PLoS ONE: UDP-glucuronosyltransferase 1A determinates intracellulær akkumulering og Anti-Cancer Effekt af β-lapachon i Human Colon Cancer Cells

Abstrakt

β-lapachon (β-lap), en NAD (P) H: quinon oxidoreduktase 1 (NQO1) målrettet antitumor lægemiddelkandidat i fase II kliniske forsøg, er metabolisk elimineret via NQO1 medieret reduktion quinon og efterfølgende UDP-glucuronosyltransferaser (UGT’er) katalyseret glucuronidering. Denne undersøgelse har til hensigt at udforske den indre sammenhæng mellem den cellulære glukuronidering og farmakokinetik β-skød og dens apoptotiske effekt i humane colon cancerceller. HT29-celler S9 fraktioner udviste høj glucuronidering aktivitet over β-lap, der kan hæmmes af UGT1A9 kompetitiv inhibitor propofol. UGT1A siRNA behandlet HT29 celler S9 fraktioner viste en tilsyneladende lav glukuronidering aktivitet. Intracellulær akkumulering af β-lap i HCT116-celler var meget højere end den HT29-celler, korreleret med fravær af UGT1A i HCT116-celler. Den cytotoksiske og apoptotiske virkning af β-lap i HT29-celler var meget lavere end i HCT116 celler; desuden β-lap udløste aktivering af SIRT1-FOXO1 apoptosecyklus blev observeret i HCT116-celler, men ikke i HT29-celler. Forbehandling af HT29-celler med UGT1A siRNA eller propofol faldt betydeligt β-lap s cytotoksiske og apoptotiske effekter, på grund af undertrykkelse af glucuronidering og den resulterende intracellulære akkumulering. Afslutningsvis UGT1A er en vigtig determinant, via skifte NQO1-udløst redox cyklus til metabolisk eliminering, i den intracellulære akkumulering af β-lap og derefter dens cytotoksicitet i humane coloncancer-celler. Sammen med vores tidligere værker, foreslår vi, at UGT’er fastlagt cellulære farmakokinetik er en vigtig faktor i de apoptotiske virkninger af NQO1 målrette substrater tjener som kemoterapeutiske lægemidler

Henvisning:. Liu H, Li Q, Cheng X, Wang H, Wang G, Hao H (2015) UDP-glucuronosyltransferase 1A determinates intracellulær akkumulering og Anti-Cancer Effekt af β-lapachon i Human Colon Cancer Cells. PLoS ONE 10 (2): e0117051. doi: 10,1371 /journal.pone.0117051

Academic Redaktør: Philip C. Trackman, Boston University Goldman School of Dental Medicine, UNITED STATES

Modtaget: September 28, 2014 Accepteret: 16. december 2014 Publiceret: 18 feb 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:.. Dette arbejde blev støttet af nr 81430091, 81325025 og 81273586, https://www.nsfc.gov.cn/nsfc/cen/xxgk/slzz .html, National Natural Science Foundation of China (HH). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion Salg

UDP-glucuronosyltransferaser (UGT’er) er større fase II drug-metaboliserende enzymer, som katalyserer glucuronidering af talrige endogene forbindelser, såsom bilirubin, galdesyrer, thyroideahormon, og steroid hormoner samt betydelige eksogene substrater, herunder terapeutiske lægemidler, kræftfremkaldende stoffer, og miljøforurening. UGT’er betragtes som en vigtig afgiftning for dets evne til at fremme den metaboliske eliminering og dermed de biologiske effektiviteter af substraterne [1-3]. Endvidere er de polymorfier i de UGT gener nært forbundet med risiko, og forekomsten af ​​forskellige typer af sygdomme [4]. Selv rolle UGT’er i kemoterapeutisk modstand har været almindeligt anerkendt, den direkte forbindelse mellem den intracellulære akkumulering med kemoterapeutiske effekt er endnu ikke fastslået [5,6]. På det seneste har vi præciseret, at en NQO1 substrat, Tanshinone IIA, præsenterer en to-elektron reduktion af NQO1 producere en meget reaktiv catechol metabolit, der hurtigt kan glukoronideret med UGT’er tilstedeværelse. Men hvis UGT’er er fraværende eller deres glucuronideringsprocesser aktiviteter inhiberes, kan meget ustabile catechol mellemprodukt vende tilbage til Tanshinone IIA automatisk, hvorved der dannes en redox cyklus af reduktion quinon og auto-oxidation, hvor en stor mængde af reaktion oxygenarter (ROS ) fremstilles [7]. Disse resultater antydede, at UGT’er kan handle i skifte NQO1 udløste apoptotiske effekter til metabolisk eliminering i kræftceller og dermed kan være involveret i den iboende kemoresistens af NQO1 målrettet anti-cancer. For yderligere at validere dette vigtigt begreb, udvidede vi vores undersøgelse til en anden NQO1 målsøgende middel

β-lapachon (β-lap;. 3,4-dihydro-2,2-dimethyl-2H-naphtol [1,2 -b] pyran-5,6-dion) er et naturligt forekommende naphthoquinon fra lapacho træ (Tabebuia avellanedae), vides at have forskellige farmakologiske aktiviteter, herunder antivirale, antiprotozoisk og anticancer virkninger [8-11]. Det er blevet påvist, at β-lap udviser stærk cytotoksicitet mod en bred vifte af dyr og mennesker kræft cellelinjer [12-14], og kan synergistisk dræbe kræftceller, når det kombineres med paclitaxel (Taxol), ioniserende stråling og varme chok [15-17 ]. Talrige hypoteser af mekanismen for β-lap-induceret celledød blev foreslået og mængder af beviser forfremmet β-lap som lovende kandidat til kræftbehandling [10,18-21].

Da β-lap er også overvejende elimineres via NAD (P) H: quinon oxidoreduktase 1 (NQO1) og efterfølgende UGT katalyseret metabolisme [7,22], antog vi, at udtrykket og aktivitet af UGT’er i kræftceller også kan være en vigtig faktor i den anti-cancer effekt af β-lap, af samme størrelsesorden som i vores tidligere undersøgelse af Tanshinone IIA. I betragtning, at β-lapachon er i øjeblikket på kliniske fase II-forsøg, validering af, om UGT’er medierede cellulære metabolisme vil kunne fremkalde indre modstand er meget vigtigt at dens videre udvikling og dens fremtidige kliniske anvendelse som en kemoterapi stof. β-lap-induceret celledød var præget af dramatiske ROS dannelse, cellecyklusstop i G

0 /G

1, omfattende DNA-skader, udtømning af NAD

+ /ATP niveauer, hyperaktivering af poly (ADP -ribose) polymerase-1 (PARP-1) og proteolytisk spaltning af PARP-1 [10]. Nærværende undersøgelse fokuserer på at belyse den rolle, UGT’er i fastlæggelsen intracellulær akkumulation, ROS dannelse, apoptotisk effekt og SIRT1-FOXO1 pathway aktivering af β-lap i humane colon cancerceller.

Eksperimentel Afsnit

cellelinier og transfektioner

human coloncancer cellelinier HT29 og HCT116 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, USA). Celler blev dyrket i McCoys 5a med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO

2. Salg

celler blev transficeret med UGT1A siRNA eller negativ kontrol siRNA (Invitrogen) under anvendelse af lipofectamin RNAiMAX transfektionsreagens (Invitrogen) ifølge producentens revers transkription protokol.

Kemikalier og reagenser

β-lapachon blev opnået fra Southeast Pharmaceuticals, Inc . (Jiangsu, Kina). Propofol, N-acetylcystein (NAC), dicoumarol (DIC), 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT), glucose-6-phosphat, glucose-6-phosphat-dehydrogenase, β-nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADP), uridin-5′-diphosphat-glucuronsyre (UDPGA), D-saccharinsyre 1,4-lacton, β-D-glucuronidase og chlorzoxazon, blev alle anskaffet fra Sigma-Aldrich. Diazepam blev opnået fra det nationale institut for kontrol med farmaceutiske og biologiske produkter (Beijing, Kina).

Kvantitativ RT-PCR-analyse

I alt mRNA blev isoleret ved hjælp TRlzol (Invitrogen) og revers transskriberet til cDNA ifølge fabrikantens protokol (Takara). QRT-PCR blev udført med SYBR Premix ExTaq II (Takara) i et reaktionsvolumen på 10 pi. PCR-betingelserne var 95 ° C i 1 min, 40 cykler ved 95 ° C i 5 sekunder, 60 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sekunder. β-Actin-genet blev anvendt som en endogen kontrol.

Western blot assay

Til Western blotting blev cellerne ekstraheret i lysepuffer, opløst ved SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner. Proteiner blev påvist under anvendelse af specifikke primære antistoffer rettet mod UGT1A (H-300, 1: 200, Santa Cruz Biotechnology, USA), SIRT1 (H-300, 1: 200, Santa Cruz Biotechnology, USA), Ac-FOXO1 (D-19 , 1: 200, Santa Cruz Biotechnology, USA), FOXO1 (C29H4, 1: 1000, Cell Signaling, USA), TRAIL (C92B9, 1: 1000, Cell Signal Technology, USA), Bim (C34C5, 1: 1000, Cell signal Technology, USA), FasL (1: 200, BD Pharmingen, USA) eller BCL-6 (n-3, 1: 200, Santa Cruz Biotechnology, USA). Protein- ekspressionsniveauer blev normaliseret med GAPDH (1: 5000, Shengxing, Kina). Efter vask med TBST blev membranen inkuberet med HRP-konjugeret sekundært antistof (1: 10000, KeyGen, Kina) i 1 time. Signalet blev opdaget af forbedret cheniluminescence (ECL, Millipore).

Glucuronidering Analyse af β-lap i S9 Brøker

enzymkinetik assay for β-lap (,0625-3 uM) glucuronidering var udført i HT29 S9 (0,005 mg). HT29-celler blev høstet, resuspenderet med phosphatbufret saltvand, sonikeret og derefter centrifugeret ved 9000 g i 20 minutter. Supernatanten blev opsamlet som S9 fraktioner. For propofol inhiberingsundersøgelse, propofol (0-400 uM) blev co-inkuberet med β-lap (0,5 uM) ved 37 ° C i 10 min. Enzymet kinetiske analyse blev udført som beskrevet ovenfor med den metode, baseret på vores tidligere rapport [22].

intracellulær akkumulering og glukuronidering af β-lap i levedygtige celler

Celler med 80% sammenløb var eksponeret for 5 pM β-lap i 10, 20, 30, 60, 90, 120 min. Både celler og dyrkningsmedium blev opsamlet ved angivne tidspunkt. Celler blev høstet og vasket tre gange ved iskold fysiologisk saltvand. 300 pi ultrarent vand blev tilsat til hver brønd og frysning /optøning tre gange. Hver prøve blev tilsat tre gange iskold acetonitril, hvirvelbehandlet i 5 min og centrifugeret ved 18000 rpm i 10 min. Supernatanten blev opnået og analyseret ved LC-MS metode baseret på vores tidligere rapport [22].

ROS Assay og GSSG-GSH Ratio Assay

Celler blev inkuberet med 10 pM /l DCFH- DA i laste- medium ved 37 ° C i 30 min. Efter DCFH-DA blev fjernet, blev celler opsamlet, og 500 pi lysisbuffer (0,1 N NaOH i 50% MeOH) blev tilsat. Spin ved 6000 rpm i 1 min. Overfør 200 pi cellelysat at måle fluorescensintensiteten ved anvendelse fluorescenspladelæser. Excitationsfiltret blev indstillet til 488 nm og emission filter var 525 nm. Total glutathion og GSSG blev målt i henhold til GSH og GSSG Assay Kit (Beyotime, Jiangsu, Kina). blev afsløret absorbansændringer ved 412 nm med spektrofotometer. Mængden af ​​GSSG og GSH blev opnået særskilt efter standardkurve og deres forhold blev derefter beregnet.

cytotoksicitetsanalyse

Celler med 80% sammenløb blev udsat for 0 pM, 1,25 pM, 2,5 pM , 5 um, 10 um eller 20 uM β-lap. Efter dyrket i 24 timer blev 20 pi MTT tilsat til hver brønd og inkuberet i 4 timer ved 37 ° C. MTT-opløsning blev fjernet, og 150 pi DMSO blev derefter tilsat for at opløse MTT-krystaller. Absorbansen ved 570 nm blev opnået med spektrofotometer efter omrøring pladerne i 10 min på et rysteapparat.

Apoptose Assay

Celler med 80% sammenløb blev udsat for 5 uM β-lap i 24 timer og vasket ved iskoldt PBS. Apoptose blev kvantificeret ved anvendelse af APO-BrdU Kit (BD Biosciences, USA). Celler blev farvet ifølge producentens anvisninger. Mærkede celler blev analyseret med flowcytometri FACS Calibur (BD Biosciences, USA).

Statistisk analyse

Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM. T-test eller Mann-Whitney U test blev udført ved anvendelse Prism software. Statistisk signi fi tydning i t-test er plottet som følgende: * P 0,05, ** P 0,01 og *** P 0,001

Resultater

UGT1A Bestemmer β-lap Glukuronidering i HT29. Cell S9 Brøker

Ifølge vores tidligere undersøgelse [22], reduktion quinon og efterfølgende monoglucuronidation at producere et par regioisomerer (M1 og M2) er den fremherskende metaboliske vej af β-lap. Desuden UGT1A9 og UGT2B7 er de dominerende isozymer er ansvarlige for β-lap glukuronidering [22]. Vi således først evalueret UGT’er ekspressionsniveauer i både HT29 og HCT116 cellelinier. Real-time PCR-analyser viste, at flere UGT1A gener (UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, UGT1A7 og UGT1A9) positivt udtrykkes i HT29-celler, men ikke i HCT116 celler, i overensstemmelse med tidligere rapporter [7]. Imidlertid UGT2B7, som er overvejende ansvarlig for dannelsen af ​​β-lap glucuronidering metabolitten M1 [22], var ikke påviselig i både HT29 og HCT116-celler. Et højt ekspressionsniveau af UGT1A i HT29-celler og fraværet af UGT1A i HCT116-celler blev understøttet af western blot-assay. UGT1A siRNA skarpt faldt mRNA-niveauerne for multipel UGT1A og det totale UGT1A proteinekspression i HT29-celler.

I overensstemmelse med UGT’er ekspressionsprofil blev M2 detekteret i HT29 celler S9 fraktioner mens M1 var målbart, hvilket kan forklares med fraværet af UGT2B7 i colon cancerceller. Enzym kinetisk analyse viser, at β-lap glukuronidering udstillet en typisk Michaelis-konstanten i S9 fraktioner fremstillet af HT29-celler (Fig. 1A). UGT1A silencing førte til p-lap glucuronidering hæmning manifesteret med et signifikant fald i maksimal hastighed (V

max) og iboende clearance (CL

int, V

max /K

m) værdier, men ringe indflydelse i de tilsyneladende K

M værdier til fremstilling af M2 (fig. 1B, tabel 1). Som UGT1A9 specifikt substrat [23], viste propofol dosisafhængig hæmning af produktionen af ​​M2 i HT29-celler (fig. 1C).

HT29-celler S9 inkuberes med β-lap ifølge detaljerne i metoderne . (A) En typisk Michaelis-konstanten af ​​β-lap glucuronisering i HT29 celler S9 fraktioner; (B) UGT1A siRNA behandlede HT29-celler S9 fraktioner signifikant nedsætter β-lap glukuronidering; (C) hæmmende virkning på propofol på β-lap glucuronisering i HT29 celle S9 fraktioner. Resultaterne er præsenteret som gennemsnit ± 3 SEM af tre uafhængige forsøg (*** P 0,001, UGT1A siRNA behandling vs. negative kontrol celler)

UGT1A Kompromiser β-lap Ophobning i Colon. Cancer Cells

En cellulær farmakokinetisk undersøgelse blev udført for at teste, om UGT1A kan påvirke β-lap ophobning i levende celler. Den dynamiske intracellulære niveau af β-lap og dets metabolit M2 i HT29 og HCT116 celler blev undersøgt på forskellige tidspunkt af β-lap eksponering. Af interesse, β-lap opnået et meget højt niveau på 20 min og faldt derefter langsomt i HCT116-celler. I modsætning, fjernelse af β-lap i HT29-celler var meget hurtigere (fig. 2A). Både arealet under kurven 0 til 120 minutter (AUC

0-120 min) og maksimal koncentration (C

max) af β-lap i HT29 var signifikant lavere end i HCT116-celler (tabel 2). Forbehandling med propofol eller UGT1A siRNA i HT29-celler førte til et betydeligt højere niveau af β-lap, fremgår af både AUC

0-120 min og C

max værdier (fig. 2B, tabel 2, tabel 3). Konsekvent, M2 var påviselig i HT29 lige siden β-lap behandling, hvilket indikerer en hurtig glucuronidering af β-lap. Intracellulær M2 niveau toppede ved 20 min og faldt derefter (fig. 2C), mens M2 niveau i dyrkningsmedium løbende i hele den hele varigheden (fig. 2D). Forbehandling med enten propofol eller UGT1A siRNA transfektion reduceret M2-dannelse i HT29 celler såvel som i dyrkningsmediet (fig. 2C og 2D, tabel 2, tabel 3).

HT29 celler blev forbehandlet med propofol (100 uM ) i 1 time eller UGT1A siRNA i 24 timer. Celler blev udsat for p-lap (5 uM) for angivne tid. (A) Intracellulær β-lap niveau i HCT116 er meget højere end i HT29-celler; (B) Propofol eller siRNA forbehandling fører til intracellulær akkumulering af β-lap i HT29-celler; (C) propofol eller siRNA forbehandling nedsætter intracellulært M2 niveau i HT29-celler; (D) Propofol eller siRNA forbehandling falder M2 niveau i HT29 celledyrkningsmedium. Data er vist som middelværdi ± SEM 3 af mindst tre uafhængige forsøg (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0.001, propofol eller UGT1A siRNA forbehandling vs. kontrolceller).

UGT1A Eliminerer β-lap induceret ROS Formation

Baseret på vores tidligere arbejde, β-lap gennemgår NQO1 medieret reduktion to-elektron, danner en meget ustabilt catechol mellemprodukt, der kunne opleve glucuronidering med tilstedeværelsen af ​​UGT’er eller gendannes tilbage til p-lap i fravær af UGT’er [22]. I sidstnævnte proces blev overflod af ROS produceres, som derefter initierer celle apoptose [24]. For yderligere at bekræfte forholdet mellem β-lap s glucuronidering og de efterfølgende konsekvenser undersøgte vi ROS-dannelse ved DCF-farvning-assay i HT29 og HCT116-celler behandlet med β-lap. β-lap inducerede signifikant ROS-dannelse i HCT116-celler, som i vidt omfang kunne bekæmpes ved ROS eliminator N-acetyl-L-cystein (NAC) eller katalase, men ikke af UGT1A9 inhibitor propofol (fig. 3A). Imidlertid blev kun observeret β-lap induceret ROS-dannelse i HT29-celler, når de behandles med propofol, der også blev reduceret med NAC eller katalase (fig. 3B). Desuden UGT1A siRNA transfektion også signifikant forøget ROS-niveauer i HT29-celler (fig. 3C). Salg

Celler blev forbehandlet med UGT1A siRNA eller krypteret siRNA (negativ kontrol) i 24 timer, eller forbehandles med propofol (100 uM ) /NAC (5 uM) /katalase (4000 U) i 1 time. Derefter blev cellerne eksponeret til p-lap (5 uM) i 2 timer og ROS-assay eller GSSG /GSH-forhold blev udført. (A) ROS-dannelse og GSSG /GSH-forhold i HCT116-celler forbehandlet med propofol /NAC /katalase; (B) ROS-dannelse og GSSG /GSH-forhold i HT29-celler forbehandlet med propofol /NAC /katalase; (C) ROS-dannelse og GSSG /GSH-forhold i HT29-celler forbehandlet med siRNA /NAC /katalase. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± 3 SEM af mindst tre uafhængige eksperimenter (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0.001, β-lap behandling vs. kontrolceller; # P 0,05, ## P 0,05, $$ P 0,01, $ $ $ P. 0,001, katalase forbehandling vs. tilsvarende β-lap kun)

Reduceret glutathion (L-γ-glutamyl-L-cysteinyl-glycin, GSH) er den biologisk aktive form, der oxideres til glutathiondisulfid (GSSG) under oxidativ stress, og forholdet af GSSG-til-GSH tilbyder således en enkel og praktisk udtryk for cellulær oxidativ stress [25,26]. Vi derefter evalueres cellulære redox balance ved at teste GSSG /GSH i HT29 og HCT116 celler og fandt den samme ændring tendens som DCF farvning assays (fig. 3A, fig. 3B og fig. 3C).

UGT1A Påvirker β- lap induceret Cytotoksicitet i Colon Cancer Cells

Overdreven ROS inducerer oxidative modifikation af cellulære makromolekyler, hæmmer protein funktion og fremmer celledød [27]. Da UGT1A var stand til at inhibere ROS-dannelse, vi derefter udforskes, om UGT1A aktivitet påvirkninger β-lap induceret cytotoksicitet. Resultaterne viste, at β-lap udviste indlysende cytotoksicitet i HCT116-celler, der blev vendt ved NAC og katalase, men ikke af propofol (fig. 4A). I modsætning hertil β-lap cytotoksicitet til HT29-celler var uge, men kunne styrkes ved forbehandling med propofol (Fig 4B.); NAC og katalase var i stand til at vende denne virkning. Konsekvent, UGT1A siRNA transfektioner forbedret også den cytotoksiske virkning af β-lap i HT29-celler, som i væsentlig grad blev vendt ved NAC og katalase (fig. 4C). Salg

Celler blev forbehandlet med propofol (100 uM) i 1 time eller UGT1A siRNA i 24 timer. Derefter blev cellerne eksponeret for gradient koncentrationer af β-lap (0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 uM) i 24 timer og MTT-assayet blev udført. (A) β-lap induceret cytotoksicitet i HCT116 celler med propofol /NAC /katalase forbehandling; (B) β-lap induceret cytotoksicitet i HT29 celler med propofol /NAC /katalase forbehandling; (C) β-lap induceret cytotoksicitet i HT29 celler med siRNA /NAC /katalase forbehandling. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± 6 SEM af mindst tre uafhængige eksperimenter (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0.001, propofol /siRNA forbehandling vs. β-lap kun; # P 0,05, # # P 0,01, ### P 0,001, NAC og propofol /siRNA forbehandling vs. propofol /siRNA kun; $ $ P 0,01, $ $ $ P 0,001, katalase og propofol /siRNA forbehandling vs. propofol /kun siRNA ).

UGT1A Aktivitet Årsager Resistance af β-lap induceret apoptose i Colon Cancer Cells

Cell apoptotisk død blev evalueret ved TUNEL farvning assay for yderligere at undersøge den rolle, UGT’er i β- lap anti-cancer virkning. Coloncancerceller blev forbehandlet med propofol eller UGT1A siRNA at inhibere UGT1A9 aktivitet og derefter eksponeret for 5 uM β-lap i 24 timer. Data viste, at β-lap inducerede betydelig apoptose i HCT116-celler, som kunne reverseres ved NAC eller katalase, men ikke af propofol forbehandling (fig. 5A). Men i HT29-celler, β-lap induceret apoptotisk død var knap observeret efter 24 timers udsættelse. HT29-celler forbehandlet med propofol eller UGT1A siRNA og derefter til p-lap viste en signifikant apoptotisk celledød (fig. 5B, fig. 5C). Kombination forbehandling af NAC eller katalase med propofol eller UGT1A siRNA stort set annulleret den apoptotiske virkning af β-lap sammen med propofol forbehandling eller UGT1A siRNA transfektion af HT29-celler (fig. 5B, fig. 5C), hvilket antyder en dominerende rolle UGT’er i β- lap induceret apoptotisk død. Salg

Celler blev forbehandlet med propofol (100 uM) i 1 time eller UGT1A siRNA i 24 timer. Derefter celler blev udsat for p-lap (5 uM) i 24 timer og opsamles. Celle apoptose blev vurderet ved TUNEL-assay. (A) Cell apoptose i HCT116 celler med propofol /NAC /katalase forbehandling; (B) Cell apoptose i HT29 celler med propofol /NAC /katalase forbehandling; (C) Cell apoptose i HT29 celler med siRNA /NAC /katalase forbehandling. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± 3 SEM af mindst tre uafhængige eksperimenter (* P 0,05, ** P 0,01, β-lap behandling vs. kontrolceller; # P 0,05, NAC forbehandling vs. tilsvarende kun β-lap; $ P. 0,05, katalase forbehandling vs. tilsvarende β-lap kun)

UGT1A undertrykker β-lap -aktiverede FOXO1 apoptosecyklus i kolon kræftceller

Vores tidligere undersøgelser vist, at SIRT1-FOXO1 apoptosecyklus er involveret i β-lap induceret apoptotisk celledød. β-lap forårsager NAD

+ udtynding, reducerer aktiviteten af ​​NAD

+ – deacetylase tavs parring typen regulering information 2 homolog en (SIRT1), hvilket fører til reduceret deacetylering af Forkhead kasse O 1 (FOXO1) og øget akkumulering af acetyleret-FOXO1 (Ac-FOXO1) og derved den forøgede transskriptionelle aktivitet over flere nedstrøms apoptotiske mål. For at validere, om denne vej også er involveret i UGT1A-undertrykte apoptotiske virkning af β-lap, undersøgte vi aktiveringen af ​​SIRT1-FOXO1 pathway efter β-lap eksponering med eller uden propofol eller UGT1A siRNA forbehandling. Ifølge real-time PCR og Western blot assays resultater blev ekspressionen af ​​SIRT1 stærkt hæmmet, mens FOXO1, Ac-FOXO1 samt dens downstream apoptotiske target proteiner (BIM, FasL, TRAIL, og Bd-6) blev alle opreguleret efter β-lap eksponering i HCT116-celler (figur 6A.); denne virkning kan i vid udstrækning revesed af NAC eller katalase forbehandling men ikke af propofol (fig. 6A). I modsætning hertil HT29-celler, β-lap alene kunne ikke reducere SIRT1 udtryk og fremkalde FOXO1 grund af den hurtige fjernelse af β-lap. Imidlertid blev lignende resultater som dem observeret i HCT116 celler fundet i HT29-celler forbehandlet med propofol eller UGT1A siRNA, som også blev modvirket af NAC eller katalase (fig. 6B, Fig. 6C).

Celler blev forbehandlet med propofol (100 uM) i 1 time eller UGT1A siRNA i 24 timer. Derefter blev cellerne eksponeret til p-lap (5 uM) i 24 timer og opsamles. Cell mRNA niveauer blev vurderet ved PCR og proteinniveauer ved Western blot assays. (A) Relative mRNA og protein niveauer i HCT116 celler med propofol /NAC /katalase forbehandling; (B) Relative mRNA og protein niveauer i HT29 celler med propofol /NAC /katalase forbehandling; (C) Relative mRNA og protein niveauer i HT29 celler med siRNA /NAC /katalase forbehandling. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± 3 SEM af mindst tre uafhængige eksperimenter (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0.001, propofol forbehandling vs. kontrolceller eller UGT1A siRNA forbehandling vs. scrambled siRNA forbehandling; # P 0,05, ### P 0,001, NAC forbehandling vs. tilsvarende β-lap kun, $ P 0,05, $ $ P. 0,01, katalase forbehandling vs. tilsvarende β-lap kun)

Discussion

β-lapachon (β-lap) er et lovende anticancermiddel af en virkningsmekanisme meget afhængig af enzymet NQO1, et flavoprotein fundet overudtrykt i forskellige cancerceller [10,28,29] . Tidligere undersøgelser i vores laboratorium viste, at UGT1A9 og UGT2B7 er de vigtigste to UGT isoformer som katalyserer metabolismen af ​​β-lap i human lever og tarm S9 inkubationer [22]. Selvom flere rapporter har fremlagt beviser for en glucosylsulfate konjugat metabolit af β-lap, glukuronidering er sin dominerende stofskifte mønster. Da UGT’er medierede glucuronideringsprocesser regnskab for multipel lægemiddelresistens i kræftbehandling [30-32], vurderet vi potentielle rolle UGT’er medierede cellulære metabolisme af β-omgang i fastlæggelsen af ​​dens anti-cancer effekter i humane colon cancerceller. Et par cellelinjer blev valgt i vores undersøgelse, en med høje niveauer af UGT1A (HT29) og en anden uden UGT1A udtryk (HCT116), som også var involveret udforskninger på UGT’er [23,33,34]. Glucuronidering metabolit M2, men ikke M1, af β-lap blev detekteret i HT29 celler og S9 fraktioner svarende til den, observeret fra den humane intestinale S9 undersøgelse [22]. Dette kan rationelt forklares ved den lave ekspression af UGT2B7 i fordøjelsessystemet [7]. UGT1A9 typisk inhibitor propofol eller UGT1A siRNA viste potent hæmmende effekt på M2 dannelse, hvilket indikerer UGT1A9 er den vigtigste isoform af β-lap glucuronisering i HT29-celler. Sammenlignet med HT29-celler, mangel på UGT1A9 i HCT116-celler fører til en betydelig højere AUC værdi af β-lap og udetekterbar M2. Enten propofol eller UGT1A siRNA forbehandling bemærkelsesværdigt intensiveret intracellulær ophobning af β-lap, støttet af betydelig højere C

max og AUC-værdier. Det er værd at nævne, at intracellulære M2 niveauer faldt i løbet af tidsforløbet, mens der i dyrkningsmedium steg kontinuerligt, hvilket indikerer en eliminering af β-lap metabolit fra cellerne til det ekstracellulære medium.

Som beskrevet detaljeret i vores tidligere arbejde, β-lap stofskifte involverer to trin [22]. Det første trin er to-elektron reduktion til frembringelse af en catechol mellemprodukt, der fremmes af to-elektron reduktion quinon enzym NQO1. Denne proces kan vendes automatisk i en ikke-enzymatisk tilstand, der producerer store mængder af ROS [22,24]. I UGT’er-positive celler, er catechol mellemprodukt underkastes øjeblikkelig glucuronidering og således bryde redox cyklus ved at omdirigere til fremstilling af stabile β-lap glucuronider [22]. Derfor UGT1A ikke kun bestemmer intracellulær ophobning af β-lap, men endnu vigtigere kan forstyrre NQO1-udløst redox cyklus, der er den dominerende mekanisme for β-lap til at fremkalde sin anti-tumor effekt. Dette faktum antyder, at ekspressionen af ​​UGT1A i cancerceller kan blive en vigtig mekanisme bag den iboende modstand af β-lap. For at teste denne hypotese undersøgte vi potentielle indflydelse af UGT1A i β-lap-induceret ROS produktion, cytotoksicitet, apoptose og apoptotisk signaltransduktion. Som formodet, β-lap udløst betydelig ROS produktion, cellulære redox homeostase uorden, og stærk cytotoksicitet ved meget lav koncentration og kort tid eksponering i HCT116 celler. I modsætning hertil blev ROS produktion og den deraf cytotoksicitet i HT29-celler kun observeret i tilstedeværelsen af ​​propofol eller UGT1A siRNA, der giver stærke beviser for, at UGT1A er en vigtig determinant i cytotoksiske effekt af β-lap.

Næste udvidet vi undersøgelsen til at bestemme den potentielle indflydelse af UGT1A i at forstyrre apoptotisk celledød pathway aktiveret af β-lap. Flere tilstande og mekanismer β-lap celledød herunder apoptose, programmeret nekrose, og autophage er blevet rapporteret [10,35,36]. Her fandt vi, at β-lap hovedsagelig inducerede et typisk apoptotisk død human coloncancer-cellelinjer. Sirtuin, en konserveret familie af NAD

+ – afhængige deacetylaser og mono-ADP-ribosyltransferases, har vist sig involveret i diverse cellulære processer, såsom gendæmpning, DNA-reparation, levetid udvidelse og celle apoptose [37-39]. β-lap induceret apoptotisk celledød er kendetegnet med en dramatisk NAD

+ depletion og reduceret SIRT1 aktivitet, hvilket fører til stigende ophobning af acetyleret FOXO1 og derefter den transkriptionelle aktivering af dens downstream apoptotisk målgener i HCT116-celler. I modsætning hertil blev aktiveringen af ​​denne typiske apoptosecyklus i HT29-celler kun observeret med propofol eller UGT1A siRNA forbehandling. Nedskrivningen af ​​β-lap evne til at aktivere SIRT1-FOXO1 apoptosecyklus i HT29-celler på grund af glukuronidering hints der UGT’er høj ekspression i cancerceller kan påvirke svarene på mange terapeutiske lægemidler. Desuden er både NAC og katalasebehandling vid udstrækning forhindret aktiveringen af ​​denne apoptotisk celledød signal, hvilket antyder, at ROS-produktion fra NQO1-udløst redox-cyklus kan være den vigtige afslappet faktor for den apoptotiske virkning af β-lap og at UGT1A kan forårsage indre resistens via aflede redox cyklus.

sammenfattende viste vi, at UGT1A spiller en afgørende rolle i intracellulær ophobning og den deraf apoptotiske effekt af β-lap i colon cancerceller. Mangel på UGT’er aktivitet øger muligheden for løbende redox cyklus af β-lap, hvor overdreven ROS produceres og endelig fører til apoptotisk celledød. Tværtimod høje UGT1A aktivitet, især UGT1A9 kan bryde denne cyklus og fremme β-lap metaboliske eliminering. Den foreliggende undersøgelse sammen med vores tidligere arbejde vink til at anti-cancer effekter af NQO1 målretning agenter i høj grad er forbundet med resten af ​​udtryk og aktivitet af NQO1 og UGT1A. Især tumorvæv normalt bære meget højere NQO1 [40,41], men lavere UGT’er [5,42] end i normale væv. Denne egenskab giver β-lap samt andre NQO1 målretning, såsom Tanshinone IIA [7,24] en funktion af høj selektivitet i dræbende cancerceller samtidig skåne normale væv. Sammen med vores tidligere undersøgelse om Tanshinone IIA, det igangværende arbejde med β-skødet understreger yderligere, at UGT’er medicineret stofskifte kan udgøre en central mekanisme i forårsager iboende kemoresistens af NQO1 målrette midler, der er normalt UGT’er ‘substrater.