PLoS ONE: Rolle for DNA Methylering i forordningen af ​​miR-200C og miR-141 Expression i Normal og Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

microRNA-200 familien deltager i vedligeholdelse af en epitelial fænotype og tab af dets udtryk kan resultere i epitelial til mesenkymale overgang (EMT). Endvidere er tabet af ekspression af MIR-200 familiemedlemmer knyttet til en aggressiv cancer fænotype. Regulering af miR-200 familien udtryk i normale og cancerceller er ikke fuldt forstået.

Metode /vigtigste resultater

Epigenetisk mekanismer deltager i kontrollen af ​​miR-200C og miR-141 udtryk i både normale og cancerceller. En CpG ø nær den forudsagte mir-200C /mir-141 transkriptionsstartstedet viser en slående sammenhæng mellem MIR-200C og MIR-141-ekspression og DNA-methylering i både normale celler og cancerceller, som bestemt ved MassARRAY teknologi. CpG øen er methyleret i human MIR-200 /MIR-141 udtrykkende epithelceller og i MIR-200C /MIR-141-positive tumorceller. CpG øen er stærkt methyleret i human MIR-200C /MIR-141 negative fibroblaster og MIR-200C /MIR-141 negative tumorceller. Museceller viser en lignende omvendt korrelation mellem DNA-methylering og MIR-200C-ekspression. Berigelse af tolerante histon modifikationer, H3 acetyleringsniveauer og H3K4 trimethylation, ses i normal miR-200C /miR-141-positive epitelceller, som bestemt af kromatin immunofældning koblet til real-time PCR. I modsætning hertil repressive H3K9 dimethylering mærker er til stede i normalt miR-200C /miR-141-negative fibroblaster og miR-200C /miR-141 negative kræftceller og tolerante histon modifikationer er fraværende. Den epigenetiske modifikator lægemiddel, 5-aza-2′-deoxycytidin, reaktiverer MIR-200C /MIR-141-ekspression viser, at epigenetiske mekanismer spiller en funktionel rolle i deres transkriptionel kontrol.

Konklusioner /Signifikans

Vi rapporterer, at DNA-methylering spiller en rolle i den normale celletype-specifik ekspression af mIR-200C og mIR-141 og denne rolle synes evolutionært konserveret, idet lignende resultater blev opnået i mus. Afvigende DNA methylering af miR-200C /141 CpG ø er tæt knyttet til deres upassende lyddæmpning i kræftceller. Da MIR-200C klynge spiller en væsentlig rolle i EMT, tyder vore resultater en vigtig rolle for methylering af DNA i kontrol af fænotypiske konverteringer i normale celler

Henvisning:. Vrba L, Jensen TJ, Garbe JC, Heimark RL, karse AE, Dickinson S, et al. (2010) Rolle for DNA Methylering i forordningen af ​​miR-200C og miR-141 Expression i Normal og kræftceller. PLoS ONE 5 (1): e8697. doi: 10,1371 /journal.pone.0008697

Redaktør: Catherine M. Suter, Victor Chang Cardiac Research Institute, Australien

Modtaget: 13. oktober 2009; Accepteret: December 21, 2009; Udgivet: 13 Jan 2010

Copyright: © 2010 Vrba et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Tilskud R01CA65662 til BWF støttet dette arbejde. Center Tilskud P30ES06694 og P30CA023074, og BIO5 tværfaglige bioteknologiske center på UA støttede Genomics Shared Service. J.C.G. og M.R.S. blev støttet af NIH U54 CA112970, DOD BCRP BC060444, og Office of Energy Research, Kontoret for Sundhed og biologisk forskning, US Department of Energy under kontrakt nr DE-AC03-76SF00098. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

miRNA er enkeltstrengede, 20-24 nt lange RNA, der regulerer genekspression på posttranskriptionel niveau. miRNA ofte målrette 3’UTR’er af mRNA, og da miRNA target-motiver ikke kræver fuldstændig homologi kan hundredvis af mRNA-mål findes for hver miRNA. Aktuelle skøn er, at der er næsten 900 unikke miRNA kodet i det humane genom, og disse miRNA kontrol til dels udtryk for mere end en tredjedel af menneskelige gener [1]. En række miRNA dysreguleret i human cancer er blevet vist at have onkogen eller tumor-undertrykkende aktivitet [2], [3], [4]. Disse omfatter miRNA Arter med celletype specifikke ekspressionsmønstre, hvoraf nogle er vigtige i opretholdelsen af ​​cellens identitet [5], [6]. Disse typer af miRNA er primære mål for epigenetisk kontrol, og tidlige undersøgelser af miRNA kontrol støtte denne mulighed [7], [8].

MIR-200c og ​​miR-141 er medlemmer af miR-200 familie og er vigtige regulatorer af epitel til mesenkymale overgang (EMT) [5], [9], [10], [11]. Ud over den rolle MIR-200C og MIR-141 i den fænotypiske omdannelse af normale celler, dysregulering af normale mønstre af MIR-200C ekspression forekommer i multiple typer af cancerceller og er knyttet til tumorprogression [2], [6] [12], [13], [14], [15]. Den mekanisme ansvarlig for kontrollen af ​​MIR-200C-ekspression i både normale celler og cancerceller er ikke fuldt forstået. I denne undersøgelse, viser vi, at den epigenetiske tilstand er tæt forbundet med normal celletype specifik ekspression af miR-200C og miR-141, og det epigenetiske tilstand er dysreguleret i carcinomceller, hvor tab af miR200c /141 udtryk er knyttet til afvigende DNA methylering og histon modifikationer. Endelig fandt vi, at miR-200C regulering af DNA methylering evolutionært er bevaret mellem mennesker og mus. Siden miR-200C spiller en væsentlig rolle i EMT, vores resultater tyder på, at DNA-methylering spiller en vigtig rolle i kontrollen af ​​fænotypiske omdannelser af normale og kræftceller.

Resultater og Diskussion

MIR -200 familie består af fem miRNA, der er kodet inden for to klynger. Hver klynge koder for et polycistronisk gen. En klynge er placeret på det humane kromosom 1 og koder MIR-200b, MIR-200a, og MIR-429, mens den anden klynge er placeret på humant kromosom 12, og koder for MIR-200C og MIR-141. Vores lille RNA bibliotek sekventering data (figur 1A) viser, at miR-200 familien er stærkt udtrykt i dyrkede normale humane mammae epitelceller (HMEC) stammer fra tre forskellige individer, mens de isogene humane mammae fibroblastceller (FB) mangler miR-200 familie ekspression (figur 1A). Det fremgår af de små RNA bibliotek sekventering data (figur 1A), at de mest højt udtrykte medlemmer af miR-200 familie i HMEC er miR-200c og ​​miR-141. Vi bekræftede ekspressionen af ​​MIR-200C og MIR-141 i det samme sæt af normale brystkirtler prøver ved real-time PCR, og derefter ekspanderes disse resultater til par af epitelceller og fibroblaster fra prostata og hud, samt (figur 1B; Fig S1). I alle tilfælde, MIR-200C og MIR-141 blev højt udtrykt i epitelceller, men blev ikke udtrykt i fibroblaster.

A. MIR-200 familien ekspression ifølge massiv parallel sekventering af små RNA-biblioteker fra et sæt af tre isogene par af humane mammae epitelceller (HMEC) og fibroblaster (FB). Ekspressionen af ​​mir-200b-200a-429 klynge placeret på humant kromosom 1, og ekspressionen af ​​mir-200C-141 klynge placeret på humant kromosom 12 er vist. Med gennemsnittet af 63,829 tællinger ud af 3.926.984 pr bibliotek i HMEC, miR-200C danner 1,625% af alle små RNA i disse celler. B. Real-time PCR vurdering af MIR-200C-ekspression i normale celletyper. Den venstre panel viser ekspressionen af ​​MIR-200C i de samme prøver som panel A. Højre panel viser ekspressionen af ​​MIR-200C i human prostata epitelceller (PREC), prostata stromale fibroblaster (PSF), human hud keratinocytter (Kcytes) og hudfibroblaster (HFF). Dataene er normaliseret i forhold til leje-7a, som udtrykkes ved ækvivalente niveauer mellem forskellige prøver efter de små RNA sekventeringsdata. Real time PCR-analyse af miR-141-ekspression i disse prøver er tilvejebragt i figur S1.

mir-200C hårnål kodende sekvens og ca. 300 bp af opstrøms genomiske sekvens er CpG rige. Ifølge vores beregninger ved hjælp af programmet CpG Cluster [16] Denne region er en statistisk højsignifikant CpG klynge (figur 2A). Dette CpG klynge (længde 334 bp, GC% 68,56, O /E ratio 0,58, 21CpGs, p-værdi 8,44 × 10

-11) har de egenskaber, tæt på en CpG ø definition baseret på størrelse, GC-indhold og CpG dinukleotid frekvens [17], samt dets placering i forhold til den transkriptionelle enhed [18]. Desuden er denne region anses et CpG island baseret på en nyligt offentliggjort probabilistisk definition [19]. Vi analyserede denne region som et muligt mål for epigenetisk kontrol.

A. Et diagram af den genomiske region af HSA-mir-200c. Den øverste linje viser de specifikke fragmenter analyseret af MassARRAY. De røde fragmenter navngivet med CpG sites angiver de fragmenter, hvorfra DNA methylering data opnået. Disse data er præsenteret panel B. Under dette er den region analyseret ved MassARRAY i forhold til den genomiske placering (i blåt), efterfulgt af regionen real-time PCR-amplikon for chromatin immunoprecipitation analyse (chip), og CpG øen identificeret af programmet CpGcluster. De regioner, der koder for mir-200C og mir-141 hårnåle og den formodede transkriptionsstart (TSS) region udledt fra den humane EST styr på UCSC genom browser vises, og hver cirkel på dette spor repræsenterer positionen af ​​et CpG-dinukleotid. Herskeren forneden viser placeringen på human kromosom 12 i henhold til menneskelige genom samling hg18. B. Sammendrag af 5-methylcytosin-niveauer opnået ved MassARRAY analyse af HSA-mir-200C CpG ø i prøver karakteriseret i figur 1B. Y-aksen viser procent af cytosin-methylering inden for de enkelte CpG enheder markeret på x-aksen. De CpG enheder i MassARRAY amplicon er nummereret i den modsatte retning, med CpG 2 bliver placeret i miR-200c sekvens.

epigenetiske tilstand af miR-200C /141 CpG ø viser klart og omfattende celle typespecifikke forskelle mellem normale miR-200C /141-positive og miR-200C /141-negative celler. Vi bruges MassARRAY teknologi til at analysere DNA methylering tilstand mir-200C klynge CpG øen (figur 2B). Resultater viser, at bindingssteder for CpG er umethyleret i tre separate stammer af MIR-200C /MIR-141-positive HMEC. I modsætning hertil er alle de CpG sites stærkt methyleret i isogene MIR-200C /MIR-141-negative fibroblast-stammer. Den inverse korrelation mellem miRNA ekspression og DNA-methylering strækker sig til andre MIR-200C /MIR-141-positive /negative par af normale celler, såsom prostata epitelceller og hud keratinocytter og deres mesenchymale celletypespecifikke modstykker, prostata og hudfibroblaster. Således MIR-200C klynge CpG øen er methyleret i normal MIR-200C /MIR-141-positive epitelceller, og samtidig være tæt methyleret i de parrede normale MIR-200C /MIR-141-negative fibroblaster (figur 1B, 2B, Figur S2).

mIR-200c og ​​miR-141-ekspression er tabt i forskellige typer af kræftceller [5], [11], [20], [21], og vi søgte at afgøre, om dette tab af ekspression var knyttet til epigenetiske ændringer i mIR-200C /mIR-141 CpG ø. Vi analyserede 11 brystcancercellelinier, og i hvert tilfælde blev MIR-200C og MIR-141-ekspression tæt forbundet med DNA methylering tilstand af CpG øen (figur 3A, figur S3). Syv af brystkræft cellelinier testet express miR-200c og ​​miR-141, og hver har en methyleret mir-200c CpG ø. De andre fire bryst kræft testede cellelinjer udtrykker ikke miR-200c og ​​miR-141 og udviser et tæt methyleret mir-200c CpG ø. Et lignende billede tegner med hensyn til prostata kræftceller. Vi viser to prostatakræft-cellelinier (PC3 og PC3 B1), hvor tabet af MIR-200C og MIR-141-ekspression er forbundet med afvigende DNA-methylering af mir-200C /141 CpG øen (figur 3B, Fig S3), og to prostata cancer cellelinjer (LNCaP og DU145), der bevarer miR-200C /miR-141 udtryk og en methyleret mir-200C /141 CpG øen. Tilsammen indikerer disse resultater, at cancerceller afledt fra normal MIR-200C /MIR-141-positive epitelceller kan replikere celletypen-specifikke DNA-methylering mønster af MIR-200C /141 CpG ø set i normal MIR-200C /MIR-141 -negative celler, og at den afvigende DNA-methylering af miR200c /141 CpG ø i disse cancerceller er forbundet med dets transskriptionelle silencing i carcinomceller.

A. MIR-200C-ekspression og mir-200C CpG ø metylering i elleve brystcancercellelinier. B. MIR-200C-ekspression og mir-200C CpG ø metylering i fire prostata cancercellelinier. Toppanel hver figur viser ekspressionen af ​​MIR-200C i prøver cancerpatienter som detekteret ved real-time PCR, normaliseret til leje-7a. Det nederste panel viser methylering af den mir-200C CpG island region i de samme cancer prøver. Niveauet af methylering af individuelle CpG enheder i MassARRAY amplikon vises som en Heatmap med den laveste methylering i gult og den højeste methylering i blåt. Y-aksen markerer de enkelte CpG enheder.

For at demonstrere den funktionelle betydning af epigenetisk tilstand miR-200C /mir-141 CpG ø i kræftceller, vi udsættes kræftceller til epigenetiske modifier og DNA methyltransferase inhibitor 5-aza-2′-deoxycytidin (5-ADC). MIR-200C /MIR-141-negative brystkræft cellelinier MDA-MB-231 og BT549 og prostatacancer-cellelinie PC3 blev behandlet med 3 uM 5-ADC for 96 timer og MIR-200C /141-ekspression blev vurderet ved real- time PCR. Figur 4 viser 5 ADC genaktiveret MIR-200C-ekspression i alle tre cancercellelinier. Niveauet af MIR-200C steg 4,3 gange i MDA-MB-231 (p-værdi = 0,0004), 6,4-fold i BT549 (p-værdi = 0,0107) og 4,2 gange i PC3-celler (p-værdi = 0,0072) . En lignende reaktivering af MIR-141-ekspression (p-værdi 0,01) blev også observeret i disse cancercellelinier efter 5 ADC behandling (fig S4). Disse data antyder, at epigenetiske mekanismer deltage i uhensigtsmæssig undertrykkelse af MIR-200C /MIR-141-ekspression i cancerceller. Salg

Celler blev behandlet med 3 pM 5-aza-2′-deoxycytidin i 96 timer. Niveauet af ekspression af MIR-200C blev målt ved real-time PCR. Gennemsnittet af 4 uafhængige prøver vises, fejlsøjlerne viser standard målefejl. Værdierne blev normaliseret med ubehandlede kontroller (100%). Figur S4 viser den 5-aza-2′-deoxycytidin-medieret reaktivering af miR-141 i de samme prøver.

histon modifikation tilstand mir-200C klynge CpG ø viser også celle type- specifikke forskelle der er tæt knyttet til udtrykket staten miR-200C /141 i normale og cancerceller. Figur 5 viser resultaterne af chromatin immunopræcipitationer koblet til kvantitativ real-time PCR-analyse, der blev brugt til at undersøge histon modifikation tilstand MIR-200C /141 CpG ø i normale celler og cancerceller. Den CpG ø mir-200C /141 i de tre forskellige stammer af miR-200C /miR-141-positive HMEC eksisterer i en transkriptionelt kompetente stat; den er beriget for de transkriptionelt permissive modifikationer af histon H3 acetylering (H3Ac) og lysin 4 trimethylation (H3TriMeK4), medens transkriptionelt undertrykkende histon mærke histon H3 lysin 9 dimethylering (H3DiMeK9) er underrepræsenteret (figur 5). I modsætning hertil i isogene MIR-200C /MIR-141-negative brystkirtler fibroblaster tolerante histon modifikationer er fraværende, og den repressive H3 lysin 9 dimethylering mærke er anbragt (figur 5). Tilsvarende brystkræft cellelinjer, der havde mistet miR-200C /141 udtryk mistet histon H3 acetylering og K4 trimethylation og erhvervet en undertrykkende histon tilstand, beriget for H3 lysin 9 dimethylering mærke (figur 5). Nr berigelse af trimethylation af histon H3 lysin 27 blev detekteret i MIR-200C /141 CpG ø i de analyserede prøver (Figur S5). Tilsammen resultaterne fra analyserne af miR-200C /141 udtryk, DNA methylering og histon modifikation stater på tværs af en bred vifte af normale og cancer celletyper demonstrerer en tæt forbindelse mellem ekspression af mir-200C /141 og den epigenetiske tilstand deres associerede CpG ø.

Eftergivende histon mærker repræsenteret ved acetylering af histon H3 (H3Ac) og trimethylation af lysin 4 af histon H3 (H3TriMeK4) samt den undertrykkende histon mark dimethylering af lysin 9 af histon H3 (H3diMeK9 ) blev analyseret under anvendelse chromatin immunoprecipitation koblet til real-time PCR af regionen beskrevet i figur 2A. HMEC prøver er vist med grønt, er isogene FB prøver vist med rødt, og to MIR-200-negative brystkræft cellelinier er i blåt. Y-aksen viser fold berigelse af hver histon varemærke løbet indført DNA i mir-200c CpG øen.

Endelig søgte vi at bestemme, om den epigenetiske regulering af MIR-200C-ekspression i normale celler er bevaret evolutionært, ræsonnement, at DNA methylering-linked styring af miR-200C udtryk tværs pattedyrarter ville give yderligere eksperimentel støtte til epigenetisk styring af celletypespecifik udtryk for miR-200c. Hele genomiske klynge indeholdende mir-200C og mir-141 er godt konserveret mellem det humane og muse genom. Svarende til humane mir-200C /141 genomiske region, muse mir-200C /141 genomisk region indeholder også et CpG island (figur 6A; længde 325 bp, GC% 66,77, O /E ratio 0,58, 19 CpG’er, p-værdi 1,06 × 10

-10). For at evaluere en potentiel rolle for methylering af DNA i kontrollen af ​​MIR-200C /141 i mus, CpG-methylering og miRNA ekspression blev analyseret i mus epithelceller (epidermis af SKH-1 mus og keratinocyt cellelinier 308 og 6R90) og musefibroblaster ( cellelinier NIH 3T3, NIH 3T6, og NR6). En MassARRAY amplikon blev designet til at analysere DNA methyleringsstadiet af muse mir-200C /141 region homolog med analyseret i humane (figur 6A). Slående ens resultater for MIR-200C blev fundet mellem de humane celler og museceller. Musekeratinocytter udtrykte signifikante niveauer af miR-200c, mens musefibroblaster ikke udtrykte påviselige niveauer af miR-200C (figur 6B). DNA-methylering analyse ved MassARRAY afslørede, at MIR-200C-positive keratinocytter udviste minimal DNA-methylering i mir-200C CpG island, mens MIR-200C-negative musefibroblaster viste omfattende DNA-methylering af alle bindingssteder for CpG i regionen (figur 6B) . Den betydelige bevaring i DNA-sekvens, mønstre af celletype-specifikke DNA-methylering, og de tilhørende miR-200C ekspressionsmønstre mellem humane og murine genomer, som er adskilt af 75 millioner års evolution [22], dokumenterer, at epigenetiske mekanismer spiller en funktionel rolle i kontrollen af ​​mIR-200C-ekspression.

a. Diagram af musen MMU-mir-200c genomisk interval. Den øverste bjælke viser det område analyseret af MassARRAY. De regioner, der koder for hårnåle af mir-200C og mir-141 og den formodede transkriptionsstart (TSS) udledes af muse EST spor vises på UCSC genom browser er vist, og hver cirkel på dette spor repræsenterer placeringen af ​​et CpG-dinukleotid. Svarende til den humane HSA-mir-200C, muse MMU-mir-200C indeholder et CpG ø, der er konstateret af programmet CpG Cluster. Herskeren forneden viser placeringen på musen kromosom 6 ifølge genome samling MM9. Generne er kodet på (-) streng. B. Museceller viser en lignende celletype specifikt mønster i MIR-200c ekspression til humane celler, og dette udtryk er koblet til DNA-methylering tilstand af CpG øen. Det venstre panel viser ekspressionen af ​​MIR-200C i muse epithelceller (308, 6R90, SKH-1 epidermis) og muse fibroblast cellelinjer (NIH 3T3, NR6, NIH 3T6) som påvist ved real-time PCR. Højre panel viser det methylering af den mir-200C CpG island region i de samme mus prøver. Niveauet af methylering af individuelle CpG enheder i MassARRAY amplikon vises som en Heatmap med den laveste methylering i gult og den højeste methylering i blåt. X-aksen markerer de enkelte CpG enheder. CpG enheder inden MassARRAY amplicon er nummereret i omvendt retning, med CpG 1 er anbragt inden for MIR-200C-kodende sekvens.

Sammenfattende vores resultater giver en række af beviser, at epigenetiske mekanismer er involveret i regulering af miR-200C /141 udtryk i både normale og cancerceller. Først er der en konsistent omvendt korrelation mellem ekspression og DNA methylering i normale humane og muse celletyper, samt humane bryst- og prostata-cancercellelinier. For det andet findes der forskellige histon-koder mellem miR-200C /141 udtrykke og celler ikke-udtrykte, som præcist afspejler udtrykket og DNA methylering. For det tredje, den epigenetiske modifier 5-aza-2′-deoxycytidin lindrer undertrykkelsen af ​​miR-200C /miR-141 i kræftceller. For det fjerde, at forbindelsen mellem DNA-methylering og udtryk stater sker på tværs pattedyrarter, da det er set i mennesker og mus. Tilsammen disse resultater viser, at miR-200C /141 er en evolutionært bevaret epigenetisk labil miRNA klynge.

dysregulering af miR-200C og miR-141 forekommer i flere kræfttyper [5], [11], [ ,,,0],20], [21], [23], [24], [25], [26], og denne dysregulering indebærer et kompromis i den epigenetiske tilstand af CpG ø forbundet med miR-200c og ​​miR141. Resultaterne tyder på, at disse carcinomaceller kan co-opt

de novo

DNA methylering involverede veje i epigenetiske kontrol af normale celle typespecifikke gener, såsom dem, der regulerer epigenetiske tilstand af miR-200C /miR-141 . En lignende tilsyneladende selvsupplering af celletypespecifikke DNA methylering veje ved cancerceller ses også i protein-kodende gener, såsom

maspin

og

14-3-3 sigma

[27] , [28]. Tilsammen tyder disse resultater på, at veje er ansvarlige for etablering eller vedligeholdelse af normale celletype-specifikke DNA-methylering kan blive forstyrret under carcinogenese.

Siden miR-200c og ​​miR141 spiller en vigtig rolle i EMT og dermed celle identitet, afbrydelse af mekanismer, der styrer celle typen DNA methylering mønstre under carcinogenese kunne sandsynligvis påvirke ekspressionen af ​​miR-200C og miR141 og give fænotypisk plasticitet til kræftceller. Til støtte for denne mulighed kommer fra fænotyper af cancercellerne analyseret i denne undersøgelse. Alle fire af brystkræft cellelinjer, der mistede miR-200c og ​​miR-141 udtryk har en afvigende methylerede mir-200C /141 CpG øen, og hver af disse cellelinjer viser en mesenkymale fænotype [11], [29]. Derimod disse brystcancercellelinier, der udtrykker MIR-200C og MIR-141 og har et ikke-methyleret CpG ø vise en epitelial fænotype [11], [29]. Et lignende billede tegner i prostata cancer cellelinjer. De PC3 celler, der har mistet miR-200c og ​​miR-141 udtryk, vise en afvigende methylerede CpG ø og et mesenkymale fænotype, mens LNCaP og DU145 beholde miR-200c og ​​miR-141 udtryk og en epitelial fænotype [11], [30] . Disse resultater tyder på, at DNA-methylering kan styre fænotypiske ændringer observeret i kræftceller.

Materialer og metoder

cellelinjer og cellekultur

Finite levetid pre-stasis HMEC fra prøver 184 (batch D), 48R (batch T), og 240L (batch B), blev afledt af reduktion mammoplasty væv af kvinder i alderen 21, 16 og 19 hhv. Cellerne blev indledt som organoids i primær kultur i serum-holdigt M85 medium suppleret med oxytocin (Bachem) ved 0,1 nM, og vedligeholdes i M87A medium suppleret med oxytocin og kolera toksin på 0,5 ng /ml [31]. Fibroblaster fra prøver 184, 48 og 240 L blev opnået fra den samme reduktion mammoplasty væv og blev dyrket i DMEM /F12 med 10% FBS og 10 ug /ml insulin [31] og yderligere opformeres i DMEM /F12 med 10% FBS. Prostata epitelceller blev opnået fra Clonetics (San Diego, CA), og føtale hudkeratinocyter fra celle Applications (San Diego, CA.) og blev dyrket i overensstemmelse med leverandørens instruktioner. Humane forhudsfibroblaster (HFFS) blev opretholdt og dyrket af Arizona Cancer Center Cell Culture Shared Service. Humane prostata stromale fibroblaster (PSF) var blev dyrket som tidligere beskrevet [32]. Brystkræft cellelinier BT549, Hs578T, MCF7, MDA-MB-157, MDA-MB-231, MDA-MB-453, MDA-MB-468, UACC893, UACC1179, UACC2087, og UACC3199 blev dyrket som tidligere beskrevet [33] , [34]. Prostatacancer cellelinjer PC3, PC3 B1, LNCaP, og DU145 [35], [36], [37] blev opretholdt i RPMI 1640 medium indeholdende 10% føtalt bovint serum suppleret med 100 enheder /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin. Muse keratinocyt cellelinier 308 og 6R90 blev dyrket som beskrevet [38], mus fibroblastcellelinier NIH 3T3, NIH 3T6 og NR6 [39], [40], [41] blev holdt i DMEM-medium indeholdende 10% føtalt bovint serum. SKH-1 museepidermis prøver blev fjernet fra flydende nitrogen snap frosne dorsale hud ved at skrabe på tøris.

miRNA bibliotek forberedelse, sekventering og analyse

Samlet RNA blev ekstraheret ved hjælp af Trizol. Den lille RNA fraktion blev oprenset på en 15% polyacrylamid-urea-gel. En preadenylated adaptor blev ligeret til 3′-enden af ​​den lille RNA efterfulgt af oprensning af ligeringsproduktet på en 15% PAA-urea gel. En Illumina specifik 5′-adapter blev ligeret, og produktet blev oprenset på en 10% PAA-urea gel. Lille RNA med ligerede adaptorer blev revers transkriberet til DNA ved anvendelse af en RT-primer med Illumina specifik forlængelse. cDNA blev derefter PCR-amplificeret under anvendelse Illumina specifikke primere og PCR-produktet blev oprenset på en 3% agarosegel. Små RNA biblioteker blev indsendt for Illumina sekventering til NCGR (Santa Fe, NM). Læser fra Illumina GAII blev kortlagt til hg18 humane genom samling ved hjælp af programmet Novoalign (www.novocraft.com). Output fra Novoalign blev yderligere analyseret i R (https://www.r-project.org). Tællingerne enkelte miRNA blev normaliseret til gennemsnitlig biblioteksstørrelse (3,926,984 tællinger).

nukleinsyreisolering

RNA blev isoleret under anvendelse af enten Trizol (Invitrogen) eller RNeasy Mini kit (Qiagen) og kvantificeret ved absorption målinger ved 260 nm. Genomisk DNA blev isoleret ved anvendelse af DNeasy blod og væv Kit (Qiagen) og kvantificeret spektrofotometrisk.

Real-time PCR detektion af miRNA

Real-time PCR påvisning af microRNA udførtes i princippet som beskrevet [42]. Revers transkription blev udført under anvendelse TaqMan revers transkription Reagenser (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Real-time PCR blev udført på en ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) under anvendelse Perfecta SYBR Green SuperMix, Low ROX (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, USA) med en 95 ° C denaturering i 3 minutter efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 45 sekunder. Forskelle i ekspressionen blev bestemt under anvendelse af komparativ Ct fremgangsmåden beskrevet i ABI brugermanualen forhold til lade-7a. Primer sekvenser er anført i tabel S1.

CpG ø forudsigelse

CpG øer blev forudsagt ved hjælp af programmet CpGcluster [16]. Dette program bruger en statistisk metode til at søge efter regioner med betydelig berigelse af CpG-dinukleotider snarere end parametre inden for et glidende vindue. Vi sætter tærsklen til 50 (median afstand) og p-værdi skåret til 10

-8.

DNA methylering analyse af MassARRAY

DNA methylering analyse af MassARRAY blev udført som beskrevet [ ,,,0],43]. Primersekvenser er opført i tabel S1.

5-aza-2′-deoxycytidin behandling

Celler blev behandlet med 3 pM 5-aza-2′-deoxycytidin (Sigma, St. Louis, MO , USA) i 96 timer, som tidligere beskrevet [44].

chromatin immunoprecipitation

chromatin immoprecipitation (chip) analyse blev udført som tidligere beskrevet [33], [45], [46] med antistoffer mod acetyleret histon H3 (# 06-599, Millipore), trimethyleret histon H3 K4 (# 05-745, Upstate), dimethyleret histon H3 K9 (CS200587, Millipore), og trimethyleret histon H3 K27 (# 07-449, Millipore ). Lige store mængder (1 ng) af chip og indført DNA blev anvendt til realtids-PCR-analyse. Primere blev designet til brug med Human Universal probebibliotek Set (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA). Real-time PCR blev udført på en ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) under anvendelse Perfecta qPCR SuperMix, Low ROX (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, USA) med en 95 ° C denaturering i 3 minut efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 45 sekunder. Primer sekvenser er anført i tabel S1.

Støtte Information

figur S1.

Real-time PCR vurdering af MIR-141-ekspression i normale celletyper. Den venstre panel viser ekspressionen af ​​MIR-141 i tre isogene par mammaepitelceller (HMEC) og brystkirtler fibroblaster (FB). Højre panel viser ekspressionen af ​​MIR-141 i human prostata epitelceller (PREC), prostata stromale fibroblaster (PSF), human hud keratinocytter (Kcytes) og hudfibroblaster (HFF). Dataene er normaliseret i forhold til at lade-7a, som udtrykkes på ensartede niveauer mellem forskellige prøver i henhold til de små RNA sekventering data

doi:. 10.1371 /journal.pone.0008697.s001

(0,13 MB TIF)

Figur S2.

DNA methylering af mir-200C CpG island omvendt korrelerer med MIR-200C-ekspression i normale humane prøver. Dette tal opsummerer data vist i figur 1B og 2B. Den øvre panel viser ekspressionen af ​​MIR-200C detekteret ved real-time PCR. Det nederste panel viser methylering niveau af mir-200C CpG island region i de samme humane prøver. Niveauet af methylering af individuelle CpG enheder i MassARRAY amplikon vises som en Heatmap med den laveste methylering i gult og den højeste methylering i blåt. Y-aksen markerer de enkelte CpG enhederne

doi:. 10,1371 /journal.pone.0008697.s002

(0,19 MB TIF)

Figur S3.

Real-time PCR vurdering af MIR-141-ekspression i bryst- og prostatacancer-cellelinier. Det venstre panel viser ekspressionen af ​​miR-141 i elleve menneskelige brystcancercellelinier. Højre panel viser ekspression af miR-141 i fire humane prostata cancer cellelinjer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0008697.s003

(0,14 MB TIF)

Figur S4.

miR-141-ekspression i cancer cellelinjer genaktiveres ved 5-aza-2′-deoxycytidin behandling. Celler blev behandlet med 3 uM 5-ADC for 96 timer. Niveauet af ekspression af MIR-141 blev målt ved real-time PCR. Gennemsnittet af 4 målinger vises, fejlsøjlerne viser standard målefejl. Værdierne blev normaliseret til ubehandlede kontroller (100%)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0008697.s004

(0,06 MB TIF)

Figur S5.

histon H3 K27 trimethylation tilstand mir-200c CpG ø.