PLoS ONE: Målretning KRAS Oncogene i Colon Cancer Cells med 7-carboxylat indol [3,2-b] quinolin Tri-Alkylamin Derivatives

Abstrakt

Baggrund

En guanin-rige streng inden promotoren for

KRAS

gen kan folde til en intra-molekylær G-quadruplex struktur (G4), der har en vigtig rolle i reguleringen af ​​

KRAS

transskription. Vi har tidligere identificeret indol [3,2

b

] quinoliner med en 7-carboxylat gruppe og tre alkylamin sidekæder (IQ3A) som effektive G4 stabilisatorer og lovende selektive anticancer kundeemner. Heri undersøgte vi anticancer virkningsmekanisme af disse forbindelser, som vi hypoteserne skyldes stabilisering af G4-sekvensen i

KRAS

promotor og efterfølgende nedregulering af genekspression.

Metode /Principal resultaterne

IQ3A forbindelser viste større stabilisering af G4 forhold til duplex DNA-strukturer og reduceret

KRAS

promotor-aktivitet i en dual luciferase reporter assay. Desuden viste IQ3A forbindelser høje anti-proliferativ aktivitet i HCT116 og SW620-kolon kræftceller (IC

50 2,69 uM), uden at fremkalde celledød i ikke-maligne HEK293T humane embryonale nyre, og menneskelige kolon fibroblaster CCD18co. IQ3A forbindelser væsentligt reduceret

KRAS

mRNA og protein steady state niveauer IC

50 koncentrationer og øget p53 protein steady state niveauer og celledød ved apoptose i HCT116 celler (mut

KRAS

, vægt

p53

). Endvidere KRAS silencing i HCT116 p53 vildtype (p53 (+ /+)) og null (p53 (- /-)) isogene cellelinjer inducerede en højere grad af celledød, og en højere IQ3A-induceret celledød i HCT116 p53 (+ /+) sammenlignet med HCT116 p53 (- /-).

konklusioner

Heri vi dokumentere, at G4-ligander såsom IQ3A forbindelser kan målrette G4 motiver præsentere i

KRAS

promotor, nedregulerer ekspressionen af ​​mutant

KRAS

gen gennem hæmning af transkription og translation, og inducere celledød ved apoptose i kolon cancercellelinier. Således kan målrette KRAS på genomisk niveau med G4-ligander være en ny anticancer terapi strategi for tyktarmskræft

Henvisning:. Brito H, Martins AC, Lavrado J, Mendes E, Francisco AP, Santos SA, et al . (2015) Målretning

KRAS

Oncogene i Colon Cancer Cells med 7-carboxylat indol [3,2

b

] quinolin Tri-alkylaminderivater. PLoS ONE 10 (5): e0126891. doi: 10,1371 /journal.pone.0126891

Akademisk Redaktør: En R M Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, UNITED STATES

Modtaget: Januar 6, 2015; Accepteret: April 8, 2015; Udgivet: May 29, 2015

Copyright: © 2015 Brito et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Forfattere fra IMED-ULisboa anerkender Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), Portugal, om økonomisk støtte gennem projekttilskud EXPL /QEQ-mED /0502 /2012, HMSP-IKT /0018/2011, og Pest-OE /SAU /UI4013 /2014. HB, CMPR og PMB også takke Sociedade Portuguesa de Gastroenterologia og Korea Human Gene Bank (KHGB), Medical Genomics Research Center, KRIBB, Republikken Korea. JL anerkender FCT for Post-ph.d. give SFRH /BPD /72903/2010 og SAS for ph.d.-stipendium SFRH /BD /80162/2011. Den Neidle laboratorium anerkender støtte fra bugspytkirtlen Cancer Research Fund og Medical Research Council. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

KRAS

gen koder for et G-protein, der fungerer som en molekylær omskifter mellem endotelvækstfaktorreceptor og kernen, kontrollere forskellige signalveje vigtige for cellevækst og overlevelse. KRAS GTPase findes i to stater, en GTP-bundne aktiv tilstand og en BNP-bundne inaktiv tilstand. Endvidere

KRAS

mutationer øger KRAS affinitet for GTP fører til konstitutiv aktivering af proteinet. Vigtigere, sletning af mutant

KRAS

allel i colon cancer cellelinjer reducerer dramatisk celleproliferation [1], der fremhæver, at mange tumorer huser mutant

KRAS

er KRAS-afhængige.

KRAS

mutationer er for det meste fremherskende i pancreas (90-60%), kolorektal (30-50%) og lunge (20-30%) carcinomer [2]. På grund af den høje forekomst af disse kræftformer verdensplan [3] og øget resistens over for konventionel kemoterapi [4], søgen efter nye mål er blevet intensiveret i sidste senere år.

Betydningen af ​​terapeutisk modulation af KRAS-signalering har været bredt anerkendt og er blevet rapporteret flere tilgange i fortiden, men ingen har givet en godkendt ny anticancer stof til dato [5]. En innovativ terapeutisk fremgangsmåde blev undersøgt er brugen af ​​miRNA, idet de spiller en vigtig rolle i kemo-sensibilisering [6]. Vi har tidligere vist, at miRNA-143, hvilket også reducerer

KRAS

udtryk, chemosensitizes tyktarmskræft celler til 5-fluorouracil [7], og reducerer tumorvækst

in vivo

, med øget apoptose og reduceret spredning [8].

Fortsat vores undersøgelser, der har til formål at opdage nye og selektiv anticancer narkotika, forfølges gennem udvikling af flere kemiske systemer, der skal bruges i forskellige terapeutiske strategier [9], [10], [11 ], rapporterer vi her om en fremgangsmåde for målrettet KRAS signalering i cancerceller ved direkte at modulere

KRAS

udtryk på genniveau. Det er for nylig blevet påvist, at en guanin-rige streng i promotoren af ​​

KRAS

kan folde til en intra-molekylær G-quadruplex struktur (G4), der har en vigtig rolle i reguleringen af ​​

KRAS

transskription [12], [13]. G4 ordninger er nukleinsyre højere orden strukturer, der dannes ved sekvenser indeholdende repetitive guanin (G) -rige skrifter [14]. Flere undersøgelser har givet dokumentation for eksistensen af ​​G4 i eukaryote telomerer og onkogen initiativtagere, herunder

KRAS

,

HRAS

,

HSP90

,

c-myc

,

c-KIT

,

BCL-2

og

VEGF

gener, og at små molekyler stabiliserende G4 strukturer er i stand til at nedregulere onkogen transkription i tumor cellelinjer, hæmmer telomerase-aktivitet og fremkalde kræft cellevækst anholdelse [15], [16], [17]. G4 strukturer er også fundet i RNA-sekvenser, herunder i 5 ‘utranslaterede område (UTR) af

KRAS

mRNA, og vist sig at have oversættelse regulerende funktioner [18], [19], [20].

Indoloquinolines er naturlige alkaloider i stand til at målrette DNA strukturer, hvoraf nogle har potentiale for udvikling i anticancer narkotika [21], [22]. Indol [3,2-

b

] quinolinderivater er blevet vist at være potente G4 ligander, og til at inhibere celleproliferation og onkogen (

c-MYC

) transkription [21], [23 ], [24]. Desuden har vi for nylig opdaget, at indol [3,2

b

] quinoliner med en 7-carboxylat gruppe og tre alkylamin sidekæder (1a og 2a i figur 1) er lovende selektive anticancer leads [25]. Disse forbindelser hæmmede selektivt (100 gange) væksten af ​​

KRAS

mutant HCT116 kolon kræftceller sammenlignet med primære rottehepatocytter, samtidig med faldende KRAS protein niveauer. For at udnytte dette stillads mod opdagelsen af ​​nye og forbedrede anticancer narkotika, har vi udvidet kemiske diversitet disse indoloquinolines og studerede deres potentielle anticancer virkningsmekanisme. Tidligere struktur-aktivitets studier med mono-alkylamin indol [3,2

b

] quinoliner har vist, at optimal G4 stabilisering er fremkaldt ved forbindelser med propyl sidekæder og grundlæggende aminogrupper (p

Ka

≥ 8) [25]. Således kan forbindelser 1a-d og 2a-d (figur 1) blev udformet, syntetiseret og vurderet for selektiv G4 termisk stabilisering sammenligne med dupleks-DNA, sammen med inhibering af cancercelleproliferation, induktion af apoptose og nedregulering af

KRAS

HSP90

transskription og protein udtryk. For at forbedre den anticancer aktivitet profil og

KRAS

onkogen nedregulering kapacitet af vores mål indoloquinolines, vi har brugt fire cellelinjer med forskellige

KRAS

og

TP53

genotyper , samt to positive kontroller, anticancerlægemidlet 5-fluorouracil (5-FU) og G4 ligand TMPyP4 (figur 1).

7-carboxylat indol [3,2-

b

] quinolin tri-alkylaminderivater (IQ3A) 1a-d og 2a-d; G4 ligand porphyrinderivat TMPyP4 og 5-fluorouracil (5-FU) anticancer narkotika.

Resultater og Diskussion

Forbindelser 1a-d og 2a-d blev syntetiseret i fire trin efter procedure beskrevet tidligere [25] med nogle modifikationer (S1 tekst). Strukturer af 1a-d og 2a-d blev fuldstændigt belyst af todimensionale

1H (COSY og NOESY) og

13C heterocorrelation NMR eksperimenter (HMQC og HMBC) og renhed ( 95%) bekræftet ved HPLC-ELSD- MS (S1 fig).

kapaciteten af ​​forbindelser 1a-d, 2a-d og standard G4 ligand TMPyP4 (figur 1) [16] til at binde og stabilisere

KRAS

[26] og

HSP90A

[27] G4 DNA-strukturer samt duplex-DNA (T-sløjfe) blev bedømt ved en Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) smeltning assay. Stigningen i smeltetemperaturerne induceret af forskellige koncentrationer af forbindelser er vist i tabel 1 og S2 Fig. Vores resultater viser, at tri-alkylamin indol [3,2

b

] quinoliner (IQ3A) er potente og selektive ligander for

KRAS

og

HSP90A

G4 strukturer. Som tidligere observeret for mono- og di-alkylamin analoger [25] og andre polyaromatiske-kondenserede G4 ligander [28], [29], forbindelser med propylamin sidekæder (1d og 2d) er overlegen G4 stabilisatorer (Δ

T

m mellem 18 og 23 ° C ved 2 uM ligand) end forbindelser med kortere alkylamin sidekæder (1a-b og 2a-b; Δ

T

m værdier mellem 7 og 17 ° C ved 2 uM ligandkoncentration). Det blev observeret, at basicitet sidekæder korrelerer positivt med stabilisering termisk G4 af alle DNA-sekvenser op til en optimal pKa ~ 8,0-9,0 (figur 2). Heterocycliske aminer i slutningen af ​​alkyl sidekæde (1b og 2b) synes at forbedre binding til G4 og kompleks stabilisering sammenlignet med di-ethylamin gruppe (1a og 2a), som ikke kan forklares med forskelle i basicitet mellem terminale grupper. Derudover og i overensstemmelse med, hvad der tidligere blev observeret for di-alkylamin indoloquinolines [25], denne undersøgelse tyder på, at N5, N10, COO tri-substitution med heterocykliske aminogrupper ved alkylsidekæde termini stigning ligand affinitet til G4, som 2b, d -G4 DNA komplekser har højere smeltetemperaturer end komplekser af korrespondent isomerer 1b, d. Imidlertid var dette ikke observeret for den isomere par 1a /2a. På trods af den øgede stabilisering G4 kapacitet, ligander 2b og 2d var ikke i stand til væsentligt at skelne mellem de to DNA-G4 strukturer (tabel 1).

A. Beregnet p

K

en værdierne af side kæde aminogrupper ved SPARC (v. 4.6). B. Plots af variation af G4 termisk stabilisering af forbindelser (Δ

T

m) med basicitet (p

K

a) af side kæder grupper.

for at undersøge effekten af ​​IQ3A tinforbindelser på kræft og ikke-kræftceller, valgte vi sammensatte 2d viser den bedste stabilisering G4 kapacitet

in vitro

og parret 1a og 2a, som trods viser lavere Δ

T

m værdier for de respektive komplekser med G4-DNA, er i stand til at reducere

KRAS

udtryk, når inkuberes i HCT116 kolorektal cancer celler, som vi tidligere har vist [25].

Den kortsigtede effekt af forbindelser på 72 timer på cellevækst blev studeret ved hjælp af kolorektal karcinom cellelinjer med forskellige

KRAS

TP53

genotyper: menneskelig colorectal carcinom HCT116 (mut

Kras

, vildtype (wt)

p53

), og human metastatisk colorectal adenocarcinom SW620 (mut

Kras

, mut

p53

). Samtidig brugte vi også udødeliggjort humane embryonale nyre cellelinje HEK293T (vægt

Kras

, vægt

p53

) og normale humane colon fibroblastceller CCD18co (vægt

Kras

, vægt

p53

). IC

50 og IC

65 værdier i tabel 2 viser, at forbindelser 2a og 2d display overlegen antiproliferativ aktivitet sammenlignet med 1a og 5-FU, særligt i metastatiske SW620 celler, hvor 2d gav en IC

50 værdi (0,28 uM), næsten 20 gange lavere end den standard anticancer narkotika 5-FU (IC

50 = 5,39 uM). Interessant kolorektal kræftceller HCT116 og SW620, som udtrykker mutant KRAS, var særligt ufølsom over for porphyrinderivat TMPyP4, i modsætning til ikke-maligne HEK293T celler, der udtrykker vildtype KRAS. Desuden IQ3A forbindelser og 5-FU, var ikke selektive for cancerceller, der udtrykker mutant KRAS, da de var lige så aktive mod HCT116, SW620 og HEK293T celler. Alligevel observerede vi en vis selektivitet (SI 2,4; tabel 2). Mod tyktarmskræft cellelinien HCT116 sammenlignet med normale colon fibroblaster (CCD18co)

Efterfølgende blev Guava ViaCount anvendte assay til at evaluere virkningerne af IQ3A forbindelser på celledød induktion i cancer (HCT116 og SW620) og ikke-maligne (HEK293T og CCD18co) celler, sammenlignet med 5-FU og TMPyP4 ved equitoxic koncentrationer (IC

50 og IC

65) . Nedregulering af mutant

KRAS

udtryk ved antisense-oligonukleotider i kolorektal cancer celler [7], [8], [30] og ved en MAZ-bindende oligonukleotid lokkedue i bugspytkirtelkræftceller [31] har været forbundet med øget apoptose og cellevækst anholdelse. Også anticancer lægemidler, såsom 5-FU og G4 stabilisatorer af telomere og onkogen promotorsekvenser såsom TMPyP4, er kendt for at inducere en generaliseret celle respons fører til celle vækststandsning og celledød ved apoptose (DNA-skade respons) [15], [32], som involverer aktivering af pro-apoptotisk transkriptionsfaktor p53 blandt andre veje i tilfælde af 5-FU [34]. Figur 3 viser, at vores testforbindelser har forskellige virkninger på celler, afhængigt af forbindelsen struktur og formodentlig også på den genetiske baggrund af en individuel cellelinie. I HCT116 celler, alle forbindelser inducerede celledød ved apoptose, men de IQ3A forbindelser viste den mest betydningsfulde apoptotiske effekt, med en tendens til 1a 2a 2d, og forårsager 30-70% celledød ved koncentrationer fra 0,58 til 3,42 uM (IC

65) (fig 3B, øvre venstre panel). Omvendt Alle forbindelser blev i stand til at inducere signifikant celledød i HEK293T og CCD18co celler (Fig 3A og 3B, lavere paneler), mens kun 5-FU i SW620-celler var i stand til at inducere apoptose i en dosisafhængig måde (Fig 3A og 3B , øvre højre paneler). Virkningen af ​​TMPyP4 på SW620 blev ikke undersøgt, da denne cellelinie var ikke følsom over for denne forbindelse op til en 20 uM koncentration. Salg

Cellepopulationer blev opnået ved Guava ViaCount flowcytometri efter 72 h inkubation af HCT116 tyktarmskræft , SW620 metastatisk tyktarmskræft, CCD18co menneskelige kolon fibroblaster og HEK293T embryonale nyre cellelinjer med 5-FU, TMPyP4 og IQ3A på equitoxic (IC

65

50 og IC) koncentrationer, eller DMSO (køretøj kontrol). Resultater udtrykkes som den gennemsnitlige procentvise (%) af levedygtige, mid-apoptotiske og døde celler ± SEM, af mindst tre forskellige eksperimenter, for A. IC

50, og for B. IC

65 forbindelseskoncentrationer. a, p 0,05; b p 0.01 fra DMSO (køretøj kontrol); c, p 0,05; og d, p 0.01 fra 5-FU.

For yderligere at validere effekten af ​​de IQ3A forbindelser på induktion af apoptose i HCT116 celler, blev apoptose konstateret ved at evaluere ændringer i nukleare morfologi af Hoechst farvning, og også af den nexin assay efter 72 timer inkubation med IQ3A forbindelser ved IC

50 koncentrationer. CCD18co celler blev anvendt i parallel til at bekræfte, at IQ3A ikke fremkalder celledød i normale celler. Disse resultater viste, at IQ3A signifikant inducerer apoptose i HCT116-celler, med forbindelse 1a producerer en markant stigning i apoptose sammenlignet med bærer (fig 4A og 4B). Desuden har vi bekræftede også, at IQ3A forbindelser ikke inducere apoptose i normale kolon fibroblaster CCD18co. P53-proteinet spiller en central og afgørende rolle i humane cancere [33], som har en potent tumor undertrykkende aktivitet via pleiotrope mekanismer. Derfor blev steady state niveauer af p53 protein evalueret af immunoblotting efter 72 h inkubation med IQ3A forbindelser på IC

50 koncentrationer, at fastslå deres engagement på den mekanisme af apoptose fremkaldt af IQ3A. Vores data (Fig 5A) viser tydeligt, at IQ3A øget p53 protein steady state niveauer i HCT116 4-7 gange (

s

0,01) (fig 5A, venstre panel), som kan være korreleret med højere celledød verificeret af Guava ViaCount assay. I SW620-celler, blev detekteret nogen væsentlig stigning i p53 steady-state-ekspression, muligvis på grund af mutant status af p53 (fig 5A, midterste panel). Endelig i HEK293T celler, viste IQ3A ingen indflydelse på p53-proteinekspression, i overensstemmelse med fraværet af celledød i levedygtighedsassayet (Fig 5A, højre panel). Derudover har vi nærmere relevansen af ​​p53 i mekanismen for apoptose fremkaldt af IQ3A ved tavshed KRAS i HCT116 p53 vildtype (p53 (+ /+)) og nul (p53 (- /-)) isogene cellelinjer, og vurdere dets indvirkning på celledød, og på IQ3A-induceret celledød (figur 5B). Vores resultater viser klart, at KRAS lyddæmpning inducerede et højere celledød sammenlignet med siRNA kontrol (

s Restaurant 0,05), og en højere grad af IQ3A-induceret celledød i HCT116 p53 (+ /+) sammenlignet til HCT116 p53 (- /-) (

s

0,05 for 2a og 1a). Yderligere, siRNA kontrol transficerede celler, alle IQ3A signifikant inducerede en højere grad af celledød i HCT116 p53 (+ /+) sammenlignet med HCT116 p53 (- /-) (

s Restaurant 0,05). Men i p53 mutant SW620 celler, IQ3A forbindelser ikke signifikant fremkalde celledød (figur 3), og heller ikke de øger p53-protein steady-state-ekspression (figur 5). Efter aftale, KRAS og /eller HSP90 silencing var ude af stand til at inducere celledød i denne cellelinie, hvorimod KRAS lyddæmpning inducerede en dosisafhængig virkning i reduktionen af ​​SW620-celleproliferation (S3 Fig). Kollektivt, disse data bekræfter endvidere betydningen af ​​p53 for IQ3A induktion af apoptose.

A. Cellekernemorfologi og repræsentative billeder af HCT116 human colon cancerceller og CCD18co human colon fibroblaster efter Hoechst-farvning, bedømt ved fluorescensmikroskopi efter 72 h udsættelse for equitoxic (IC

50) koncentrationer af 5-FU, TMPyP4 og IQ3A eller DMSO (køretøj kontrol) ved 400x forstørrelse. Hvide pile angiver nuklear fragmentering og chromatinkondensering, og B. Apoptotiske cellepopulationer fremstillet ved Guava nexin flowcytometri efter 72 h inkubation af HCT116 og CCD18co celler med 5-FU, TMPyP4 og IQ3A på equitoxic (50 IC

) koncentrationer, eller DMSO (køretøj kontrol). Resultater udtrykkes som den gennemsnitlige procentvise (%) af tidlig (LR kvadrant) og sene (UR kvadrant) apoptotiske celler. Resultater udtrykkes som middel ± SEM af mindst tre uafhængige forsøg; * P 0,05 og §p 0.01 fra DMSO (køretøj kontrol); og † p 0,05 og ‡ p 0.01 fra 5-FU.

A. p53-protein steady-state-ekspression vurderet ved immunoblot forhold til DMSO (vehikelkontrol), efter 72 h udsættelse for equitoxic koncentrationer (IC

50) af 5-FU, TMPyP4 og IQ3A. B. Cell befolkninger opnået ved Guava ViaCount flowcytometri følgende 72 timers inkubation af 5-FU, TMPyP4 og IQ3A på equitoxic (IC

50) koncentrationer, eller DMSO (køretøj kontrol), i HCT116 p53 (+ /+) og p53 (- /-) isogene cellelinier transficeret med 40 nM siRNA KRAS eller siRNA kontrol. Resultater udtrykkes som middel ± SEM af mindst tre uafhængige forsøg. A. §p 0.01 fra DMSO (køretøj kontrol); og ‡ p 0.01 fra 5-FU. B. * p 0,05 fra siRNA kontrol i P53 (+ /+) celler; §p 0,05 fra siRNA kontrol i p53 (- /-) celler; og † p 0,05 fra siRNA KRAS i p53 (- /-) celler

Endelig kapaciteten af ​​IQ3A forbindelser undertrykke

KRAS

udtryk blev evalueret ved at kvantificere KRAS protein. i cancercellelinier. Da IQ3As også har vist sig at være effektive stabilisatorer af G4 sekvenser i HSP90 onkogen promotorregionen (tabel 1) blev ekspressionen af ​​dette protein også evalueret. Figur 6A viser, at G4 ligander 1a, 2a, 2d og TMPyP4 ned-reguleret ekspression af mutant KRAS med 35-60% i HCT116 og SW620 celler, med undtagelse af 2a (

s

0,01). Derudover IQ3A reducerede også HSP90 protein stabile niveauer, men i mindre grad i forhold til KRAS. Derfor Derefter undersøgte vi evnen hos IQ3A forbindelser til at nedregulere

KRAS

transskription i colon cancerceller.

KRAS

mRNA steady-state-niveauer blev evalueret med RT-PCR efter 72 timers inkubation af cellerne med forbindelserne ved deres IC

50 koncentrationer og sammenlignet med virkningen af ​​TMPyP4 ved equitoxic koncentrationer. G4 ligander, såsom TMPyP4 er blevet vist at binde til G4 strukturer fra

KRAS

promotorregionen og fra 5′-UTR af

KRAS

mRNA og også undertrykke både gentranskription og translation [ ,,,0],13,19]. Fig 6B viser, at 1a, 2a og 2d kunne nedregulere KRAS transkription med ca. 40% i HCT116 celler, men ikke signifikant, så i SW620-celler. En mulig forklaring er den tid punkt, hvor vi evaluerede

KRAS

mRNA og protein steady state-niveauerne. Efter 72 timers IQ3A eksponering kan der ikke længere være signifikant undertrykkelse af

KRAS

promoter aktivitet i SW620 cellelinje, hvorimod protein niveauer forbliver reduceret som følge af akkumulerede IQ3A effekter. Også, TMPyP4 ikke var i stand til at reducere

KRAS

mRNA steady state niveauer i HCT116 cellelinie, i modsætning til et fald på ca. 80% af protein steady state niveauer (Fig 6A og 6B). Disse resultater er i overensstemmelse med den rapporterede evne TMPyP4 til fortrinsvis ophobes i cytoplasmaet i celler [19], hvor det kan hæmme

KRAS

mRNA translation.

A. KRAS og HSP90-protein steady-state-ekspression vurderet ved immunoblot forhold til DMSO (vehikelkontrol), efter 72 h udsættelse for equitoxic (IC

50) koncentrationer af 5-FU, TMPyP4 og IQ3A behandling; B.

KRAS

mRNA steady-state-ekspression blev vurderet ved Taqman Real-time RT-PCR ved hjælp specifikke Taqman Analyser for KRAS og β-actin til normalisering.

KRAS

mRNA steady-state ekspressionsniveauerne blev beregnet ved den ΔΔCt metode med DMSO (køretøj kontrol) til kalibrering; og C. HEK293T celler blev cotransficeret med pGL3-grundlæggende vektor (tom vektor kontrol), eller med

KRAS

promotor luciferase reporter konstruere PGL-Ras0.5 eller PGL-Ras2.0 sammen med pRL- TK. Fireogtyve timer senere blev cellerne genudpladet i 96-brønds plader, på 5.000 celler pr. Efterfølgende 24 timer efter udpladning, celler blev udsat for IC

50 equitoxic koncentration af testforbindelser IQ3A, TMPyP4 og vehikel (DMSO); D. HCT116, SW620 og HEK293T celler co-transficeret med pGL3-Basic Vector (tom vektor kontrol) eller med KRAS promotor luciferase reporter konstruere PGL-Ras0.5 sammen med pRL-TK. Fireogtyve timer senere blev cellerne genudpladet i 96-brønds plader, ved 5000 celler per brønd og eksponeret for IC

50 equitoxic koncentration af testforbindelser IQ3A, TMPyP4 og vehikel (DMSO).

KRAS

promotor aktivitetsniveauer blev evalueret ved Dual-Luciferase assay 72 timer (C.) eller 24 timer (D.) efter forbindelse eksponering. Resultater udtrykkes som den luciferase signal forholdet PGL-Ras2.0 eller PGL-Ras0.5 til pGL3-basisk vektor transficerede celler, efter normalisering med Renilla Luciferase. Resultater udtrykkes som middel ± SEM af mindst tre uafhængige forsøg; * P 0,05 og §p 0.01 fra DMSO (køretøj kontrol); og † p 0,05 og ‡ p 0.01 fra 5-FU.

For at validere, at den mekanisme af anti-proliferativ aktivitet og apoptotisk induktion af IQ3A forbindelser involverer undertrykkelse af

KRAS

genekspression som følge af stabiliseringen af G4-dannende sekvenser til stede i promotoren, virkningerne af forbindelser på

KRAS

genpromotoren var direkte evalueret af en luciferase reporter assay. Til dette formål anvendte vi to forskellige størrelse promotorkonstruktioner indeholdende G4 region af

KRAS

genpromotor, klonet ind i pGL3 Basic backbone: PGL-Ras0.5, PGL-Ras2.0, og pGL3 Basic tom (Firefly Luciferase negativ kontrol /nej promotor), co-transficeres sammen med pRL-TK (transfektionseffektivitet normalisering) ind HEK293T celler, som en G4 negativ kontrol. Denne konstruktion er ikke havnen G4 sekvenser og er ufølsom over for G4-effekter /regulering. Vores data viser tydeligt, at IQ3A forbindelser, på samme måde som TMPyP4, var i stand til at reducere betydeligt

KRAS

transskription, foreslår vi ved at interagere med G4 region af

KRAS

gen promoter, undertrykke nedstrøms coding- region ekspression fra 40 til 60% versus DMSO-kontrol (

s Restaurant 0,01) (fig 6C). Med begge plasmider, med 500 og 2000 bp opstrøms for transkriptionsstartsitet, vi viser også, at mål-området af IQ3A forbindelser er inden for dette område, således sammenfaldende med polypurin G-rige streng ansvarlig for G-quadruplex struktur samling [12 ]. Vigtigt er det, vi var også i stand til at vise, at IQ3A forbindelser, på samme måde som TMPyP4, var i stand til at reducere

KRAS

promoter aktivitet i HCT116 og SW620 celler (Fig 6D).

Konklusioner

Vi har i denne undersøgelse undersøgte muligheden for en gruppe af 7-carboxylat indol [3,2

b

] quinolin tri-alkylaminderivater (IQ3A), der er potente stabilisatorer af nuværende DNA G4 strukturer i

KRAS

promotor, at nedregulere

KRAS

ekspression og inducerer celledød ved apoptose, navnlig i KRAS-afhængige coloncancer-cellelinjer. De IQ3A forbindelser markant viste anti-proliferativ aktivitet i en IC

50 rækkevidde lavere end 2,69 uM i HCT116 og SW620 celler. Især i HCT116 celler, IQ3A forbindelser på IC

65 koncentration øget celledød op til 4,7 gange (

s

0,01) og 2,4 gange (

s

0,01) i sammenligning med DMSO eller 5-FU, henholdsvis. Hertil kommer, i ikke-maligne cellelinjer de IQ3A forbindelser ikke forårsage betydelig celledød. Endvidere de markant reduceret

KRAS

mRNA ekspression og protein niveauer i colon cancerceller muligvis gennem direkte transkriptionel repression af

KRAS

promotor. Vores data til dato viser en korrelativ sammenhæng mellem transkriptionel repression og binding til G4-regionen inden for denne promotor, selv om der er behov for yderligere undersøgelser med henblik på at påvise en direkte forbindelse mellem de to. Undertrykkelsen effekt blev ledsaget af øget p53 protein steady state niveauer i HCT116, og kun en mindre reduktion af HSP90 niveauer i de tre testede cellelinjer, hvilket indikerer, at disse forbindelser ikke er også at have en effekt på nogle andre mulige G4 mål som i hsp90-promotoren [27]. Snarere de IQ3A forbindelser er selektivt rettet mod de

KRAS

driver gener i tyktarmskræft cellelinjer. Kollektivt disse resultater, at G4-bindende ligander, såsom disse indoloquinoline derivater, display potentiale til at blive anvendt som hidtil ukendte anticancer terapeutiske midler, især til behandling af humane cancere drevet af KRAS-mutationer, som stadig i vid udstrækning cancere i høj uopfyldte behandlingsbehov har brug for.

Materialer og Metoder

Kemi

7-carboxylat indol [3,2

b

] quinolin tri-alkylamin derivater 1a-d og 2a-d (IQ3A) blev syntetiseret som beskrevet i S1 tekst. 5-fluorouracil (5-FU) og TMPyP4 blev indkøbt fra Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA.

Oligonukleotider sekvenser

Alle oligonukleotider blev købt hos Eurofins MWG Synthesis GmbH, Tyskland. De mærkede oligonukleotider anvendt i FRET assays havde fæstnet donorfluoroforen FAM (6-carboxyfluorescein) og acceptorfluoroforen TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamin): KRAS21R (5′-FAM-AGGGCGGTGTGGGAAGAGGGA-TAMRA-3 ‘); HSP90A (5′[FAM] -GGGCCAAAGGGAAGGGGTGGG- [TAMRA] -3 ‘); T-Loop (5’-FAM-TATAGCTATATTTTTTTATAGCTATA-TAMRA-3 ‘). Hver oligonukleotid blev oprindeligt fortyndet til en opbevaringsløsning på 100 uM i nuklease frit vand (ikke DEPC-behandlet), købt fra Ambion Applied Biosystems UK.

FRET smeltende assay

evne IQ3A og TMPyP4 at stabilisere G-quadruplex og duplex DNA-sekvenser blev undersøgt ved anvendelse af en Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) assay. Stamopløsning af oligonukleotiderne sekvenser ved 20 pM og efterfølgende fortyndinger blev opnået fra opbevaringsløsninger fortynding med K-cacodylat, pH = 7,4, indeholdende 60 mM K

+ (10 mM kaliumcacodylat, 50 mM KCI). De FRET probesekvenser blev fortyndet fra lager til den korrekte koncentration (0,4 uM) og derefter annealet ved opvarmning til 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af afkøling til stuetemperatur. Testforbindelser blev fremstillet som 1 mM i 10% DMSO og 10% 1 mM HCI i HPLC-kvalitet vand. Resten af ​​fortyndinger blev udført under anvendelse FRET puffer. Annealet DNA (50 pi) og forbindelse (50 pi) blev fordelt over 96 brønde RT-PCR-plader (BioRad; MJ Research, Waltham, MA, USA). Relevante kontroller blev også udført for at kontrollere for interferens med assayet. Fluorescensaflæsninger blev foretaget på en DNA Engine Opticon (MJ Research) med excitation ved 450 til 495 nm og påvisning ved 515-545 nm, taget med intervaller på 0,5 ° C i intervallet 30-100 ° C, med en konstant temperatur opretholdes i 30 s forud for hver læsning at sikre en stabil værdi. Eksperimenter blev udført tre gange. Endelig analyse af data blev udført med GraphPad Prism 5.0 software (GraphPad Software, Inc). Den avancerede kurve-fitting funktion i GraphPad Prism blev anvendt til beregning af Δ

T

m

værdier og tilhørende standardafvigelser.

Cell kultur

SW620 humane kolorektale adenocarcinomceller (European Collection of Cell Cultures, ECACC, Porton Down, Wiltshire, UK), HEK293T humane embryonale nyreceller (ATCC, LGC standarder, UK) HCT116 human tyktarmscarcinomceller (ECACC), HCT116 p53 (+ /+) og p53 (- /-) isogene humane coloncancer-celler (GRCF Cell center og Biorepository, Johns Hopkins University, School of Medicine, Baltimore, MD, USA), blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% antibiotisk /antimykotisk (Invitrogen, Grand Island, NY, USA), CCD18co human colon fibroblaster (ATCC, CRL 1459) blev dyrket i Minimum Essential Medium (MEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum , 1% antibiotisk /antimykotisk, 2 mM GlutaMAX, 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer (NEAA) (Invitrogen) og 0,57 mM Rekombinant human TNF-α (Peprotech, USA) og holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af