PLoS ONE: leukocyt DNA Methylering Signature Differentierer bugspytkirtelkræft Patienter fra Sund Controls

Abstrakt

Pancreas adenocarcinom (PAC) er en af ​​de vanskeligste tumorer at behandle. Meget af dette skyldes den sene diagnose. For at identificere biomarkører til tidlig opdagelse, vi undersøgte DNA methylering forskelle i leukocyt DNA mellem PAC cases og kontroller i en tofaset studie. I fase I, vi målte methylering niveauer 1.505 CpG steder i behandling-naive leukocyt DNA fra 132 aldrig-ryger PAC patienter og 60 aldrig-ryger raske kontrolpersoner. Vi fandt signifikante forskelle i 110 CpG sites (falsk opdagelse sats 0,05). I fase II, vi testet og godkendt 88 af 96 fase I valgte CpG websteder i 240 Pac tilfælde og 240 matchede kontroller (p ≤ 0,05). Brug straffet logistisk regression, vi byggede en forudsigelse model, som består af fem CpG sites (IL10_P348, LCN2_P86, ZAP70_P220, AIM2_P624, TAL1_P817), der diskriminerede PAC patienter fra kontroller (C-statistik = 0,85 i fase I, 0,76 i fase II). Interessant, kunne man CpG websted (LCN2_P86) alene diskriminerer resekterbare patienter fra kontroller (C-statistik = 0,78 i fase I, 0,74 i fase II). Vi udførte også methylering kvantitativ trait loci (methQTL) analyse og identificeret tre CpG sites (AGXT_P180_F, ALOX12_E85_R, JAK3_P1075_R) hvor methylering niveauer blev signifikant forbundet med enkelte nukleotid polymorfier (SNP) (falsk opdagelse sats 0,05). Vores resultater viser, at epigenetisk variation i let opnåelige leukocyt DNA, manifesteret ved reproducerbare methyleringsforskelle, kan anvendes til påvisning af pac-patienter. De methyleringsforskelle på bestemte bindingssteder for CpG er delvis tilskrives genetisk variation. Denne undersøgelse støtter kraftigt fremtidige epigenome-sammenslutning forsøg med leukocyt DNA for biomarkør opdagelse i humane sygdomme

Henvisning:. Pedersen KS, Bamlet WR, Oberg AL, de Andrade M, Matsumoto ME, Tang H, et al. (2011) leukocyt DNA Methylering Signature Differentierer bugspytkirtelkræft Patienter fra raske kontrolpersoner. PLoS ONE 6 (3): e18223. doi: 10,1371 /journal.pone.0018223

Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland

Modtaget: November 17, 2010; Accepteret: 24. februar, 2011; Udgivet: 24 marts 2011

Copyright: © 2011 Pedersen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Mayo Clinic SPORE i kræft i bugspytkirtlen (P50 CA102701) og Institut for Laboratory Medicin og Patologi, Mayo Clinic. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen (PAC) er den 10

th mest almindelige tumortype for mænd og kvinder i årlig forekomst i USA og den fjerde hyppigste årsag til dødelighed af kræft [1]. PaC er forbundet med en meget dårlig prognose, da det fortsat er en af ​​de mest vanskelige tumorer at behandle. Meget af dette kan tilskrives den sene fase, hvor kræft er normalt påvises. Mellem 1999 og 2006, blev kun 8% af patienterne diagnosticeres, ofte ved tilfældige fund på radiologiske billeddannelse, på et lokaliseret stadium, hvor øjeblikkelig kirurgisk resektion og efterfølgende kur kunne anses [2]. I øjeblikket er der ingen anbefalede screeningforanstaltninger [3]. Med få eller ingen karakteristiske symptomer og ufølsomme metoder til tidlig påvisning, helbredende indgreb er sjældne.

Epigenetik spiller en vigtig rolle i udviklingen sygdom, fordi det forener nukleare omprogrammering under udvikling, miljømæssigt inducerede ændringer på kroppen, og evnen af celler til at reagere hensigtsmæssigt på eksterne stimuli [4]. Epigenetiske variationer er arvelige ændringer i genekspression, som forekommer i fravær af en ændring i DNA-sekvensen selv. DNA-methylering, histon modifikation og microRNA regulering kan ændre genernes udtryk profiler. Disse udtryk forandringer ofte føre til de afvigende vækstmønstre af neoplastiske celler [4].

Talrige undersøgelser peger på resultater, som en DNA-methylering profil dybt ændres i humane kræftformer, hvor den globale tab af DNA methylering og promotor hypermethylering er både rapporteret [5], [6]. For PAC har tidligere undersøgelser identificeret et panel af gener, som er afvigende methylerede og bragt til tavshed i tumorvæv, herunder

ppENK

,

SPARC

,

TFPI2

,

FOXE1

,

NPX2

,

TSLC1

,

p16

,

P14

,

p57

, og

CCND2

[7] – [12]. Disse gener er stærkt methyleres i pancreas tumorvæv og sjældent methyleres i nonneoplastic bugspytkirtel væv [13]. En nylig undersøgelse rapporteret, at ekspressionen af ​​58 gener blev reguleret ved differentiel methylering. Derudover blev 10 methylering markører forbundet med ændret ekspression af gener kritiske til

gemcitabin

reaktionsevne [14]. Men disse undersøgelser er blevet udført, enten ved hjælp

in vitro

systemer, såsom cellelinjer, eller

in vivo

med bugspyt prøver og primære tumorvæv, som er vanskelige at erhverve for kræftscreening på grund af den invasive karakter af disse prøveudtagning procedurer [13]. På grund af de risici, omkostninger og vanskeligheder med at opnå pancreas sekreter og væv til tidlig diagnose, en minimalt invasiv teknik, såsom prøvetagning blod er en mere realistisk tilgang til screening.

Differential methylering mellem kræftpatienter og normale kontroller har været rapporteret i perifert blod DNA’er, selv om lidt er kendt for PaC [15] – [18]. Moore

et al.

[16] rapporterede en sammenslutning af leukocyt DNA hypometylering med blærekræft, uafhængigt af rygning og de øvrige vurderede risikofaktorer. Widschwendter

et al.

[18] undersøgte locus-specifik methylering og fundet, at bestemte DNA methyleringsmønstre i perifert blod kan tjene som surrogatmarkører for brystkræft. I en nylig småcellet lungecancer undersøgelse, methylering profilering analyse leukocyt DNA identificeret to CpG websteder, der i fællesskab diskriminerede kræftpatienter fra ikke-cancer kontrol [17]. Disse resultater viste, at methylering status i leukocyt DNA prøver kan give en nyttig biomarkør for potentielle tidlig opsporing og differentialdiagnose. At identificere methylering markører for kliniske anvendelser, vi undersøgte methylering profiler i en to-faset case-kontrol undersøgelse, som omfattede kandidat markør opdagelse og validering, samt opbygning af modeller.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle emner forudsat skriftligt informeret samtykke; og undersøgelsen blev godkendt af Mayo Clinic IRB.

studiepopulation

pac indekstilfælde var voksne patienter med en histologisk bekræftet primært adenocarcinom i bugspytkirtlen set på Mayo Clinic mellem den 1. oktober, 2000 og 1. juni blev 2006. Kvalificerede Mayo pancreas adenocarcinom tilfælde identificeret gennem en ultra-hurtig identifikation patient-system og rekrutteret til en fremadrettet forskning registreringsdatabasen. Undersøgelse koordinatorer identificeret potentielle patienter fra den elektroniske patient planlægning systemet og daglige patologi rapporter. Alle egnede patienter blev kontaktet enten i klinikken på tidspunktet for deres udnævnelse, eller senere via mail eller telefon, hvis klinikken kontakt ikke var muligt. Hvis kontaktes på klinikken, en undersøgelse koordinator opnået informeret samtykke, arrangeret en venepunktur i 40 ml blod før start af behandling (når det er muligt), og spurgte deltageren at fuldføre studiet spørgeskema. Hvis mail kontakt var påkrævet (ca. 28% af tilfældene blev kontaktet via mail), den studiekoordinator sendt en indbydelse til patientens privatadresse. En opfølgende telefonopkald blev foretaget, hvis prøven eller former, der ikke blev modtaget efter 1 måned. Ca. 74% af alle egnede patienter blev indrulleret i registreringsdatabasen. Fra registreringsdatabasen, valgte vi 132 aldrig-ryger patienter i fase I og 240 patienter i fase II med ligelig repræsentation af køn, rygning status (ryger /ikkeryger) og fase af AKP (resektabel lokalt fremskreden og metastatisk).

De sunde kaukasiske kontroller blev udvalgt fra en Mayo Clinic-baserede forskning register af primær pleje kontrol patienter med rutinemæssige kontrol-up besøg (alment eksamen) mellem 1 maj 2004 og den 31. august, 2006. kontroller blev frekvens-matchede til tilfælde på alder (± 5 år), køn og tilstand /bopælsregion fordeling af sagerne. Controls havde ingen tidligere diagnose af kræft (bortset fra ikke-melanom hudkræft) på tidspunktet for indskrivning. Forud for deres udnævnelse, blev potentielle kontroller sendt en informationsbrochure, der beskriver undersøgelsen og en invitation. På dagen for udnævnelsen, en undersøgelse assistent nærmede emnet, bekræftede støttekriterier, og opnåede informeret samtykke. Hver deltager afsluttet undersøgelse spørgeskemaer (som omfattede en selvrapportering af højde, vægt og diabetes status) og leveres 30 ml forskning blodprøve. Ca. 70% af alle nærmede kontroller deltog i denne undersøgelse. Fra denne registreringsdatabasen vi valgt 60 aldrig ryger styringer til fase I og 240 kontroller (halvdelen er aldrig rygere) til fase II.

DNA modifikation af natriumbisulfit

Vi udvundet DNA fra 5 ml hele blod under anvendelse af en AutoGen FlexStar (AutoGen, Inc., MA) og ændret genomiske DNA prøver vha EZ methylering af DNA kit fra Zymo Research Corporation (Orange, CA) at kombineret omdannelse med bisulfit og DNA rengøring. Kittet er baseret på det tre-trins reaktion, der finder sted mellem cytosin og natriumbisulfit hvor cytosin omdannes til uracil. Vi anvendte 1 ug genomisk DNA fra perifert blod DNA for modifikation per fabrikanten anbefaling. Behandlede DNA prøver blev opbevaret ved -20 ° C og blev analyseret inden for to uger.

DNA methylering profilanalyse

Illumina (San Diego, Californien) GoldenGate methylering Beadchip (kræft panel) og Illumina custom VeraCode methylering assay blev anvendt til fase i og fase II, henholdsvis at følge fabrikantens procedure. Vi afbildes arrayene bruger BeadArray Reader scanner (Illumina, Inc.). Andelen methyleret (β-værdi) på hvert CpG-sted blev beregnet ved anvendelse BeadStudio Software (Illumina, Inc.) efter subtraktion baggrund intensitet, som blev beregnet ud fra negative kontroller fra hver analytisk datapunkt. Den β-værdi repræsenterede relative forhold af fluorescerende signaler mellem M (methyleret) allel og M + U (methylerede) alleler. Denne værdi varierer kontinuerligt fra 0 (umethyleret) til 1 (fuldt methylerede).

Differential methyleringsanalyse

På grund af ikke-Gauss fordeling af CpG methylering værdier, vi brugte Wilcoxon Rank Sum test til undersøge forskelle i median p-værdier mellem cases og kontroller i både fase i og fase II. For at korrigere for multiple test i fase I, vi brugte q-værdier til at repræsentere den falske opdagelse sats (FDR) [19]. De CpG’er med FDR q-værdi ≤0.05 niveau blev anset for signifikante. Disse CpG’er blev derefter kandidater til fase II validering, hvor en p-værdi ≤0.05 blev betragtet som signifikant. Bland-Altman plots og Spearman korrelationskoefficient blev brugt til at evaluere aftale mellem de to methylering analyser i de 40 forsøgspersoner analyseret i både fase I og fase II. De Bland-Altman plot tillader evaluering af assay uenighed som en funktion af niveau af methylering [20].

methQTL analyse

Brug Plink (https://pngu.mgh.harvard.edu/~ purcell /Plink /) til denne undersøgelse, udførte vi en kvantitativ egenskab association analyse ved at behandle hvert CpG β-værdi som fænotypen (kvantitativ egenskab), og SNP genotyper fra en tidligere genom-dækkende sammenslutning undersøgelse (GWAS) som prædiktor [21]. FDR blev beregnet på grundlag af de p-værdier fra kvantitativ egenskab forening Wald test. CpG-SNP-par med en FDR ≤0.05 blev anset signifikant (dvs. tegn på en SNP – CpG methylering forening). Fordi alder, køn, rygning status og undersøgelsesfase kan påvirke methylering niveauer, den methQTL analyse justeret for disse variabler. Resultaterne fra denne analyse blev anvendt til at vurdere den genetiske effekt på CpG methylering.

modelbygning Forudsigelse

At udvikle prognosemodeller, vi udnyttet sandsynlighed cross-valideret straffet logistiske regressionsmodeller, der gennemførte enten en L1 straf (Lasso) [22] eller en L2 straf (Ridge) ved hjælp af R-pakken “straffet” [23]. En Lasso model (eller L1 straf) blev anvendt i fase I teste undersøgelse på grund af sin ønskeligt træk til model udvælgelse, som har en minimal effekt på tilknyttede CpG koefficienter, mens du angiver ikke-tilknyttede CpG’er ‘koefficienter til nul. En Ridge regression model (eller L2 straf), der krymper alle koefficienter til små værdier, men ikke nuller blev også betragtet til model bygning. Den variable udvælgelsesproces reguleres af en parameter, der tvinger alle koefficienter, der skal krympes tæt på nul i første omgang, derefter gradvist frigives til at reducere mængden af ​​krympning. Den optimale værdi af denne parameter bestemmes via krydsvalidering. Modelresultaterne Ridge blev også sammenlignet med resultater fra Lasso model til at finpudse den endelige model.

Den endelige model er identificeret gennem straffes tilgange blev derefter egnet som en generaliseret lineær model (logistisk regression) ved hjælp af R-pakken ‘ GLM ‘, for at estimere arealet under (AUC) modtageren opererer karakteristik (ROC) kurve for hver model. Modeller blev monteret i både den indstillede test (fase I) og validering sæt (fase II) separat med AUC rapporteret for hver model. Baseret på hver fitningsmetode blev sandsynligheden for hvert individ, der er en sag (kontrol) beregnet. Hvis sandsynligheden for at være en sag var større end 0,50 individet ville have været klassificeret som en sag. Følsomheden er defineret som procent af tilfældene korrekt klassificeret som sager, der bruger modellen. Specificiteten er procent af kontroller korrekt klassificeret som kontrol ved hjælp af modellen.

Ud over den ujusterede model (kun CpG’er), to mere modeller blev monteret, en, der betragtes som alder, køn og første grad familiens historie som kovarianter og en anden, der også betragtes ABO blodtype ( “O” vs “ikke-O ‘) som en yderligere kovariant. ABO blodtyper blev afledt til en undergruppe af patienter, som havde GWAS genotype oplysninger [21] til rådighed. Fase II modeller blev passe to måder. Først koefficienter fra fase I blev afholdt fast og diskrimination vurderes. For det andet, da analysen platform ændret fra fase I til fase II, blev modellerne passer tillade koefficienter, der skal re-estimeres.

Resultater

Identifikation af differentielt methylerede CpG sites i fase I

For fase I, vi undersøgte 132 aldrig-ryger patienter med PaC og 60 aldrig-ryger raske kontrolpersoner. På grund af kemo- eller strålebehandling før blod blev trukket, blev 13 patienter udelukket fra denne analyse. Vi evaluerede status methylering (beta-værdier) af 1.505 CpG sites fra leukocyt DNA i de resterende 119 tilfælde og 60 kontroller (tabel 1). Fordi betydelige methylering forskelle på X-kromosomet eksisterer mellem mænd og kvinder, vi analyserede CpG sites på autosomer og sex kromosom separat. Disse analyser identificeret væsentlige forskelle mellem AKP patienter og kontroller ved 110 CpG sites i 92 uafhængige gener (FDR ≤ 0,05). 109 af de 110 signifikante CpG steder blev placeret på autosomer. Tabel 2 viser de 10 mest betydningsfulde CpG steder i fase I studie.

For at vurdere for potentielle kønsforskelle, vi sammenlignede 1421 autosomale CpG sites mellem mænd og kvinder. Vi observerede signifikante forskelle på 71 CpG sites, når man kombinerer sager og kontroller. Når analyseret disse CpG sites i tilfælde og kontroller hver for sig, vi observerede forskelle i 44 CpG sites for PAC patienter og 6 CpG sites for kontroller (tabel S1). For at vurdere eventuelle ændringer methylering under tumorprogression, vi undersøgte methylering forskellene mellem tre stadier af AKP i denne patientpopulation, herunder 31 resektable, 45 lokalt fremskredne, og 43 metastatiske tilfælde. Selvom ni CpG sites viste en tendens i forbindelse med klinisk fase (p 0,01) (tabel 3), har dataanalyse ikke afslører signifikant forskel mellem de tre faser (alle CpG sites med FDR 0,05).

Validering af udvalgte CpG steder i fase II

for at validere de differentielt methylerede CpG udpegede lokaliteter i fase i i et større antal patienter og en bredere vifte af demografiske karakteristika, vi designet en brugerdefineret VeraCode methylering assay (Illumina, Inc.) og undersøgt 96 af de 110 signifikante CpG websteder i 240 Pac tilfælde og 240 matchede kontroller. De 96 CpG steder blev udvalgt efter median Ø forskelle mellem sager og kontroller. For CpG sites med lignende median Ø forskelle blev CpG websteder med mindre FDR valgt. Blandt de 480 forsøgspersoner blev 40 fase I forsøgspersoner (20 tilfælde og 20 kontroller) med for at sammenligne graden af ​​enighed mellem de to methylering assays. Bland Altman plots [20] viste lidt gennemsnitlig skift og konstant variation af forskelle over område af værdier (figur 1), hvilket viser rimelig aftale mellem de to analyser. De to assays blev signifikant korreleret som forventet blandt alle 96 CpG sites. Den mediane Spearman korrelationskoefficienten r var 0,94 (interval 0,84-0,96).

Repræsentant Bland-Altman graf i et emne viser god overensstemmelse mellem fase I og fase II data i de fleste 96 CpG sites. Hver prik repræsenterer en CpG site. Mean methylering for hver CpG websted (fra 0 til 100%) er vist i x-aksen. Methylering niveauforskel for hvert CpG-sted mellem fase I og fase II, er vist i y-aksen. De stiplede linjer angiver 95% konfidensinterval for forskellen mellem de to assays og den faste linje angiver den gennemsnitlige forskelle mellem de to analyser.

Blandt de 220 Pac patienter, der var enestående til fase II, 47 patienter var blevet behandlet før blod blev trukket. Vi sammenlignede methylering niveauer mellem disse 47 behandlede tilfælde og 173 aldrig-behandlede tilfælde at evaluere effekten af ​​behandling på status for methylering af disse udvalgte CpG sites. To CpG sites (TAL1_P817_F og CSF3_E242_R) viste nominelle forskelle (p = 0,001 og 0,025 henholdsvis), selv om disse resultater kan skyldes tilfældigheder, betragtning af det store antal sammenligninger. Samlet set har vi ikke oplever en betydelig behandlingseffekt på methylering af disse valgte CpG sites. Tilsvarende ingen virkning henføres til rygevaner (data ikke vist). Af de resterende 220 kontroller, blev fem yderligere kontroller udelukket på grund af utilstrækkelig kvalitet, hvilket efterlader 215 kontroller, der var unikt for fase II (tabel 1). I alt 173 aldrig behandlede sager og 215 kontroller blev analyseret i fase II. Den Wilcoxon Rank Sum Test identificeret en signifikant forskel (p ≤ 0,05) i 88 af de 96 udvalgte CpG’er. Vigtigt er det, alle 88 af disse validerede bindingssteder for CpG i fase II viste også den samme retning af methylering ændring som fase I (figur 2). Af dem, 23 og 65 CpG sites demonstrerede hypermethylering og hypometylering i PAC patienter. Tabel 2 viser de 10 mest betydningsfulde CpG steder i fase II studie (tabel S2 indeholder statistik over de 96 CpG steder i både fase I og II).

Scatter plot viser reproducerbare methylering forskelle mellem fase I og fase II . Wilcoxon Rank Sum z-værdierne blev afbildet på x-aksen (fase I) og y-aksen (fase II). 88 af de 96 CpG steder blev valideret af p-værdi ( 0,05) og retning (hyper /hypo-methylering). Selvom 8 CpG steder ikke var statistisk signifikante, tendenserne i begge faser er alle de samme.

Genetisk effekt på DNA methylering

For at undersøge, om der var nogen genetisk indflydelse på CpG methylering vi regression methylering niveau (β-værdi) for hver af 96 fase II CpG sites på tilsvarende SNP genotyper i 1 MB målet CpG site. Der var 16,217 genotypede SNP’er omkring de 96 CpG sites med en mindre allel frekvens ≥0.1. 135 kontroller og 194 patienter havde SNP genotypedata. Brug en additiv model og justering for alder og køn, vi identificeret 33 CpG-SNP par (methQTLs) i kontroller og 99 methQTLs i Pac tilfælde med en FDR ≤0.05 (figur 3 og tabel S3). Af dem blev 24 methQTLs deles mellem begge tilfælde og kontroller. Disse delte methQTLs involverede tre uafhængige CpG sites. De methQTLs med de stærkeste foreninger for de tre CpG sites var ALOX12_E85_R og rs434473 (FDR = 1,66 × 10

-25 i kontrol og 3,01 × 10

-14 patienter), AGXT_P180_F og rs4675872 (FDR = 1,83 × 10

-9 i kontrol og 3,73 × 10

-15 patienter), og JAK3_P1075_R og rs7245564 (FDR = 1,89 × 10

-4 i kontrol og 3,48 × 10

-4 i patienter), (tabel 4). Afstanden mellem SNP’er og target CpG’er var mindre end 15,5 Kb for alle tre par rapporteret her. Vi udførte også methQTL analyse justering for faser af undersøgelsen og /eller rygning historie foruden alder og køn. Disse resultater var i overensstemmelse med dem, når der korrigeres for alder og køn alene (tabel S3).

methylering niveauer for hver af 96 CpG steder blev regresseret på eksemplar række mindre alleler på nærliggende (+/- 1 Mb) SNPs . CpG sites blev anbragt på x-aksen baseret på deres rækkefølge af kromosomal placering. Y-aksen var -log10 af methQTL p-værdi efter justering for alder og køn. Størrelse af hver prik var proportional med betydningen af ​​hver p-værdi. A. kontrol-only methQTLs og B. case-only methQTLs.

Fotos

Bygning og validering af forudsigelsen model

At opbygge forudsigelse-modeller baseret på fase I data, vi først udelukket 43 af de 96 CpG sites, der viste mindre end 5% median Ø forskelle mellem tilfælde og kontroller eller p-værdi ≥0.001 (FDR 0,007) i fase I. Disse filterkriterier blev fastsat for de følgende tekniske overvejelser. Først CpG sites med mindre methylering forskelle er tilbøjelige til laboratoriet fejl på grund af tekniske begrænsninger. For det andet, CpG sites med mindre væsentlige p-værdier er mindre tilbøjelige til at blive replikeret i en fremtidig undersøgelse. Baseret på 53 resterende CpG sites, vi først bygget modeller med L1 og L2 sanktioner som beskrevet i de metoder, ved hjælp af fase I data. Den bedste model blev valgt på grundlag af kriterierne i ROC AUC og sparsommelighed. Denne model blev derefter testet ved hjælp af fase II-data uden de 40 emner analyseret i begge faser for aftalen studiet. Når man overvejer alle tilfælde og alle knapper, identificerede vi et panel af fem CpG sites (Model I: IL10_P348, LCN2_P86, ZAP70_P220, AIM2_P624, TAL1_P817), der var de første fem CpG’er at komme ind og forblive i Lasso model og også de fem største koefficienter fra Ridge model. Dette fem CpG-only model viste god forskelsbehandling mellem patienter og kontroller (c-statistik = 0,85 i fase I og 0,76 i fase II) baseret på logistiske regressionsmodel. Når specificitet blev sat til 0,90, den maksimale følsomhed var 0,65 i fase I og 0,51 i fase II. Når specificitet blev sat til 0,70, den maksimale følsomhed var 0,83 i fase I og 0,72 i fase II (se tabel S4 for hele spektret af specificitet og følsomhed). Når herunder kovariater i den logistiske regressionsmodel (alder, køn, 1

st grad af familiens historie af AKP, ABO blodtype), blev diskrimination forbedret i fase I (c-statistik = 0,89), men faldt i fase II (c-statistik = 0,72). Når re-estimering koefficienter disse kovariater i fase II (re-montering), blev diskrimination forbedret som forventet, men (kun c-statistiske = 0,77 for fem CpG’er, 0,77 efter optagelsen af ​​kovariater) ikke dramatisk (tabel 5). Når herunder kun resekterbare patienter og alle knapper, vi identificeret en CpG websted (Model II: LCN2_P86), der syntes at diskriminere for resektabel sygdom (c-statistik = 0,78 i fase I og 0,74 i fase II)

diskussion

i denne to fase (test-validering) studie undersøgte vi perifert blod DNA at afgøre, om forskelle i methylering på forskellige CpG sites kunne skelne mellem personer med og uden PaC. Vi begrænset vores undersøgelse til de patienter, der aldrig var blevet behandlet for kræft (både fase I og II), og i fase I til dem, der aldrig havde røget. Vi demonstrerede højsignifikant hypo- eller hypermethylering loci i leukocyt DNA fra patienter med PaC. Dette var tilfældet i begge faser af undersøgelsen og syntes at forblive signifikant med justering for rygning status og kræftbehandling. Vigtigt er det, fandt vi, at methylering forskelle ikke var signifikant på tværs af de forskellige stadier af sygdommen, men signifikant mellem resekterbare patienter og kontroller, hvilket tyder på, at de differentielt methylerede CpG underskrifter kan være nyttige for tidlig diagnose.

Det er værd at understrege at mindst fire (

LCN2

,

IL10

,

PECAM1

MMP14

) af de ti mest markant methylerede gener i denne undersøgelse har tidligere blevet rapporteret at have diagnostisk og /eller prognostisk værdi for PaC. For eksempel har undersøgelser vist, at serum

IL-10

niveauer er signifikant forhøjet i PAC patienter [24], [25]. Patienter, som havde højere niveauer af

IL-10

viste signifikant dårligere overlevelse sammenlignet med patienter, der viste lavere

IL-10

niveauer. Det forhøjede niveau af

IL-10

i serum af AKP patienter er i overensstemmelse med vores nuværende konstateringen af, at leukocyt DNA havde lavere promoter CpG methylering af genet i PAC patienter end i kontrollerne (p = 2,50 × 10

-9 til fase i og p 1 × 10

-10 til fase II). Interessant, et andet gen,

LCN2

, foreslås som en tidlig diagnose biomarkør for PaC [26] – [28]. Et udtryk-baserede undersøgelse viste, at niveauet af fem proteiner, herunder

LCN2

, diskriminerede mellem PAC patienter og matchede kontroller op til 13 måneder før kræftdiagnose [26]. I denne undersøgelse ved hjælp leukocyt DNA, fandt vi, at to CpG sites (LCN2_P86_R og LCN_P141_R) i

LCN2

promoter region viste signifikant lavere methylering niveauer i Pac patienter end hos kontroller (p = 2,00 × 10

– 10 og 1.16 × ti

-7 i fase i, s en x 10

-10, og 15,5 Kb). Disse resultater viser at CpG methylering niveauer på nogle ikke-prægende loci også er stærkt reguleret af nærliggende genetiske varianter. status methylering i perifert blod DNA kan også tjene som biomarkører til vurdering af AKP risiko.

Mens resultaterne af denne undersøgelse er lovende, er mere arbejde for at fastslå årsagerne til disse methylering forskelle og om forskellen methylering kunne yderligere valideret som en screening eller diagnostisk redskab i en umarkeret befolkning. På dette tidspunkt er ukendt, hvad der forårsager de methylering forskelle mellem disse patienter og kontroller. Ud over mulige genetiske virkning som beskrevet ovenfor, immunrespons af lymfocytter for cancerceller er en anden plausibel forklaring. Det er også uvist, om comorbide betingelser kan påvirke følsomheden af ​​denne test, og om forstadier til kræft eller godartede sygdomme, såsom pancreatitis, vil udvise lignende methyleringsmønstre på disse CpG sites. Alligevel kan disse resultater har fremtidig klinisk signifikans. Først de meget reproducerbare resultater i undersøgelsen tyder på, at der findes methylering forskelle mellem AKP sager og kontroller, som giver støtte i begrundelsen for at designe methylering-baserede assay til tidlig kræft opdagelse og endda risikovurdering. For det andet, at udnytte lettilgængelige leukocyt DNA, snarere end pancreas vævs- eller juice-baserede substrat, er modtagelig for store epigenetiske epidemiologi applikationer såsom epigenome-sammenslutning undersøgelse. For det tredje, undersøgelsen identificeret en væsentlig rolle genetik på DNA methylering på nogle sygdomsrelaterede CpG sites. Det er afgørende at skelne mellem genetiske og ikke-genetiske virkninger på DNA-methylering. Mens ændringer i methylering som følge af en sygdom kan være en nyttig markør for tidlig diagnose, kan methylering variation skyldes genetiske påvirkninger være en potentiel markør for risikovurdering på tværs af individer i større populationer. Derfor vil karakterisering af en genetisk rolle på DNA methylering lette biomarkør opdagelse og yderligere stratificere kliniske anvendelser for disse molekylære signaturer.

Sammenfattende har vi bekræftet reproducerbar methylering forskelle mellem AKP patienter og kontrolpersoner, og har identificeret et sæt af differentielt methylerede bindingssteder for CpG, som synes at være meget tegn på tilstedeværelsen af ​​AKP.