Abstrakt
Baggrund
Viral-medieret onkolyse er en roman kræft terapeutisk tilgang med potentiale til at være mere effektive og mindre toksiske end nuværende terapier grund af agenter selektiv vækst og amplifikation i tumorceller. Til dato har disse midler været meget sikkert i patienter, men har generelt ikke levet op til deres forventede terapeutiske værdi som monoterapier. Derfor er der behov for nye tilgange til at generere højpotente onkolytiske virus. For at imødekomme dette behov, vi udviklet en ny metode, som vi udtrykket “Directed Evolution” for at skabe højpotente oncolytiske virus.
Metode /vigtigste resultater
Tager “Directed Evolution” tilgang, viral mangfoldighed blev øget ved at samle en vifte af serotyper, så passage puljer under forhold, der inviterer rekombination mellem serotyper. Disse meget forskellige virale puljer blev derefter anbragt under stringent adresseret selektion til at generere og identificere højpotente midler. ColoAd1, et kompleks Ad3 /Ad11p kimære virus, var den oprindelige onkolytiske virus afledt ved denne hidtil ukendte metodik. ColoAd1, den første beskrevne ikke-Ad5-baserede onkolytiske annonce, er 2-3 logs mere potent og selektiv end moderselskabet serotyper eller den mest klinisk avancerede onkolytiske Ad, ONYX-015,
in vitro
. ColoAd1 effekt af blev yderligere testet
in vivo
i en tyktarmskræft levermetastaser xenograftmodel efter intravenøs injektion og dens
ex vivo
selektivitet blev demonstreret på kirurgisk-afledte humane kolorektale tumorvæv. Endelig er vi demonstreret evne til at bevæbne ColoAd1 med et exogent gen oprettelse potentiale til at påvirke behandlingen af kræft på flere niveauer fra en enkelt agent.
Konklusioner /Betydning
Brug af “Directed Evolution “metoden, har vi frembragt ColoAd1, en hidtil ukendt kimært onkolytisk virus.
In vitro,
dette virus viste en 2 log stigning i både potens og selektivitet i forhold til ONYX-015 på tyktarmskræft celler. Disse resultater blev yderligere understøttet af
in vivo
og
ex vivo
undersøgelser. Desuden er disse resultater valideret denne metode som en ny generel indstilling til at aflede klinisk relevante, højpotente anti-cancer virotherapies
Henvisning:. Kuhn I, Harden P, Bauzon M, Chartier C, Nye J, Thorne S, et al. (2008) Directed Evolution Genererer en Novel onkolytisk Virus til behandling af tyktarmskræft. PLoS ONE 3 (6): e2409. doi: 10,1371 /journal.pone.0002409
Redaktør: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Kina
Modtaget: Februar 15, 2008; Accepteret: April 30, 2008; Udgivet: 18 Jun 2008
Copyright: © 2008 Kuhn et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Disse undersøgelser blev støttet i deres helhed af Bayer Healthcare Farmaci
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
udviklingen af effektive behandlinger for menneskets fast tumorer er fortsat en stor udfordring for kræftforskere og onkolog ens. Dette skyldes kompleksiteten af humane solide tumorer, med flere, undertiden redundante, interagerende signalveje [1], patientpopulation forskelle [2], og evnen til at tilegne sig modstand mod behandlinger, herunder den nyudviklede målrettede molekylære behandlingsformer såsom erlotinib, gefitinib, og imatinib [3]. Følgelig nye midler, med unikke virkningsmekanismer i stand til at konfrontere denne kompleksitet, er nødvendige.
oncolytiske vira er unikke anticancermidler stand til at amplificere input dosis gennem replikation i en tumor-afhængig måde. Human adenovirus (Ad) er en af en række af vira, der udvikles som onkolytiske midler til behandling af humane maligniteter [4]. Tidlige kliniske forsøg og prækliniske undersøgelser har vist synergi af denne type roman kræftbehandling med standard for pleje kemoterapi [5] og stråling [6], [7], [8]. Men mens de onkolytiske Annoncer afprøvet i kliniske forsøg har vist markant sikkerhed, har de vist begrænset klinisk effektivitet som monoterapier [9], [10], [11], [12]. Derfor er flere tilgange blive undersøgt for at øge deres styrke (defineret som virus evne til at replikere, lysere celler, og spredning), herunder at øge effektiviteten af cellelysis [13], [14], [15], [16], [17], [18], infektivitet [19], og “bevæbne” dem med terapeutiske transgener [20].
Der er 51 definerede menneskelig ad serotyper, grupperet a-F og disse serotyper varierer på en række niveauer (f.eks patologi i mennesker og gnavere, hemagglutinatin egenskaber, cellulære receptorer). Men bortset fra fiber ændringer [19], alternative humane Ad-serotyper til brøndens studerede Ad5 serotype er blevet ignoreret. alternative serotyper kan således udgøre en uudforsket vej til at udvikle mere potente virotherapies.
At udforske deres potentiale fuldt ud, vi ansat en metode vi udtrykket “Directed Evolution”, hvor puljer af Ad-serotyper, der repræsenterer de forskellige Ad undergrupper, passeres på humane tumorcellelinier repræsenterer større fast tumor indikationer (bryst, colon, pancreas, prostata) at invitere rekombination og udvælgelse af potente virale varianter eller serotyper. Denne enkle, ikke-fordomsfulde tilgang udnytter kompleksiteten af den menneskelige tumor celle til at lede udviklingen af udvalgte, højpotente Annoncer fra poolen og er meget tiltalende, da det kan være rettet mod et resultat (fx at udvikle en mere lytisk virus) med forbehold mod mekanisme (r), kan være ansvarlig for dette resultat (f.eks effektivitet cellelyse, infektivitet, viral DNA-replikation). ColoAd1, et virus isoleret fra tyktarmen cellelinien-passeret virus pool, frembydes potens bedre end Ad5 om en række colontumorcellelinier, og en bredere terapeutisk vindue på en samling af colon tumor linjer og primære normale celler end den nyligt godkendte og markedsført virotherapy, ONYX-015 /H101 [21]. Den overlegne styrke blev yderligere demonstreret
in vivo
i en lever tumor seeding model og selektiviteten blev valideret på klinisk fjernet tyktarmskræft væv. Desuden viser vi, at vi kan “arm” denne roman agent ved at indarbejde transgener i det virale genom uden at kompromittere styrken af midlet, hvilket øger potentialet i dette middel til at håndtere kompleksiteten i humane solide tumorer. Dette er den første beskrivelse af en ikke-Ad5 baseret onkolytiske Ad, og udnyttelse af alternative Ad serotyper markerer en ny tilgang til udviklingen af mere potente og selektive onkolytiske virus til behandling af humane kræftformer.
Resultater
Directed Udviklingen i puljede adenovirusserotyperne på forskellige tumorcellelinier stammer tydeligt forskellige virale puljer, der er overlegne i styrke til Ad5
Directed Evolution strategi skitseret i Materialer og metoder (Figur 1
A
) er en fordomsfri tilgang til at afgøre, om alternative serotyper eller rekombinanter deraf er overlegne i styrke til Ad5 (serotype alle aktuelle onkolytiske Ads) på menneskelige kræftceller. Som en lav opløsning metode til at spore ændringer under passage af det virale pool og at beskrive den homogene /heterogene karakter af den endelige virus-pool, blev i pools undersøges fra TMAE anionbyttersøjle udnytte virale capsid charge forskelle forbundet med hver serotype (figur 1
B
). Hver viral pool indsamlet fra de forskellige cellelinier efter passage 20 eluerede som en enkelt top med distinkt retentionstid (figur 1
C
). Hver elueringstoppen af en passerede viral pulje syntes at spore med en af de oprindelige serotyper (Figur 1
B
). Dette antyder, at alle vira ikke er ens i deres styrke på en given tumor cellelinie og at forskellene i tumorcellelinier kan selektere for bestemte vira i en blandet virus pool. Da mindst to af disse udvalgte virale puljer ikke spore med Ad5 opholdstid er Ad5 ikke (baseret på potens) den bedste virus til afledning alle onkolytiske annoncer.
A,
Repræsentation af målrettet evolution (se materialer og fremgangsmåder til detaljerede beskrivelse).
B,
kromatogrammer af hvert rent Ad serotype indgår i blandede serotype start pulje, hvorfra ColoAd1 blev valgt.
C, Salg kromatogrammer af passagen 20 virale pools afledt af den HT-29, Panc-1, MDA-231 og PC-3 tumorcellelinier henholdsvis. De forskellige retentionstider af disse puljer er i overensstemmelse med den fremherskende serotype af puljen bliver Ad5 eller Ad40 for Panc-1 pulje, Ad11p for HT-29 pulje, Ad3 eller Ad4 til PC-3 pulje, og Ad5 eller Ad40 for MDA-231 pool.
En MTS-analysen blev anvendt til at sammenligne styrken af de forskellige udvalgte virale puljer til den oprindelige blandet serotype pool og Ad5. Alle valgte virale pools steg i styrke i forhold til Ad5, eller den første pool, med størrelsen af stigningen varierer betydeligt mellem puljer. Den største stigning i styrke i forhold til Ad5 blev observeret i puljen passeret på tyktarmen tumorcellelinie HT-29 (ca. 2 log stigning) med den mindste stigning (1,2 fold) bemærkede i puljen afledt fra passage på MDA-231mt1 celle linje (tabel 1).
ColoAd1 er en yderst potent og selektiv onkolytiske virus
Da den virale pool passeret på HT-29-celler viste den største stigning i styrke på dets modsvarende celle line, blev virus i denne pulje forfølges for yderligere karakterisering. Individuelle plak-oprenset virus blev isoleret og screenet ved MTS-assay for deres lytiske potentiale på HT-29 tumor cellelinie. Styrken af individuelle plaques blev sammenlignet med den for HT-29 pulje, hvorfra de blev isoleret. De plaque-oprenset virus blev fundet at være lig med eller større i styrke end HT-29-pulje. Den mest potente af disse plaque-oprenset virus, betegnet ColoAd1, blev valgt til yderligere karakterisering.
Mens ColoAd1 blev udvalgt til vækst på tyktarmen tumorcellelinie HT-29, var det ikke klart, om dette virus var steget potensering på alle tumorcellelinier, var selektiv for coloncancer tumorcellelinjer, eller var mere potent på alle celletyper, herunder primære normale celler. At behandle de to første spørgsmål, blev ColoAd1 testet af MTS assay på alle de oprindelige tumorcellelinier anvendt i denne undersøgelse (Panc1-sct, MDA-231mt1, HT-29, og PC-3), yderligere to tumorcellelinier (OVCAR-3, DU-145), og på et panel af colontumorcellelinier (DLD-1, LS1034, HCT116, LS174T, SW48, SW403, Colo320DM), der sammenligner det til Ad5. ColoAd1 var over 2 log mere kraftigt virkende end Ad5 på den beslægtede cellelinje, HT-29. Derudover ColoAd1 demonstrerede potens lig med eller større end Ad5 på nogle humane tumorcellelinjer (fx PC-3, MDA-231, Ovcar-3 og DU-145) blev, men svækkede (ca. to logs mindre potente end Ad5) på den Panc1 cellelinje (tabel 2). ColoAd1 de viste signifikant forøget styrke (9 til 100 gange) i forhold til Ad5 på alle tyktarmskræft tumorcellelinier screenede med undtagelse af Colo320DM (tabel 3). Dette antyder, at colontumorcellelinier har egenskaber, der gør dem væsentligt modtagelige for infektion og lyse ved ColoAd1.
For at teste, om ColoAd1 var selektiv for tumorceller end normale celler og dermed per definition , et onkolytisk virus, ColoAd1 blev undersøgt i to forskellige colon tumor cellelinier (HT-29, DLD-1), og på primær endotel- og epitelceller (HUVEC, HMEC), der sammenligner sin styrke i hver MTS assay til Ad5 og ONYX-015 /H101. Resultaterne viser, at ONYX-015 og Ad5 er betydeligt mindre potent end ColoAd1 på HT-29 og DLD-1 cellelinier (tabel 4). I modsætning hertil styrken af ColoAd1 på HUVEC-celler var den samme som Ad5 og lidt mere potent end ONYX-015 (tabel 4). På HMEC celler, ColoAd1 var mindre potent end Ad5 og ONYX-015 (tabel 4). At kvantificere disse forskelle mellem ColoAd1, ONYX-015, og Ad5, en
in vitro
terapeutisk vindue blev beregnet, defineret som forholdet af IC
50 for en given virus på normale celler, HUVEC eller HMEC divideret med IC
50 om colontumorcellelinier HT-29 eller DLD-1 (tabel 2). Disse beregninger fastslår, at ColoAd1 har en terapeutisk vindue, der er 3 til 4 logs større end Ad5 eller ONYX-015 /H101 i disse
in vitro
analyser.
ColoAd1 er en kimære virus, der viser forøget styrke over dens forælder virus, Ad11p
Chromatografisk analyse viste, at de store kappeproteiner af ColoAd1 blev afledt fra Ad11p, en gruppe B-virus. At bestemme forholdet mellem ColoAd1 og Ad11p, blev viruset sekventeret, hvilket viste, at ColoAd1 er Ad11p, med en næsten komplet E3-region deletion, en mindre deletion i E4-regionen, og et kimært Ad3 /Ad11p E2B-regionen (figur 2).
de genomiske forskelle mellem ColoAd1 og Ad11p er noteret i den skematiske. I E2B-regionen der er hyppige substitutioner af AD3 sekvenser til Ad11p sekvenser mellem basepar 6081 og 9322. Desuden ColoAd1 har en næsten fuldstændig (2.444 bp) E3-regionen deletion, og en mindre (25 bp), andet deletion der er knyttet til en formodet E4orf4 region af virus.
det er muligt, at Ad11p eller Ad3 er serotyper, der er i sagens natur mere potent, og har en bredere terapeutisk vindue, end Ad5 og at denne egenskab er uafhængig af erhvervede genetiske ændringer fundet i ColoAd1 genomet. For at teste dette, vi undersøgte ColoAd1, Ad11p og Ad3 på to colontumorcellelinier, HT-29 og DLD-1, og på primære humane endotel og primære humane epitelceller, HUVEC og HMEC henholdsvis ved MTS assay. Som vist i tabel 4, ColoAd1 udviste overlegen styrke over både Ad11p og Ad3 på colontumorcellelinier, hvilket viser, at dette rekombinante virus var overlegne i styrke til begge sine forældre vira. Interessant, Ad11p, og ikke Ad3, vises en iboende terapeutisk vindue, som defineret her via MTS-analyse. , ColoAd1 er således et derivat af Ad11p hvis forskelle med Ad11p forbedre styrken af virusset uden at ændre serotype naturlige evne til selektivt at replikere i tumorceller versus primære normale celler.
Det er vigtigt at bemærke, at den rapporterede seroprævalensen af Ad11p er lav [22], [23] det største behov for denne type terapeutiske er i patientgrupper, hvor svulsten har udviklet sig til en systemisk, metastatisk cancer. Således behandling af patienter med et middel, der mangler forud eksisterende immunitet bør øge muligheden for agenten at cirkulere og fjerne metastatiske tumorceller. For at bekræfte de tidligere rapporter om lav seroprævalens på Ad11p blev serum fra seks forskellige individer indsamlet og testet for evnen til at neutralisere infektivitet og lytiske potentiale i disse virus på en reporter cellelinie, Ovcar-3. Efter aftale med litteratur, serum demonstrerede lille effekt på ColoAd1 (data ikke vist), hvilket tyder på, at ColoAd1 kan være en brugbar fremgangsmåde til systemisk behandling af tyktarmskræft.
ColoAd1 har anti-tumor aktivitet overlegen ONYX -015 og Ad11p i en coloncancer levertumor såning xenotransplantat musemodel efter iv administration
De fleste solide tumorer er metastatisk på tidspunktet for diagnosen. Siden den første site af metastase til colon cancer er leveren, en coloncancer levertumor seeding model [24] blev anvendt til at undersøge
in vivo
effekt af ColoAd1. Til bestemmelse først, om viral anti-tumoraktivitet er afhængig af evnen af virusset til at replikere og sprede sig i denne model, blev en dosis-respons undersøgelse sammenligne ColoAd1 til en replikationsdefekt form for ColoAd1 (hvor den essentielle E1-regionen af viruset blev slettet). Som det ses i figur 3
A
, systemisk leveret ColoAd1 signifikant nedsætter tumorbelastning i en dosis, og replikation, afhængig måde. Da HT-29-celler kaste kræftfremkaldende embryonisk antigen (CEA), kan dette anvendes som en let måles surrogat for tumorbyrde. Vigtigt er det, målinger af CEA i blodbanen (Figur 3
B
) korreleret godt med resultaterne af tumor vægt målinger (Figur 3
A
).
HT-29 coloncancer-celler blev podet til leveren af nøgne beige mus (n = 10 mus pr behandlingsgruppe). Plasma CEA-niveau blev anvendt til at overvåge tumoretablering.
A
og
B
, Mus blev behandlet af hale-vene (iv) injektion med 1 × 10
10, 5 x 10
10, eller 1 x 10
11 samlede virale partikler af ColoAd1 per mus. Et fjerde sæt lever-tumor-bærende mus i.v. injiceret med 1 × 10
11 samlede virale partikler af en replikationsdefekt [E1
(-)] version af ColoAd1, ColoAd1CJ132. En femte sæt mus blev injiceret med vehikel-kontrol (buffer). Tumor vægtmålinger viser, at ColoAd1 har anti-tumoraktivitet, som er dosisafhængig (
A
). Blood CEA niveauer i slutningen af studiet (dag 12 indlæg viral administration) bekræfter de tumor vægtdata (
B
).
C og D,
Sammenligning af anti-tumoraktivitet af ColoAd1, Ad11p og ONYX-015 i HT-29 levermetastaser xenotransplantat musemodel. I en anden undersøgelse udført på samme model som i panel A og B, blev ColoAd1 sammenlignet med dets parentale virus, Ad11p og til klinisk godkendte onkolytiske virus ONYX-015; hvert virus doseret i.v. til i alt 1 × 10
11 virale partikler pr mus.
For at teste, om den overlegne
in vitro
styrken af ColoAd1 forhold til Ad11p og ONYX-015 /H101 blev sammenfattet
in vivo
, disse virus blev sammenlignet i leveren tumor seeding model. Som det ses i figur 3
C
(tumorvægt) og figur 3
D
(CEA niveaumåling), den antitumorale aktivitet af ColoAd1 var bedre både Ad11p og ONYX-015 i dette model, der bekræfter
in vitro
konklusioner.
selektivitet ColoAd1 på humane tumorvæv isoleret fra kolon kræftpatienter
In vitro
in vivo
modeller, der præcist forudsige klinisk effekt har været vanskeligt at identificere, og manglen på sådanne prognostiske modeller fortsætter med at resultere i omfattende nedslidning af kræftlægemidler. Derfor var frisk isoleret, kirurgisk fjernet menneskelige tyktarmskræft materiale undersøgt som en ekstra modelsystem til test ColoAd1. Da kirurgisk materiale omfatter både tumorvæv og normal celle marginer, tilbyder dette system en glimrende mulighed for at teste tumor selektivitet af virus i forbindelse med intakt humant væv. Levedygtigheden af en serie af tumorprøver blev analyseret i vævskultur; levedygtighed varierede fra 2 til 6 dage. Følgelig at sikre, at celledød skyldtes viralt induceret lysis og frigivelse af afkom virus og ikke skyldtes spontan lysis af det kirurgiske materiale, blev en 24 hr endpoint valgt. Seks tumorprøver blev opsamlet og hulning kulturer fra tumorvæv og normalt sektioner (som bestemt ved en klinisk patolog) blev dannet og udsat for enten Ad5 eller ColoAd1. At bestemme hver virus ‘evne til at replikere, lyse og frigive infektiøse virus blev supernatanten opsamlet 24 timer efter infektion og analyseret for tilstedeværelsen af afkom virus. Som det ses i figur 4
A
, ColoAd1 genereret ca. to logs mere viral afkom på tumor materiale end på matchet normalt væv, som bekræfter sin tumor selektiv replikation i frisk isoleret humant tumorvæv. Disse undersøgelser viste også, at ColoAd1 udstillet mindst en log højere tumor selektivitet end kontrol-virus, Ad5.
A,
Punch prøver af frisk udskårne humane colon tumorer (n = 6) og matchede normale margin-områder, blev inficeret med enten ColoAd1 eller Ad5 og opretholdes i vævskultur. Den virale burst fra hver prøve blev målt ved plaque assay ved 24 timer efter infektion.
B,
immunhistokemisk farvning for CD46 til stede i klinisk kolon tumor, normal colon, og normale leverprøver.
CD46 er blevet identificeret som en cellulær vedhæftet receptor for Ad11p, moderselskabet virus af ColoAd1 [25], [26]. For bedre at definere udtryk for CD46 i primær og metastatisk tyktarmskræft, vi undersøgte tyktarmskræft materiale, normalt levervæv og normal colon væv til CD46-ekspression ved immunhistokemi (IHC) (Figur 4
B
). Stærk CD46 IHC farvning blev konsekvent set i tyktarmskræft væv, men var fraværende eller generelt svag i normal colon og levervæv. Dette antyder, at CD46-ekspression kan være en medvirkende faktor til den observerede tumor selektivitet ColoAd1 og dermed kan være en potentiel værktøj til pre-screening af patienter til behandling med denne terapeutiske middel.
ColoAd1 kan være bevæbnet uden at kompromittere styrken
Armed onkolytiske virus forsøger at supplere styrken af den onkolytiske virus ved tilsætning af terapeutiske transgener [20]. I denne fremgangsmåde er det vigtigt, at et terapeutisk transgen insertion site inden det virale genom kan identificeres, som ikke kompromitterer livscyklus og dermed styrken af virusset. I modsætning Ad5, hvor biologi og beskrivelse af insertionssteder kompatible med den virale livscyklus er godt beskrevet, ColoAd1 repræsenterer en hidtil ukendt middel, der primært stammer fra de dårligt undersøgt Ad11p genom. Derfor blev et transposon-baseret system, der kan scanne genomet for insertionssteder i et ikke-forudindtaget mode anvendes til identifikation af kompatible transgen insertionssteder [27] Eftersom det virale genom kodende kapacitet af den humane Ad begrænses [28] en konsensus splejsningsacceptorsted blev anbragt opstrøms for transgenet, hvilket eliminerer behovet for en exogen promotor og linker ekspression mod et endogent ColoAd1 promotor [29]. For at forbedre evnen til at identificere transgene udtrykke ColoAd1 varianter blev GFP valgt som transgen. En række virale isolater blev genereret og derefter screenet for styrke og en virus betegnes ColoAd1-GFP blev valgt på grundlag af tilsvarende styrke til den forælder ColoAd1 (fig. 5A og 5B).
MTS analyser blev udført på ColoAd1 og ColoAd1-GFP på A) tyktarmen tumorcellelinie, HT-29 og B) de primære endotelceller, HUVEC. Reportergenet, GFP, udtrykkes med sene kinetik (dvs.., Afhænger af initiering af viral DNA-replikation til ekspression) som defineret ved ekspression C) kun i fravær af AraC og D) manglende ekspression i nærvær af AraC .
Tidligere undersøgelser under anvendelse af et splejsningsacceptor-baserede ekspressionskassette påvist at ekspression forekom sent i den virale livscyklus og var afhængig viral DNA-replikation [29]. Sammenkædning terapeutisk transgenekspression til selektiviteten af virus har en betydelig sikkerhedsfordel i forhold til traditionelle konstitutive ekspressionssystemer siden genekspression ville være begrænset og afhængig af tumor selektivitet af det virale systemet [30]. For at bestemme de GFP-ekspression kinetik fra ColoAd1-GFP, blev HT-29-celler inficeret i nærvær eller fravær af AraC, en forbindelse, der inhiberer viral replikation. Som det ses i figur 5C og 5D blev GFP-ekspression blokeret ved tilsætning af AraC indikerer, at ekspression forekommer sent i den virale livscyklus og er knyttet til viral replikation.
Discussion
I nærværende undersøgelse vi etableret forhold, der vælger potente virale agenter, uden bias mod nogen mekanisme, fra en pulje af Ad-serotyper, der repræsenterer Ad undergrupper B-F. Denne metode, som er et stærkt accelereret version af den naturlige udvælgelse af vira, kan anvendes på enhver virus og enhver kræft type valg.
Brug denne proces, vi genereret og karakteriseret ColoAd1, en hidtil ukendt Ad3 /Ad11p kimære onkolytisk virus til behandling af human coloncancer og muligvis andre indikationer. Denne virus blev vist at være mere potent og har et større terapeutisk vindue end Ad5 og klinisk mest avancerede onkolytiske virus Onyx-015 (tabellerne 2-4). Desuden diskuteres ColoAd1 demonstrerede øget potentcy i en intravenøs tumor model og på tumoreksplantater (figur 3 og 4) .Dette virus har flere ændringer i forhold til den forælder Ad11p virus, herunder en kimære E2B region og sletninger i E3 og E4 regionerne. Som ændrer eller ændringer spiller en rolle i forøget styrke af dette virus er ikke klart. Tabet af gener i Ad5 E3-regionen er blevet vist i gruppe B Ads at forbedre viral lysis og sprede [31] af en udefineret mekanisme. Den E2B-regionen koder for præ-terminale protein (PTP) og det virale DNA-polymerase (DNA pol), to af de tre E2-kodede proteiner, der er nødvendige for viral DNA-replikation. Terminalen 18 bp af det virale genom, anses den minimale replikationsstartområdet direkte interagerer med PTP og DNA pol heterodimer. Det er vigtigt at bemærke, at når sekventeret de genomiske ender af ColoAd1 og vildtype Ad11p var identiske med de af Ad3 og i strid med den beskrevne DNA-sekvens termini beskrevet for Ad11p [32], [33]. Således kan E2B ændringer i ColoAd1 generere en pTP-DNA pol heterodimer, der er mere kompatibel med terminalen 18bp af ColoAd1 end den oprindelige Ad11p pTP-DNA pol. Koblet med ColoAd1 s mindre genom (et resultat af genomiske deletioner) denne virus kan replikere hurtigere og også nå en kritisk viral burst størrelse hurtigere dermed øge viral lysis og spredning.
Med hensyn til selektivitet, studier med pTP af Ad5 har vist, at det interagerer med CAD, en masse protein ansvarlig for TP-nukleare matrix association. Niveauet af CAD er korreleret med hastigheden af celledeling; 04:58 gange højere niveauer i tumorceller end i normale celler og næsten ikke-eksisterende i hvilende celler [34], [35]. Følgelig kan TP ændringer og deres potentielle interaktioner med CAD (eller lignende proteiner) også være mekanismer forbedret replikation og /eller selektivitet af virusset.
Den tredje ændring i ColoAd1 virale genom er en lille deletion (24 bp), som henviser til E4orf4 region af viruset. Den E4orf4-proteinet af Ad5 interagerer med værtscellens serin /threonin-proteinphosphatase 2A (PP2A), [36]. Denne interaktion er vist sig at inducere p53-uafhængig apoptose, inaktivere splejse faktorer, og reducere E1A aktivering af AP-1, JunB, og angivelse af Ad E2 og E4 transkriptionsenheder [37]. Men da E4-regionen er stærkt splejset, at E4orf4 gendeletion kan også ændre ekspressionen af en anden E4-genet i dette komplekse transkriptionsenhed, således indirekte bidrager til forøget styrke af ColoAd1. Desuden er det ikke klart, at Ad11p og AD3 proteiner opretholde nogen af eller alle de funktioner, som tilskrives homologe Ad5 proteiner. Således ekstrapolationer af Ad5 protein fungerer til proteiner i ColoAd1 skal omhyggeligt testet. Følgelig mens det er klart, at CololAd1 har gennemgået en række genetiske ændringer, der resulterer i en mere potent virus, er det ikke klart, hvilken ændring (er) er ansvarlig for forøget styrke.
Det er vigtigt at bemærke, at ColoAd1 er et medlem af gruppen B annoncer og dermed tydeligt adskiller sig fra de traditionelle Ad5-baserede onkolytiske virus. Det betyder ikke, for eksempel bruge Ad5 receptoren, (coxsackie B- og adenovirus receptor, CAR), til fastgørelse til celler. I stedet ColoAd1 synes at ansætte mindst to receptorer, der tydeligt adskiller sig fra CAR [22], [38], [39], hvoraf den ene er for nylig blevet beskrevet som CD46 [25], [26]. Betydningen af dette understreges af de seneste undersøgelser af klinisk materiale viser, at CAR er dårligt udtrykt på en række forskellige tumortyper og at CAR udtryk falder med forskuddet i scenen og karakteren af tumor [40], [41], [42 ], [43], [44]. Yderligere rapporter om tumor suppressor egenskaber af CAR [45], [46] og detektion af opløselig CAR i tumor mikromiljø [47] sætter spørgsmålstegn ved brugen af CAR-afhængige adenovirus til behandling af alle menneskelige kræftformer. Til gengæld synes tumor celleoverfladeekspression af CD46, den formodede ColoAd1 receptoren, til at stige med trin og grad i en række forskellige cancere [48]. Således kan ColoAd1 have terapeutisk anvendelighed ud over tyktarmskræft, og undersøgelser for at undersøge dette er i gang. Af yderligere betydning er data, der viser, at seroprævalens på Ad11p er lav [22], [23]. Da den størst behov for denne type terapeutiske er i patientgrupper, hvor svulsten har udviklet sig fra en begrænset lokal sygdom til en systemisk, metastatisk cancer, behandling af patienter med en agent, som de ikke har forud eksisterende immunitet bør øge muligheden for midlet til at cirkulere og fjerne metastatiske tumorceller. Dette er i modsætning til Ad5 hvor sero-prævalens, som målt ved neutraliserende antistoffer, når niveauer på omtrent 50% i den almindelige befolkning [23], [49].
Det er vigtigt at bemærke, at styrken af ColoAd1 kan suppleres med et og potentielt flere terapeutiske transgener. Evnen til at tilkoble disse midler udgør en enestående mulighed for at påvirke behandlingen af cancer på flere niveauer fra et enkelt middel. Som påvist ved inkorporering og effektiv ekspression af GFP fra ColoAd1 genomet, kan tilkobling forekomme uden at kompromittere styrken eller selektiviteten af virale terapeutiske. Ud over at inkorporere midler, der supplerer den oncolytiske potentiale af virusset (f.eks prodrug omdannende enzymer, antiangiogene faktorer, immunterapi,), tilkobling skaber mulighed for klinikere at spore aktiviteten af virotherapy behandling i en minimalt invasiv måde [50] . Dette er så meget desto mere meningsfuld, hvis den metode til sporing af virotherapy er direkte knyttet til den virale livscyklus. I tilfælde af ColoAd-GFP, er det tydeligt blevet påvist, hvor GFP-ekspression blev påvist at være direkte forbundet med DNA-replikation (figur 5B). Forskellige gener er blevet identificeret som ville give klinikere at spore viral aktivitet og indbefatter gener associeret med radionuklid billeddannelse (f.eks HSV-1 TK, human thyroidal natriumiodid symporter, [51], [52]) og opløselige markør peptider let påviselig i blodstrømmen eller via urinen prøvetagning (f.eks humant carcinoembryonisk antigen, β-kæden af human choriongonadotropin [53], [54], [55]). Ved hjælp af ekspressionen af det linkede gen som biomarkør for viral replikation og spredning udgør en mulighed for klinikere at personalisere behandlingen, hvilket giver yderligere doser kun efter behov, således bevæger sig væk fra standard, timet doser almindeligvis er forbundet med de nuværende kemoterapi behandlinger. Lige så vigtigt, da vi mener, afvejning af behovet for øget styrke med sikkerhed viral behandling, bevæbning kunne også bruges til at indarbejde en “sikkerhedsventil” i virotherapy, i stand til at afbryde den virale-baseret behandling gennem administration af en klinisk godkendt lægemiddel (f.eks. inkorporering af HSV TK-genet og administration af gancyclovir).
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.