PLoS ONE: Udvikling af en tumor-selektiv tilgang til behandling metastatisk Cancer

Abstrakt

Baggrund

Patienter diagnosticeret med metastatisk kræft har næsten ensartet dårlige prognoser. De behandlinger til rådighed for patienter med dissemineret sygdom er normalt ikke helbredende og har bivirkninger, der begrænser terapi, der kan gives. En behandling, der er selektivt toksisk for tumorer vil maksimere de gavnlige virkninger af behandlingen og minimere bivirkninger, som dermed kan effektiv behandling, der skal administreres.

Metoder og Resultater

Vi postuleret, at tumoren-tropiske ejendom stamceller eller progenitorceller kan udnyttes til selektivt at levere et terapeutisk gen til metastatiske faste tumorer, og at ekspression af et passende transgen ved tumor loci kan mediere kur for metastatisk sygdom. For at teste denne hypotese, vi injicerede HB1.F3.C1 celler transduceret til at udtrykke et enzym, der effektivt aktiverer anti-cancer prodrug CPT-11 intravenøst ​​i mus, der bærer disseminerede neuroblastomtumorer. De HB1.F3.C1 celler migreret selektivt til tumorsteder uanset størrelse eller anatomiske placering af tumorerne. Mus blev derefter behandlet systemisk med CPT-11, og effektiviteten af ​​behandlingen blev overvåget. Mus behandlet med kombinationen af ​​HB1.F3.C1 celler, der udtrykker CPT-11-aktiverende enzym og denne prodrug produceret tumor overlevelse på 100% af musene for 6 måneder (

P

0,001 sammenlignet med kontrolgrupper).

konklusioner Salg

det nye og væsentlige resultater af denne undersøgelse er, at det kan være muligt at udnytte tumor-tropiske egenskab af stam- eller progenitorceller for at mediere effektiv, tumor -selektive behandling for metastaserende tumorer, for hvilke der ikke tolereres helbredende behandlinger er tilgængelige i øjeblikket

Henvisning:. Aboody KS, Bush RA, Garcia E, Metz MZ, Najbauer J, Justus KA, et al. (2006) Udvikling af en tumor-selektiv tilgang til behandling af metastatisk kræft. PLoS ONE 1 (1): E23. doi: 10,1371 /journal.pone.0000023

Academic Redaktør: Hans Clevers, Utrecht University, Holland

Modtaget: August 8, 2006; Accepteret: August 10, 2006; Udgivet: December 20, 2006

Copyright: © 2006 Aboody et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health /National Cancer Institute (CA113446, CA79763, CA76202 og CA21765); . Stop Cancer Foundation, Phi Beta Psi Sorority, The Rosalinde og Arthur Gilbert Foundation, Neidorf Family Foundation, Marcus Foundation, og amerikanske libanesiske syriske associerede Velgørende organisationer (ALSAC)

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser eksisterer.

Introduktion

neuroblastom er den mest almindelige extrakraniel fast tumor hos børn. Typisk patienter diagnosticeret med høj risiko for sygdom demonstrere en god første reaktion på behandlingen, men så mange som 80% af disse patienter tilbagefald med metastatisk sygdom, der er refraktære over for behandling. Ligesom andre faste tumorer, når neuroblastomer metastaserer, er de meget vanskelige at behandle, og et flertal af børn med metastatisk neuroblastom dør af deres sygdom [1] – [3]. For tiden tilgængelige behandlinger har antitumorvirkning men de også uønskede bivirkninger til normalt væv, hvilket begrænser den behandling, som kan administreres. Der er behov for nye og effektive metoder til behandling af neuroblastom

beskrevet i denne undersøgelse tilgang er baseret på at udnytte tumor-tropiske egenskab HB1.F3.C1 celler [4] -. [16] for at levere en effektivt terapeutisk middel selektivt til tumorer. Det specifikke mål med undersøgelsen var at vise, at intravenøs administration af HB1.F3.C1 celler, der udtrykker CPT-11 (irinotecan) -activating enzym kanin carboxylesterase (RCE) vil øge antitumorvirkningen af ​​tolererede doser af CPT-11 i mus bærende formidles neuroblastomtumorer. Den beskrevne kan også tilpasses til at udvikle behandling for patienter med andre typer af metastatiske faste tumorer tilgang. Salg

Neurale stamceller (NSC) eller progenitorceller (NPCs) og mesenchymale stamceller (MSC’er) er for nylig blevet undersøgt som leveringsvehikler til behandling subkutane xenotransplantater, samt til behandling af tumorer i centralnervesystemet eller lungerne af prækliniske modeller. Dette er den første undersøgelse forsøger at udnytte den bemærkelsesværdige tumor-tropisme af disse celler til at udvikle behandlinger for metastatisk, dissemineret faste tumorer. Da ingen effektive behandlinger er tilgængelige for de fleste metastatiske tumorer, hvilket viser, at stam- eller progenitorceller af føtal eller voksen oprindelse kan anvendes til at forbedre prognosen for patienter med dødelig metastatisk sygdom ville være særdeles signifikant.

anvendte cellelinie i denne undersøgelse (HB1.F3.C1) blev afledt fra føtale telencephalon celler. Primære celler blev udødeliggjort af retroviral indsættelse af v-

myc

gen, der var forpligtet til at opretholde deres replikation potentiale [17]. Efter immortalisering, HB1.F3.C1 celler replikere

in vitro

til dannelse identiske datterceller eller kan induceres til at differentiere til andre celler af neuronal cellelinje, hvorved der udvises karakteristika både stamceller og progenitorceller. Siden HB1.F3.C1 celler administreres systemisk migrere til og lokalisere

in vivo dele på steder af patologi, herunder tumorer, foreslog vi at udnytte denne egenskab til selektivt at levere RCE at aktivere anticancer prodrug CPT-11 [18] – [20]. Vi antager, at øget omdannelse af dette prodrug til dets aktive metabolit (SN-38) ved tumorer sites vil forøge selektiv antitumoraktivitet. Vi administreret intravenøst ​​adenovirus-transducerede HB1.F3.C1 celler, der udtrykker en secerneret form af RCE til mus med dissemineret neuroblastom. Mus blev derefter behandlet systemisk med CPT-11 og overlevelse af dyr langsigtede blev overvåget. De opnåede resultater antyder, at hidtil ukendte enzym /prodrug tilgange til terapi under anvendelse af stam- eller progenitorceller som leveringsvehikler kan have anvendelighed ved behandling af metastatisk cancer.

Metoder Salg

tumorcellelinier

De tre humane neuroblastom-cellelinier anvendt i dette studie var NB-1691 NB-1643 og SK-N-AS [21], [22]. Disse cellelinjer blev opnået fra Pediatric Oncology Group og American Type Culture Collection og afspejler forskellige neuroblastom fænotyper og genotyper: N-

myc

forstærkes, N-

myc

ikke-forstærket /overudtrykt, N-

myc

ikke-forstærket /lavt udtryk,

MDM2

forstærket, og forskellige forhold mellem nuklear /cytoplasmatisk p53. Hver type forsøg beskrevet nedenfor blev udført med alle tre cellelinier; resultater fra repræsentative eksperimenter er vist. Tre neuroblastomcellelinier blev anvendt til at vise, at resultaterne observeret var ikke begrænset til en enkelt cellelinje; lignende resultater blev observeret med alle tre cellelinier. Tumorcellelinier blev dyrket i DMEM indeholdende 10% FCS ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 10% CO

2.

HB1.F3.C1 cellelinie

HB1. F3.C1 cellelinie er en multipotente, klonet cellelinie, som blev genereret ved immortalisering celler opnået fra telencephalon af en human foster af 15 ugers svangerskab, ved anvendelse af en retrovirus, der koder for v-

myc

genet [17] , [23]. De primære celler blev opnået i overensstemmelse med retningslinjerne i Anatomisk Patologi Institut for Vancouver General Hospital, med tilladelse til at bruge fostervæv ydet af Clinical Research Screening udvalg med menneskelige forsøgspersoner fra University of British Columbia. HB1.F3.C1 er en etableret, velkarakteriseret, stabil cellelinie [23] – [27]. HB1.F3.C1 celler forny sig selv

in vitro

, er ikke-tumorigene, og er multipotente i, at de kan induceres til at differentiere til neuroner, oligodendrocytter, og astrocytter [17]. Anvendelsen af ​​denne cellelinie omgået det alvorlige problem med begrænset adgang til store mængder af primære celler og maksimeret reproducerbarhed blandt eksperimenter. Cellelinien blev dyrket i DMEM med 10% FCS ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 10% CO

2.

Transduktion af HB1.F3.C1 Celler til Express RCE

replikationsdefekt adenovirus, der udtrykker en secerneret form af RCE under kontrol af cytomegalovirus (CMV) promoter (AdCMVrCE) blev konstrueret ved anvendelse af standardmetoder, som tidligere [18] beskrevet, [20], [28]. HB1.F3.C1 celler blev co-dyrket med AdCMVrCE i 24 timer før intravenøs injektion. Enzymaktiviteten anvendte analyse til kvantificering af niveauet af ekspression af RCE af HB1.F3.C1 celler transduceret med adenovirus er også blevet rapporteret tidligere [20].

HB1.F3.C1 cellemigrering, Injection og lokalisering

for at undersøge, om HB1.F3.C1 celler, injiceret intravenøst, migrere til dissemineret tumor foci i mus blev neuroblastom tumorceller injiceret intravenøst ​​i halen vener af mus og lov til frø og udvikle tumorer i to måneder. HB1.F3.C1 celler (2 × 10

6) blev derefter indsprøjtet

via

samme rute og organer blev høstet 3-4 dage senere for at vurdere migration til makroskopiske og mikroskopiske tumorer.

for terapeutiske eksperimenter blev HB1.F3.C1 celler administreret 2 uger efter injektion af neuroblastomceller. På dette tidspunkt, tumorer er mikroskopiske og kan påvises ved øjet eller af

in vivo

billeddannelse. I overensstemmelse med initiering af behandling på dette tidspunkt, foreslår vi, at den mest sandsynlige eventuel kliniske anvendelighed af den beskrevne fremgangsmåde vil være at udrydde minimum residual sygdom efter konventionel terapi. Denne forsøgsprotokol mest direkte afspejler, at potentielle anvendelse.

I både migration og terapeutiske undersøgelser, 2 × 10

6 HB1.F3.C1 celler transduceret med adenovirus ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 20 var pre-mærket med CM-Dil (chlormethylbenzamido-1,1′-dioctadecyl-3,3,3 ‘, 3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorat, Molecular Probes, Eugene, OR) ifølge producentens instruktioner. Celler blev derefter skyllet 3 gange med PBS og injiceret i halevenen af ​​tumorbærende mus. CM-Dil blev valgt, fordi det er ikke-diffunderbare i kraft af dens kovalente binding til cellulære thioler, og har vist sig at være egnet til mærkning og

in vivo

sporing af celler i mindst 10 uger [29] , [30]. I forsøg, der indgår i dette papir blev mus injiceret med CM-Dil-mærkede celler høstet 3-4 dage efter mærkning og injektion.

ES1

e Esterase-mangelfuld svær kombineret immundefekt (SCID) mus

plasmaet fra SCID-mus indeholder høje niveauer af en gnaver carboxylesterase der aktiverer CPT-11 [31], [32]. Derfor brugte vi esterase-mangel SCID-mus for alle

in vivo

terapeutiske undersøgelser [33]. Disse dyr har niveauer af plasma esterase sammenlignelige med dem i humant plasma. Musene blev anbragt i en AALAAC-akkrediterede facilitet og fik mad og vand ad libitum.

RT-PCR /PCR

Knoglemarv blev høstet fra skinnebenet af normale og tumor-bærende mus, og RNA blev ekstraheret til RT-PCR påvisning af tyrosinhydroxylase (TH), en neuroblastomcellelinje markør. DNA blev ekstraheret fra en separat alikvot af knoglemarv for PCR af v-

myc

gen til identifikation HB1.F3.C1 celler. Primersekvenser og RT-PCR-betingelser for TH har tidligere [21] blevet offentliggjort. Standardmetoder blev anvendt til v-

myc

amplifikation under anvendelse af en fremadrettet primer 5′-CCTTTGTTGATTTCGCCAAT-3 ‘og en revers primer 5′-AGTTCTCCTCCTCCTCCTCG-3’, med et udglødningstrin på 62,5 ° C i 1 minut i 30 cykler. Den positive kontrol for TH blev RNA ekstraheret fra NB-1691-celler, og for den v-

myc

gen var DNA fra HB1.F3.C1 celler. Negative kontroller indeholdt ingen RT eller ingen DNA, for TH og v-

myc

reaktioner henholdsvis.

Histochemistry, Immunhistokemi og Immunofluorescens Imaging

Organer blev høstet, fikseret i 4 % paraformaldehyd /PBS, pH 7,4 og kryobeskyttet i 30% sucrose. Fikserede væv blev derefter indlejret i OCT, serielt cryosectioned (10 um), tø-monteret på objektglas og opbevaret tørt ved -20 ° C. Til rutinemæssig histologisk screening blev vævssnit farvet med hematoxylin og eosin ved standardmetoder.

Tilstedeværelse af HB1.F3.C1 celler ved neuroblastom tumor loci eller i normalt væv blev undersøgt under anvendelse af fluorescensmikroskopi. I sektioner fremstillet som beskrevet ovenfor, blev kernerne i alle celler farvet med DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol; Sigma Biochemical, St. Louis, MO, blå fluorescens), og påvist under anvendelse af epifluorescens excitation /emission filtre af 340 -380 /420 nm (LP) (UV-2A, Nikon). HB1.F3.C1 celler, mærket med CM-Dil (rød fluorescens), blev påvist under anvendelse excitation /emission filtre af 540-580 nm og 600-660 nm (Y-2E /C) under anvendelse af et Nikon Eclipse TE2000-U mikroskop (Nikon Instruments, Melville, NY) udstyret med en SPOT RT Slider digitalkamera (Diagnostiske instrumenter, Sterling Heights, MI). For at detektere humane neuroblastomtumorer i musevæv, udførte vi immunhistokemisk farvning under anvendelse af et muse monoklonalt antistof, som genkender humant mitokondrisk protein (Chemicon, Temecula, CA). Snit blev post-fikseret i 4% paraformaldehyd i 10 minutter, skyllet, permeabiliseret med 0,3% Triton X-100 /PBS, 30 minutter og inkuberet i blokeringsopløsning (5% BSA + 3% normalt hesteserum + 0,1% Triton X-100 , 1 h). Snit blev derefter inkuberet sekventielt med primært antistof (1:100 fortynding) i 16 timer ved 4 ° C, biotinyleret anti-muse-IgG sekundært antistof (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i 2 timer, og avidin-FITC (Vector Laboratories) til 1 time. Vævssnit blev modfarvet med DAPI og monteret med fluorescerende monteringsmedium (DAKO). FITC fluorescens blev detekteret ved epifluorescens filter (465-495 nm excitation, 515 til 555 nm emission; B-2E /C).

Til rutinemæssig histologisk bedømmelse af tilstedeværelsen af ​​tumorer i forskellige organer, vævssnit blev farvet med hematoxylin og eosin. Tilstødende sektioner blev forarbejdet til immunoperoxidase-3,3′-diaminobenzidin (DAB) farvning på samme måde som væv forarbejdet til fluorescens-farvning, bortset fra, at efter permeabilisering blev endogene peroxidaser standset med 0,3% hydrogenperoxid /PBS i 30 min. Antistofreaktivitet til human mitokondrier blev efterfølgende påvist under anvendelse af et Vectastain ABC

Elite

kit (Vector Laboratories) og en peroxidasesubstrat Kit (Vector Laboratories) ifølge producentens anvisninger. Salg

Lav- og høj forstørrelse billeder blev opnået under anvendelse af et Nikon Eclipse TE2000-U mikroskop (Nikon Instruments, Melville, NY) udstyret med lysfelt og fluorescensbelysning. Billeder blev registreret og lagret ved hjælp af SPOT Avanceret og Adobe Photoshop software.

Modificeret Boyden Chamber cellemigrationsassay

Modificeret Boyden kammer analyser blev anvendt til at vurdere

in vitro

tropisme af HB1.F3.C1 celler til tumor celle-konditionerede medier eller til at styre medier, ved anvendelse af standardmetoder. Kort fortalt blev HB1.F3.C1 celler transduceret med en MOI på 0, 5, 10 eller 20 AdCMVrCE trypsiniseret, vasket og resuspenderet i DMEM indeholdende 5% BSA. Celler (3 x 10

4 celler /100 pi) blev anbragt i øvre kamre og neuroblastomcellelinje-konditioneret medium i nedre kamre. Neuroblastomcellelinje-konditioneret medium i både de øvre og nedre kamre omfattede kemokinese kontrol uden en kemoattraktant gradient. Cellerne fik lov til at migrere i 4 timer i en cellekultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO

2. Antallet af migrerede HB1.F3.C1 celler i det nedre kammer i hver brønd blev kvantificeret ved anvendelse CyQuant GR fluorescerende farvestof (Chemicon) og et fluorescensmikropladelæser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Analyser blev udført i tre eksemplarer.

Animal Studies

Dissemineret neuroblastom blev produceret ved at injicere 5 × 10

5 NB-1691, NB-1643, eller SK-N-AS celler i halevener mus. Typisk disse mus kræver eutanasi -75 dage efter injektion af neuroblastomceller. Brutto tumorer i flere organer er synlige ved obduktion. Denne metastatisk neuroblastom model er blevet godt karakteriseret og er meget reproducerbar med hensyn til forløbet af sygdommen og organinvolvering [34]. Derudover modellen rekapitulerer den kliniske mønster af metastatisk neuroblastom i at tumorer udvikler sig i multiple loci, herunder binyrerne, knoglemarv og lever.

Hver behandlingsgruppe omfattede 10 mus, der overvåges dagligt for forekomst af sygdom eller dårligt helbred. Den ugentlige tidsplan for administration af HB1.F3.C1 celler og CPT-11 (7,5 mg /kg) er illustreret i figur 8. Dette regime blev administreret i 2 på hinanden følgende uger, efterfulgt af en 2 ugers pause og derefter en anden 2- ugers terapi. Alle dyr protokoller blev godkendt af City of Hope eller St. Jude Children Research Hospital IACUC. Når mus syntes at være i ubehag eller lidelse som bedømt af uafhængige dyr plejepersonalet uden kendskab til den protokol design, blev dyrene aflivet. Alle aflivede mus blev verificeret som tumorbærende ved obduktion. Den endpoint for den terapeutiske undersøgelse var langsigtede overlevelse.

SK-N-AS-celler (5 x 10

5) transduceres til at udtrykke luciferase blev injiceret i hale årer.

Én måned efter injektion af tumorceller, blev mus injiceret intraperitonealt med luciferin og filmede med en Xenogen IVIS imaging system, ifølge anvisningerne fra fabrikanten.

Multiple tumorer var til stede i 100% af musene.

To repræsentative mus vist.

Menneskelig neuroblastom tumorceller injiceres intravenøst ​​at producere formidles tumorer.

på et passende tidspunkt efter injektion af neuroblastomceller, neurale stamceller eller neurale stamfader celler transduceret med adenovirus til at udtrykke et prodrug-aktiverende enzym (i denne undersøgelse, en secerneret form af kanin carboxylesterase [RCE]) injiceres intravenøst.

Efter migrering af stamceller eller progenitorceller til tumorfoci og en forsinkelse 3-4 dage for at tillade relativt højt niveau ekspression af prodrug-aktiverende enzym i det ekstracellulære miljø ved tumorpositionen behandles mus med prodruget (i denne undersøgelse, CPT-11).

prodrug aktiveres selektivt ved tumorfoci, at forøge det terapeutiske indeks af prodruget

(a) dissekerede leveren fra et repræsentativt dyr med levermetastaser.; dyret blev aflivet to dage efter injektion af HB1.F3.C1 celler i halevenen.

(B) Lav- og (C) høj effekt forstørrelse af et afsnit af tumor-involverede leveren, farvet med . hæmatoxylin og eosin

Tumorceller synes mørke lilla (sorte pile); . Normalt væv vises pink

(D) Lever sektion farvet med et anti-humant mitokondrisk protein antistof og modfarvet med hematoxylin

Tumor mikrometastaser farves mørkebrunt (røde pile).; normalt levervæv er lilla.

(E) Immunofluorescens mikroskopi af leveren sektion.

HB1.F3.C1 celler blev CM-Dil-mærket før injektion og er indlysende som røde celler.

leveren afsnit blev farvet med DAPI; tumor foci identificeres ved områder med tæt-pakkede DAPI-farvede tumor cellekerner.

De røde pile viser ekstravaserede HB1.F3.C1 celler proksimalt for en hepatisk vene (v).

Indsat er stor forstørrelse af en Dil-mærkede HB1.F3.C1 celle i tumoren. (F-H) Lever sektion fra et tumorbærende dyr, der modtog CM-Dil-mærkede HB1.F3.C1 celler blev farvet med FITC-konjugeret humant specifikt mitokondrie antistof.

(F) Red CM-Dil -mærkede HB1.F3.C1 celler.

(G) Den samme sektion viser FITC-mærket (grøn) humane tumorceller og HB1.F3.C1 celler.

(H) Overlay af F (rød CM-Dil HB1.F3.C1 celler) og G (grøn FITC HB1.F3.C1 og tumorceller).

HB1.F3.C1 celler (orange /gul celler angivet med hvide pile) migreret til hepatiske mikrometastaser (grønne celler) og infiltrerede tumor parenkym i nærheden af ​​et blodkar (bv, hvide stiplede linjer)

Scale barer:. 1 cm (a), 2 mm (B), 500 um (C), 200 um (F, G), 100 um (D, E, H), 10 um (E indsat).

røntgenbillede af bagbenet af en mus med fremskredent stadium neuroblastom (dag 82; venstre panel, skala bar: 1 cm)

Bekræftelse af tumormasse som human SK-N-AS neuroblastomceller blev udført ved immunhistokemi under anvendelse af anti-humant mitokondrier antistof (ikke vist. )

CM-Dil-mærkede HB1.F3.C1 celler (røde blodlegemer, indsprøjtes i halevenen 3 dage før aflivning) lokaliseret til tumor i marven (højre panel.; skala bar:. 200 um)

overensstemmende påvisning af v-

myc

(HB1.F3.C1 celler) ved PCR og TH-ekspression (neuroblastomceller) ved RT-PCR i knoglemarvsceller prøver.

knoglemarv prøver isoleret fra dyr injiceret med HB1.F3.C1 celler blev analyseret for tilstedeværelsen af ​​v-

myc Salg (HB1.F3.C1 celler) eller ekspressionen af TH (NB-1643 celler).

HB1.F3.C1 celler var til stede i knoglemarven, når tumorceller var også til stede.

HB1.F3.C1 celler blev ikke detekteret i knoglemarven af ​​ikke-tumor-bærende dyr.

de positive kontroller (+) blev DNA ekstraheret fra HB1.F3.C1 celler til v-

myc

, og RNA ekstraheret fra NB -1691 celler for TH

De negative kontroller. (-) indeholdt ingen DNA eller RNA-skabelon, henholdsvis

Normalt og tumor-bærende organer blev høstet, snittet og farvet med. DAPI. HB1.F3.C1 celler blev ikke detekteret i normal (A) hjerne, (B) nyre, (C) hjerte, (D) tarm, eller (E) hudvæv.

Rare, enkelt, HB1. F3.C1 celler (hvide pile) blev set i (F) lunge, (G) lever og (H) milt

Scale barer:. 200 um (A-E), 100 um (F-H) .

Søjler repræsenterer det gennemsnitlige antal af migrerede celler ± SEM af tredobbelte brønde i modificerede Boyden kammer assays.

En dag forud for deres brug i behandlinger, celler blev transduceret med AdCMVrCE konstruktion (se tekst).

behandlingsplanen var baseret på tidsforløbet af ekspression af secernerede form af RCE, efter adenoviral transduktion af HB1.F3.C1 celler (Danks, upubliceret observation) og af en plan over administration af CPT-11, som har vist sig at være forholdsvis effektiv til neuroblastompatienter [35].

statistiske analyser

Alle data blev analyseret med GraphPad Prism software (San Diego, CA). Analyser af cellemigration resultater (middelværdi celleantal ± middelfejl.) Af utransducerede celler blev sammenlignet med den for celler transduceret med adenovirus. Disse data blev analyseret ved anvendelse af en to-halet

t

-test. Analyse af Kaplan-Meier-kurver sammenlignet overlevelse 10 mus per gruppe ved hjælp af en log-rank (Mantel-Haenszel) metode.

Resultater

Mus Model af metastatisk neuroblastom

Intravenøs injektion af 5 x 10

5 NB-1691, NB-1643, eller SK-N-AS humane neuroblastomceller producerer formidles neuroblastom i 100% af esterase-mangel SCID-mus. Den dissemineret karakter af tumorer er tydeligt i figur 1 i to mus, som modtog halevenen injektioner af SK-N-AS-celler transduceret til at udtrykke luciferase. En måned efter injektion af neuroblastomceller blev luciferase substrat luciferin injiceret intraperitonealt at visualisere tumorer

in situ

. I overensstemmelse med offentliggjorte rapporter, tumorer var til stede i multiple organer og anatomiske steder, herunder maven, knoglemarv, lever og lunger [21], [34]. Siden 100% af mus injiceret med neuroblastomceller udvikle dissemineret sygdom der til sidst resulterer i døden, denne model lettet evaluering af terapeutiske forsøg, der blev udført ifølge skemaet i figur 2. Denne figur illustrerer den hypotese, der skal testes. Mus injiceret med humane neuroblastomceller udvikler multiple tumorer. To uger efter injektion af neuroblastomceller, er HB1.F3.C1 celler transduceret med adenovirus som koder for et prodrug-aktiverende enzym indgives intravenøst. Tre dage senere, efter HB1.F3.C1 celler er lokaliseret fortrinsvis til tumorsteder og prodrug’et-aktiverende enzym (RCE i denne undersøgelse) udtrykkes i høje niveauer, er prodrug (CPT-11) indgivelse initieret, angives på en forudbestemt optimal køreplan. Den antitumor effekt af prodrug alene kan derefter sammenlignes med samtidig administration af HB1.F3.C1 celler og prodrug, hjælp overlevelse som et slutpunkt.

Lokalisering af HB.F3.C1 celler til Neuroblastom Tumor i Liver

for at først bekræfte, at HB1.F3.C1 celler migrere til og lokalisere på formidles neuroblastomtumorer blev mus med etablerede NB-1643 tumorer injiceret intravenøst ​​med 2 × 10

6 CM-Dil mærkede HB1.F3. C1 celler. Efter 3 dage blev normale og tumorbærende organer høstet og snit, og evalueret mikroskopisk. Som vist i figur 3, flere tumorer var tydelige ved grov inspektion i leveren af ​​en repræsentativ mus (panel A), og også ved mikroskopisk bedømmelse af hematoxylin- /eosin farvede snit (panel B og C, lilla områder) og immunoperoxidasefarvning til menneskeføde mitokondrielle protein (panel D, brune områder). HB1.F3.C1 celler co-lokaliseret med disse tumorfoci, hvilket fremgår af de CM-Dil-mærkede, røde celler ses i panel E. Dette panel viser også ekstravasation af HB1.F3.C1 celler og migrationen væk fra hepatisk vene (v). Panel F viser HB1.F3.C1 NSC’er (CM-Dil-mærkede, rød) og panel G viser samme afsnit farvet med humane mitokondriske antistof-FITC (humane NSC’er og tumorceller, grøn). Panel H, en overlejring af paneler F og G, viser co-lokalisering af HB1.F3.C1 celler (orange /gul, angivet med hvide pile) og tumorceller (grøn), på steder umiddelbart ved siden af ​​og i afstand fra blodkarret (bv). Lignende resultater blev observeret for tumorer i flere andre organer, herunder ovariet (ikke vist) og knoglemarv (figur 4).

HB1.F3.C1 Celler lokalisere til neuroblastom metastaser i knoglemarv

da knoglemarv er en hyppig site af neuroblastom metastase og marv aspirater eller biopsier anvendes til at dokumentere den fase af sygdommen hos patienter med høj risiko, vi søgte at afgøre, om HB1.F3.C1 celler også infiltreret tumorer på dette site. Det venstre panel i figur 4 viser x-ray af femur af musen, som bærer en makroskopisk tumor, der opstod i knoglemarven. Dette dyr blev injiceret intravenøst ​​med CM-Dil-mærkede HB1.F3.C1 celler og aflivet tre dage senere. Det område af knoglen angivet af den røde rektangel blev derefter bearbejdet til immunfluorescensmikroskopi. Den højre panel i figur 4 viser klart HB1.F3.C1 celler (rød fluorescens) infiltrerende tumor-bærende marv, der dokumenterer, at disse celler migreret til og co-lokaliseret med makroskopiske tumorer (figur 4) samt mikroskopiske tumorer (figur 3 ). Men selv interessant, betragtede vi det vigtigere og relevant at demonstrere migration af HB1.F3.C1 celler til mikroskopiske tumorer i knoglemarven (figur 5), som sygdom ved tilbagefald menes at stamme fra residuale tumorceller til stede i marven eller på primære steder. Det er også afgørende for en vellykket klinisk anvendelse af denne fremgangsmåde til at vise, at HB1.F3.C1 celler ikke er til stede i normalt væv (figur 5, 6).

Molekylær Evidens for HB1.F3.C1 Cell og tumor Cell Co-lokalisering i Bone Marrow

for at løse det første af disse to spørgsmål, vi evaluerede migration af HB1.F3.C1 celler til tumorceller i knoglemarv ved hjælp af en følsom molekylær tilgang til påvisning af tilstedeværelsen af minimale antal tumorer celler og /eller HB1.F3.C1 celler. Til dette formål har vi høstede marv fra mus, der var blevet injiceret intravenøst ​​med NB-1691-celler, efterfulgt af HB1.F3.C1 celler to uger senere. Som bemærket ovenfor, på denne “stadium” af sygdom, tumorer ikke er påviselige mikroskopisk. Vi derefter bruges PCR til påvisning af v-

myc

genet til stede i HB1.F3.C1 celler og RT-PCR til påvisning af tyrosinhydroxylase (TH), en neuroblastomcellelinje markør. Data i figur 5 viser, at enten begge v-

myc

og TH eller ingen af ​​disse markører blev påvist i en given marv. Hvis marven indeholdt tumorceller som indikeret ved et påviseligt signal for TH, HB1.F3.C1 celler (et positivt signal for v-

myc

) var også til stede. Omvendt, når der blev ikke konstateret neuroblastomceller, HB1.F3.C1 celler blev ligeledes målbart. Denne “co-lokalisering” forekom inden for 1 time efter injektion og varede i mindst 7 dage. Disse data er i overensstemmelse med resultaterne i figur 3 og 4, og viser, at HB1.F3.C1 celler hurtigt migrere til tumorceller

in vivo

.

Få HB1.F3.C1 celler er til stede i Normal Tissue

for terapi at være tumor-selektive, det var også vigtigt at vise, at HB1.F3.C1 celler ikke migrere til andre normale væv. Følgelig 2 × 10

6 CM-Dil-mærkede celler blev injiceret intravenøst ​​i mus, der bærer NB-1643-tumorer og efter 3 dage blev alle organer høstet og undersøgt for tilstedeværelsen af ​​HB1.F3.C1 celler. Figur 6 viser, at få, om nogen, HB1.F3.C1 celler var til stede i normal hjerne, nyre, hjerte, tarm eller hudvæv (panel A-E, henholdsvis). Lejlighedsvis blev en enkelt celle observeret i lunge-, lever- eller milt (paneler F-H, henholdsvis), men ingen fokus for CM-Dil fluorescens blev set i alle normale væv af enhver af fem undersøgte mus. Vi konkluderede, at HB1.F3.C1 celler migreret selektivt til neuroblastomceller efter intravenøs injektion.

terapeutiske virkning for behandling af metastatisk neuroblastom

Efter at have konstateret, at HB1.F3.C1 celler er tumor- tropic

in vivo

, vi evaluerede antitumorvirkningen af ​​vores neurale stam- /progenitorcelle-rettet enzym prodrug (NDEPT) tilgang til terapi, under anvendelse HB1.F3.C1 celler transduceret til at udtrykke en udskilt form af en kanin carboxylesterase (RCE) og anticancer prodrug CPT-11. Vi først bekræftet, anvendelse af modificerede Boyden kammer assays, at adenoviral transduktion og ekspression af RCE ikke ændrede tropic egenskaber af HB1.F3.C1 celler (figur 7). Vi bestemt også, at den maksimale niveau af ekspression af RCE indtraf 3-4 dage efter transduktion (data ikke vist). Vi derefter transduceret HB1.F3.C1 celler med replikationsdeficient adenovirus kodende RCE og injiceret intravenøst ​​de transducerede celler i mus der bærer disseminerede SK-N-AS tumorer. Mus blev behandlet ifølge protokollen vist skematisk i figur 8. Som vist i figuren, fire dage efter injektion af HB1.F3.C1 + AdCMVrCE celler (tre dage efter injektion af HB1.F3.C1 celler), vi indledte behandling med CPT-11 (7,5 mg /kg) på daglig × 5 tidsplan, en optimal tidsplan for administration til patienter med neuroblastom. Denne behandling blev gentaget den følgende uge, efterfulgt af en 2 ugers pause, og derefter en anden 2-ugers behandlingsforløb. Kaplan-Meier graf i Figur 9 viser overlevelsesdata for ubehandlede mus sammenlignet med mus behandlet med CPT-11 alene, eller med kombinationen af ​​HB1.F3.C1 celler, der udtrykker RCE og CPT-11.