (10 ug /ml) havde en signifikant vækstinhibering i SKOV3-celler sammenlignet med virkningen af ​​cisplatin eller doxycyclin behandlet alene. G, viste H, at når de kombineres doxycyclin (2,5 og 5 ug /ml) med forskellige koncentrationer af cisplatin, IC

50 af cisplatin i SKOV3 /DDP-celler var 3,36 og 2,66 ug /ml. n = 9. *,

s

0,05; **,

s

0,01

Doxycyclin sensibiliserer ovariecancerceller at cisplatin

Vi har udført eksperimenter med co-anvendelse af cisplatin og doxycyclin.. Første vi valgt to lave doser (1,0 og 1,5 ug /ml) af cisplatin og kombineret med lav dosis doxycyclin (0-10 ug /ml) henholdsvis. I HO8910 cellelinie blev en signifikant inhibering af cellevækst iagttaget 48 timer efter co-anvendelse af 1,0 ug /ml (fig. S1c) eller 1,5 ug /ml (fig. S1D) cisplatin med 7,5 eller 10 ug /ml doxycyclin, mens cisplatin behandlet alene manglede effekten. De tilsvarende resultater er vist i SKOV3 cellelinje, med en signifikant inhibering af cellevækst, når man kombinerer 1,5 ug /ml (fig. 1E) eller 2,5 ug /ml (fig. 1F) cisplatin med 10 ug /ml doxycyclin. Dernæst valgte vi to doser (2,5 og 5 ug /ml) af doxycyclin og kombineret med forskellige koncentrationer af cisplatin (0-100 pg /ml) henholdsvis. IC

50 af cisplatin i nærvær af doxycyklin (2,5 og 5 ug /ml) blev 3,36 ug /ml og 2,66 ug /ml (fig. 1G, H), som var meget lavere end den for cisplatin alene (fig. 1C, IC

50 = 10,14 ug /ml).

cisplatin og doxycyclin inhiberer invasion evne epitelial ovariecancerceller

virkningen af ​​cisplatin og doxycyclin på invasionen evne af tumorceller blev undersøgt ved en invasion assay. For det første valgte vi 1,5 ug /ml og 5 ug /ml cisplatin til behandling SKOV3 og SKOV3 /DDP-celler henholdsvis. Fig. S2A, B repræsenterede tumorcelleinvasion evne i nærvær (c) eller fravær (d) af cisplatin i både SKOV3 og SKOV3 /DDP-celler. Vi fandt, at cisplatin havde en hæmmende virkning på ovarieceller invasion evne. Derefter valgte vi 10 ug /ml doxycyclin til behandling SKOV3-celler og 5 ug /ml doxycyclin til behandling SKOV3 /DDP-celler. Figur 2A, B repræsenterede tumorcelleinvasion evne i nærvær (c) eller fravær (d) af doxycyclin i både SKOV3 (fig. 2A) og SKOV3 /DDP (Fig. 2B) -celler. For første gang fandt vi, at doxycyclin kunne inhibere invasion evne både SKOV3 og SKOV3 /DDP-celler. Salg

Celler blev dyrket i trans-brønd med angivne doxycyclin i 36 /DDP-celler ved 4 og 2 folder hhv. a: 100 pi serumfrit cellesuspension (efter celler knyttet) med doxycyclin-behandlede (10 ug /ml) i overtrukne indsætte filtre; 500 pi serumfrit RPMI-1640 medium med doxycyclin (10 ug /ml) i de nedre kamre blev billeder fotograferet fra den øvre side af membranerne. b: 100 pi serumfrit cellesuspension i overtrukne indsætte filtre; 500 pi serumfrit RPMI-1640 medium i de nedre kamre blev billeder fotograferet fra den øvre side af membranerne. c: 100 pi serumfrit cellesuspension (efter celler knyttet) med doxycyclin-behandlede (10 ug /ml) i overtrukne indsætte filtre; 500 pi 10% FBS /RPMI-1640-medium i de nedre kamre blev billeder fotograferet fra den nedre side af membranerne. d: 100 pi serumfrit cellesuspension i overtrukne indsætte filtre; 500 pi 10% FBS /RPMI-1640-medium i de nedre kamre blev billeder fotograferet fra den nedre side af membranerne. c /a repræsenterer forholdet mellem celler kommer selvom membranen i filterindsatsen med doxycyclinbehandling. d /b er forholdet mellem celler kommer selvom membranen i filterindsatsen uden doxycyclin. C, viste D at Doxycyclin inhiberer SDF-1α-induceret invasion i begge cellelinier og en moderat apoptose induceret af doxycyclin i SKOV3 /DDP-celler og inhibering med doxycyclin på SDF-1α sekretion i SKOV3-celler. C: SDF-1α øget invasion af SKOV3-celler med 9 folder, som blev inhiberet af doxycyclin (10 ug /ml). D: SDF-1α kun steg invasionen af ​​SKOV3 /DDP-celler med 1,5 folder, som blev inhiberet af doxycyclin (5 ug /ml). n = 3, *,

s

0,05, **,

s

. 0,01

Doxycyclin hæmmer SDF-1α-induceret invasion af tumorceller i ovariecancerceller

SDF-1α er medlem af kemokiner og spiller en vigtig rolle i metastase af ovariecancer [12]. For at undersøge, om SDF-1α kunne fremme den invasive evne ovariecancerceller, vi derefter ændret den inducerede-faktor (10% FBS) til SDF-1α (50 ng /ml). Som vist i fig. 2C, SDF-1α øget invasion af SKOV3-celler med 9 folder, som kunne inhiberes signifikant med doxycyclin. Mens i SKOV3 /DDP-celler, SDF-1α i samme dosering kun øget invasion evne med 1,5 gange, hvilket også kunne inhiberes af doxycyclin (Fig. 2D).

Doxycyclin inducerer apoptose af SKOV3 /DDP men ikke af SKOV3 celler

apoptotiske forhold blev testet i to cellelinjer efter behandling med 5, 10 og 20 pg /ml doxycyclin for 12 timer. Som vist i figur 3A, doxycyclin (20 ug /ml) øgede apoptose af SKOV3 /DDP-celler ved 13 folder mens havde ingen virkning på SKOV

3-celler

A:. Flowcytometrisk analyse viser celleapoptosen efter behandling med forskellige koncentrationer af doxycyclin i 6 timer. 20 ug /ml doxycyclin øget apoptose af SKOV3 /DDP-celler ved 13 folder. B: ELISA-analyse, der viser doxycyclin (10 ug /ml) inhiberede sekretionen af ​​SDF-1α i SKOV3-celler i en tidsafhængig måde. Real-time PCR og Western blot-analyse, der viser virkningerne af doxycyclin på CXCR4 ekspression i både mRNA og protein niveauer i SKOV3-celler (C, E) og SKOV3 /DDP-celler (D, F). Efter behandling med doxycyclin af angivne koncentrationer i 48 timer, CXCR4 ekspression i både mRNA og protein-niveauer blev signifikant inhiberet i to cellelinjer. n = 3. *,

s

0,05, **,

s

. 0,01

Doxycyclin hæmmer SDF-1α sekretion i SKOV3 celler, men ikke i SKOV3 /DDP-celler

Som SDF-1α og dens receptor CXCR4 spiller en vigtig rolle i processen med tumorinvasion og metastase [13], vi derefter udført ELISA-assay for at bestemme, om doxycyclin kunne hæmme sekretion af SDF-1α i to cellelinjer. Resultaterne viste, at i SKOV3 blev SDF-1α sekretion signifikant nedsat ved behandling af doxycyclin i en tidsafhængig måde, med den minimale niveau observeret ved 180 min (fig. 3B). Imidlertid sekretion af SDF-1α blev ikke påvist i SKOV3 /DDP.

Doxycyclin nedsætter CXCR4 mRNA og protein niveauer i SKOV3 og SKOV3 /DDP-celler

CXCR4 kunne aktiveres af SDF-1α og er den eneste af 14 kemokinreceptorer udtrykt i en undergruppe af tumorceller i ovariale neoplasmer og primære ovarietumorer [14]. I vores eksperimenter blev celler behandlet med forskellige koncentrationer af doxycyclin i 48 timer, derefter CXCR4 mRNA og proteinniveauer blev undersøgt af Real-time PCR og western blot-analyse. Vi fandt, at doxycyclin inhiberede CXCR4 ekspression ved begge mRNA (fig. 3C. D) og proteinniveauer (fig. 3E, F) i begge SKOV3 og SKOV3 /DDP-cellelinier.

Cisplatin og Doxycyclin inhiberer cellernes levedygtighed gennem Akt og ERK veje i SKOV3 men ikke i SKOV3 /DDP celler

Det er blevet rapporteret, at cisplatin modstand menneskelig ovariecancer er relateret til aktivering af PI3K /Akt og ERK1 /2 signalveje [15] – [16 ], vi derefter bestemt den potentielle inddragelse af disse to veje i cisplatin og doxycyclin virkninger på ovariecancer celleproliferation. Efter depletterende Akt og ERK af siRNA (Fig. 4A, B), viste MTT resultater som reduktion af Akt og ERK-ekspression kunne dæmpe inhiberende virkning på proliferation, når de behandles med cisplatin og doxycyclin i 48 timer i SKOV3 (fig. 4C, D , G, H), men havde ingen virkning på proliferation af SKOV3 /DDP-celler (fig. 4E, F, i, J).

Reduktion af Akt og ERK-ekspression ved Akt og ERK siRNA kunne dæmpe inhiberende virkning på proliferation, når de behandles med cisplatin og doxycyclin i 48 (C, D, G, H), men havde ingen virkning på proliferation i SKOV3 /DDP-celler (E, F, i, J) *,

s Restaurant **,

s

. 0,01

Doxycyclin hæmmer SDF-1α-induceret aktivering af Akt eller ERK i SKOV3 men ikke i SKOV3 /DDP

I for at forstå, om SDF-1α-induceret Akt og /eller ERK-phosphorylering i to cellelinier kan inhiberes af doxycyclin, udførte vi en række eksperimenter med forbehandling. Først undersøgte vi phosphorylering af Akt og ERK i SKOV3 efter SDF-1α behandling (50 ng /ml) i forskellige tidsrum (0, 2, 5, 10, 20, 40 min). Som vist i fig. 5A, B, SDF-1α stimuleret Akt og ERK-phosphorylering i en tidsafhængig måde. Akt og ERK var signifikant phosphoryleret og nåede et maksimum på 10 eller 20 minutter efter SDF-1α behandling. De tilsvarende forsøg blev derefter udført i SKOV3 /DDP. Især var der ingen aktivering af Akt og ERK efter behandling af SDF-1α (data ikke vist). Yderligere har vi afkortet behandlingstiden til mindre end 10 min. Vi stadig ikke finde nogen aktivering af Akt (fig. 5C), mens ERK-aktivering blev forøget fra 0,5 minutter og nåede et maksimum på 1 min (fig. 5D). Dernæst SKOV3-celler blev forbehandlet med doxycyclin (0, 5, 10 ug /ml) i 3 timer, og derefter blev påført med SDF-1α (50 ng /ml) i 10 minutter. Inhibering af fosfor-Akt og fosfor-ERK-niveauer blev observeret efter anvendelse af 10 ug /ml doxycyclin (Fig. 5E, F). Anvendelse af doxycyclin alene havde ingen virkning. Tilsvarende SKOV3 /DDP-celler blev forbehandlet med den samme dosis af doxycyclin i 3 timer, og derefter behandlet med SDF-1α (50 ng /ml) i 1 min. Doxycyclin havde ingen virkning på Akt aktivering (fig. 5G). SDF-1α-induceret ERK phosphorylering kunne ikke blokeres af doxycyclin i en dosis på 5 eller 10 ug /ml. (Fig. 5H).

Efter behandling af SDF-1α (50 ng /ml) i 0, 2, 5, 10, 20, 40 minutter, AKT (A) og ERK (B) phosphorylering i SKOV3 celler blev forøget. Når de behandles SKOV3 /DDP med den samme dosis af SDF-1α i 0, 0,5, 1, 2, 5, 10 minutter, AKT phosphorylering (C) ændrede ikke, mens ERK-phosphorylering (D) blev augmented betydeligt. Derefter blev celler forbehandlet med 0, 5, 10 ug /ml doxycyclin i 3 timer, derefter behandlet med SDF-1α (50 ng /ml) i 10 minutter (SKOV3) eller 1 min (SKOV3 /DDP), SDF-1α- induceret AKT (E) og ERK (F) phosphorylering i SKOV3-celler blev kun inhiberet ved samtidig anvendelse med doxycyclin ved dosis 10 ug /ml. I SKOV3 /DDP-celler, havde SDF-1α fremprovokere AKT phosphorylering (G) og forbedret ERK phosphorylering (H) kunne ikke blokeres af doxycyclin på dosis 5 eller 10 ug /ml. n = 3. *,

s

0,05, **,

s

0,01, SDF-1a-behandlede grupper

vs

kontrolgruppe. #,

s

0,01, SDF-1a plus doxycyclin co-behandlede grupper

vs

SDF-1 behandlede grupper

Doxycyclin opregulerer pro-caspase-. 3-ekspression i SKOV3 /DDP, men ikke i SKOV3

Caspase-3 er en vigtig mediator af apoptose og kunne også være forbundet med kemoresistens af human ovariecancer [17]. Vi derefter observerede ændringer i sit udtryk i to cellelinjer efter doxycyclin behandling. For det første, vi sammenlignet Akt, ERK fosforylering, CXCR4 og pro-caspase-3-ekspression mellem to cellelinjer. Resultaterne viste, at der var ingen signifikant forskel af Akt-phosphorylering (fig. 6A). ERK-phosphorylering, CXCR4 og pro-caspase-3-ekspression i SKOV3 /DDP blev alle lavere end i SKOV3-celler, (fig. 6B, C, D). Derefter behandlede vi to cellelinjer med 10 ug /ml doxycyclin for forskellige tidsrum (0, 0,5, 1, 2, 6, 12 h). Som vist i fig. 6E, pro-caspase-3-ekspression blev øget betydeligt i SKOV3 /DDP, mens ikke ændrede i SKOV3.

Sammenligning af Akt, ERK, CXCR4 og pro-caspase-3 ekspression i to cellelinjer. Der var ingen signifikant forskel af Akt (A) phosphorylering i de to cellelinier. ERK phosphorylering (B), CXCR4 (C) og pro-caspase-3 (D) ekspression i SKOV3 /DDP-celler var alle lavere end i SKOV3-celler, hhv. Pro-caspase-3-ekspression blev øget signifikant ved doxycyclinbehandling i SKOV3 /DDP-celler, mens ikke ændrede i SKOV3-celler (E). n = 3. *,

s

0,05, **,

s

. 0,01

Doxycyclin hæmmer tumor xenograft

som et forsøg på at fastslå, om doxycyclin bidrager til tumorinhibering in vivo anvendte vi SKOV3.ip xenograftmodel i nøgne mus (BALB /c-nu). Fjorten dage efter injektion af tumorceller, doxycyclin (i.p. injektion) blev derefter administreret (3 mg /d /pr mus) i de næste 7 dage. Tumor diametre, mus kropsvægt og ascites niveauer i tumor gruppe og doxycyclin-behandlede gruppe blev analyseret. Sammenlignet med dem i tumor gruppe, blev tumoren diameter og mængden af ​​ascites faldt betydeligt i doxycyclin-behandlede gruppe (fig. 7B, C, F, G). Graden af ​​aggregering af tumorceller i doxycyclin-behandlede gruppe (fig. 7E), var mindre end den, tumor gruppe (fig. 7D). Desuden kropsvægt i doxycyclin-behandlede gruppe var tilgang til at i kontrolgruppen (fig. 7H).

(A) fra den udvendige udseende, blev abdomen tumor gruppe svulmende naturligvis (b) end én i kontrolgruppen (a), og den i doxycyclin-behandlede gruppe (c). Doxycyclin inhiberede væksten af ​​tumor xenograft (B, F) og mængden af ​​maligne ascites (C, G) betydeligt i doxycyclin-behandlede tumor-mus sammenlignet med dem for tumor mus. (D) HE-farvning viste, at graden af ​​aggregering af tumorceller i doxycyclin-behandlede gruppe (E) var meget mindre end i tumor gruppe. (H) Det kropsvægt i tumor-gruppen var signifikant lavere end enten kontrolgruppe eller doxycyclin-behandlede gruppe. n = 6. **,

s

. 0,01

Diskussion

Cisplatin er et kemoterapeutisk stof for kræft i æggestokkene. Udover de alvorlige bivirkninger, cisplatin-resistens er også en stor hindring. Kombination af nogle uskadelige komponenter med kemoterapi narkotika er en spirende ny strategi for cancer kemoterapi til yderligere at forbedre effektiviteten og for at minimere bivirkningerne. Doxycyclin er bredt accepteret som et antibiotikum. I vores eksperimenter, vi påvist, at doxycyclin ikke blot har en inhiberende virkning på ovariecancer, men også kan dramatisk forbedre kemosensitivitet til cisplatin.

Men den underliggende mekanisme er stadig uklar. Nogle undersøgelser har rapporteret, at antitumorvirkningen af ​​doxycyclin er forbundet med forskellige niveauer af p53 i hepatocellulært carcinom [18]. En anden undersøgelse viser, at doxycyclin kan inducere apoptose i humane pancreas og colon cancerceller gennem caspase-afhængig måde [19] – [20]. Vores resultater, for første gang, viste, at doxycyclin inhiberede sekretionen af ​​SDF-1α i SKOV3, mens lignende fænomen blev ikke observeret i SKOV3 /DDP-celler. Yderligere forskning viste, at doxycyclin inhiberede ekspression af CXCR4 på både mRNA og protein niveauer, hvilket antyder dens virkning kan være i transkription niveau. Western blot analyse viste også, at CXCR4 udtryk i SKOV3 /DDP var 20% lavere end i SKOV3. Disse resultater antydede, at SDF-1α /CXCR4 aksen kan have forskellige roller i doxycyclin effekter i de to cellelinier. Flere forklaringer kan bidrage til dette fænomen: 1) Ved aktivering kan CXCR4 mediere tumormetastase. Tumorceller ind blod- eller lymfesystemet vil migrere og overholde områder med høj ekspression af SDF-1α. Brystcancerceller følge dette mønster af metastase [21]. Her beskriver vi, at SKOV3 celler kan hemmelig SDF-1α og det har højere ekspression af CXCR4. Endvidere SDF-1α fremmer invasion af SKOV3 ved ni-fold. Baseret på disse data, vi postulerede SDF-1 /CXCR4 akse spillet en afgørende rolle i metastase af SKOV3-celler ved at øge adhæsion evne af cancerceller, men SKOV3 /DDP måske ikke. 2) Nogle andre undersøgelser viste, at epigenetiske mekanismer involveret i den negative regulering af SDF-1α eller CXCR4 udtryk kan være nødvendigt for tumor metastase. Typisk modifikation af SDF-1α eller CXCR4 såsom DNA methylering er forbundet med inaktivering af tumorsuppressorer. Der er tegn på, at methylering af SDF-1α promotor i tyktarmsepitelet fremmer metastase af tumorer i tyktarmen [22]. Derudover i pancreascancer, er fundet, CXCR4-promotoren reguleres af DNA-methylering, hvilket resulterer i lavere CXCR4 mRNA og protein niveauer [23].

p

0.01.

doi:10.1371/journal.pone.0089841.s002

(TIF)

Acknowledgments

All