PLoS ONE: Knockdown af MTDH sensibiliserer endometriecancer Cells til celledød Induktion af Døden receptor ligand TRAIL og HDAC-hæmmer LBH589 Co-behandling

Abstrakte

Forståelse af de molekylære fundament for kemoresistens er afgørende at designe terapier for at genoprette kemosensitivitet. Især har metadherin (MTDH) blevet påvist at have en kritisk rolle i kemoresistens. Over-ekspression af MTDH korrelerer med dårligt klinisk resultat ved brystcancer, neuroblastom, hepatocellulært carcinom og prostatacancer. MTDH er også stærkt til udtryk i avanceret livmoderkræft, en sygdom, for hvilken der er et presserende behov for nye behandlingsformer. I nærværende undersøgelse har vi fokuseret på den terapeutiske fordel af MTDH udtynding i endometriecancer celler til at genoprette følsomhed for celledød. Celler blev behandlet med en kombination af tumornekrosefaktor-α-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL), som fremmer død af maligne celler i det menneskelige reproduktive tarmkanalen, og histon deacetylase (HDAC) -hæmmere, som er blevet vist at forøge følsomheden af cancerceller til TRAIL-induceret apoptose. Vores data viser, at udtømning af MTDH i endometriecancer celler resulterede i sensibilisering af celler, der tidligere var resistente reaktion på kombinatorisk behandling med TRAIL og HDAC-hæmmer LBH589. MTDH knockdown reduceret andelen af ​​celler i S og forøget celle standsning i G2 /M i celler behandlet med LBH589 alene eller LBH589 i kombination med TRAIL, hvilket antyder at MTDH funktioner på cellecyklus checkpoint at opnå resistens. Brug af mikroopstillingsteknologi identificerede vi 57 nedstrøms målgener af MTDH, herunder calbindin 1 og galectin-1, som kan bidrage til MTDH-medieret terapeutisk modstand. På den anden side, i MTDH depleteret celler, inhibering af PDK1 og AKT phosphorylering sammen med øget Bim ekspression og XIAP nedbrydning korreleret med forøget følsomhed over for celledød som respons på TRAIL og LBH589. Disse resultater viser, at målretning eller nedbrydende MTDH er en potentielt ny avenue for at vende terapeutisk modstand hos patienter med endometriecancer

Henvisning:. Meng X, Brachova P, Yang S, Xiong Z, Zhang Y, Thiel KW, et al. (2011) Knockdown af MTDH sensibiliserer endometriecancer Cells til celledød Induktion af Døden receptor ligand TRAIL og HDAC-hæmmer LBH589 Co-behandling. PLoS ONE 6 (6): e20920. doi: 10,1371 /journal.pone.0020920

Redaktør: Andrei L. Gartel, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: December 22, 2010; Accepteret: 16 maj 2011; Udgivet: 8 juni 2011

Copyright: © 2011 Meng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) Tilskud R01CA99908 til KKL, og dels af Institut for Obstetrik og Gynækologi Research Development Fund, Institutional Research Grant Number IRG-77-004-31 fra American Cancer Society til XM, administreret gennem Holden Comprehensive Cancer center ved University of Iowa. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

et almindeligt problem med kræftbehandling er udviklingen af ​​resistens, og en forbedret forståelse af de underliggende involverede veje med resistens kan føre til udvikling af nye strategier for at overvinde denne modstand. Et nyligt opdaget gen, metadherin (MTDH, også kendt som AEG-1 eller LYRIC) har vist sig som en potentielt afgørende mediator af tumorudvikling, metastase, og modstand mod kemoterapi [1], [2], [3], [4] . foreslås MTDH at fremme tumor progression gennem integration af flere signalveje herunder ras, myc, Wnt, PI3K /AKT, og NF-KB i forskellige typer af cancerceller [4], [5], [6], [7] , skønt den mekanisme, hvormed MTDH kontrollerer disse signaleringsbegivenheder er uklar. I denne undersøgelse undersøgte vi rolle MTDH i endometriecancer og dets hæmning som en mekanisme til at overvinde resistens.

Indledende interesse i MTDH som en faktor i kemoresistens opstod som følge af NCI60 farmakogenomiske data, der findes at den genomiske kopi nummer gevinst på 8q22 er et definerende begivenhed i kemoresistens [8]. En tidligere undersøgelse rapporterede, at lymfeknudemetastaser er signifikant associeret med kopital gevinster ved 8q22-q23 i endometriecancere [9]. Hidtil, MTDH er den eneste kendte genet på 8q22, som har vist sig at korrelere med dårlige kliniske resultater hos patienter med solide tumorer [8].

In vitro

in vivo

kemoresistens analyser bekræftede, at MTDH knockdown sensibiliserer forskellige typer tumorer – herunder brystcancer, hepatocellulært carcinom, prostatacancer, og neuroblastoma- til flere kemoterapeutiske midler, såsom 5- fluoruracil (5-FU), cisplatin, paclitaxel, doxorubicin og [1], [10], [11]. Men evne MTDH knockdown at bevidstgøre celler til målrettede behandlinger, der er kommet til at symbolisere fremtiden for kræftmedicin, er endnu ikke undersøgt.

tumornekrosefaktor (TNF) -α-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) for nylig vist sig som en lovende målrettet terapeutisk strategi i forskellige typer af kræft på grund af sin pro-apoptotiske egenskaber [12], [13]. Som medlem af TNF-familien, TRAIL specifikt aktiverer ekstrinsiske apoptotiske veje i cancerceller ved at binde til dødsreceptorer. Vigtigere er det, TRAIL selektivt fremmer apoptose af tumorceller, men har ingen effekt på normale tarmkanalen celler menneskelige reproduktive herunder i endometrium, ovarie, livmoderhalsen eller æggeleder [13]. Nogle kræftceller er modstandsdygtige over for TRAIL-induceret apoptose [14], [15], [16], derfor kombinatoriske regimer er blevet vedtaget for at genskabe følsomhed [13], [17]. I flere studier har histon deacetylase (HDAC) inhibitorer vist sig at yderligere øgning af følsomheden for TRAIL-induceret apoptotisk celledød [18], [19], [20], [21]. Desværre nogle kræftceller tilbage resistente over for kombineret TRAIL og HDAC-hæmmer behandling [22], og nye tilgange til at genoprette følsomhed over for disse målrettede behandlinger er nødvendige.

Vi undersøgte effekten af ​​nedbrydende MTDH niveauer på at genoprette følsomhed over for trail baserede målrettede behandlinger. De indberettede data heri viser, at MTDH regulerer cellecyklus og celle overlevelse som respons på behandling med HDAC-hæmmere og TRAIL, tyder på, at MTDH er en lovende terapeutisk mål at øge effektiviteten af ​​TRAIL og HDAC-hæmmer kombinatorisk behandling.

Resultater

MTDH udtryk er forhøjet i endometriecancer cellelinjer og væv

MTDH blev stærkt udtrykte på proteinniveauet i alle seks endometriecancer testede cellelinjer (RL95, AN3CA, KLE, Ishikawa, Hec50co og ECC1, figur 1A). I endometriecancer patient væv, blev MTDH udtryk forhøjet i forhold til normal endometrium (figur 1B). Specifikt ekspressionen af ​​80 kDa MTDH og formodede 50-55 kDa MTDH isoformer var signifikant højere i endometriecancer prøver herunder papillær serøs, sarkom og adenocarcinom, hvorimod MTDH var ikke påviselig hos normale endometriske væv (figur 1b). Fordi ingen MTDH blev detekteret i normalt endometriosevævet, vi blottet for tumor suppressor LKB1 som en kontrol (figur 1B). Forøget ekspression af cytoplasmatisk MTDH i endometrial adenokarcinom og nuklear MTDH i nogle metastatisk endometriecancer blev også observeret i endometriecancer væv som vist i figur 1C ved immunhistokemi med en MTDH-specifikt antistof. XIAP og FLIP er to pro-overlevelse proteiner forbundet med død receptor-induceret extrinsic apoptosecyklus [12]. Vi undersøgte derfor, om der er en sammenhæng mellem udtryk for pro-overlevelse proteiner XIAP og FLIP med MTDH udtryk. Mens udtryk for MTDH og XIAP ikke korrelere, vi registrerer en sammenhæng med FLIP udtryk (figur 1B). Den forøgede ekspression af MTDH i alle kræftceller og undersøgte væv tyder på, at det kan spille en rolle i endometrisk carcinogenese

(A) Ekspression af MTDH blev påvist i alle de seks testede endometriecancer cellelinier:. RL95, AN3CA, ECC1, Ishikawa H (Ishi) KLE og Hec50 celler. (B) Ekspression af MTDH blev påvist i endometriske væv fra to normale individer, fire patienter med papillære serøse, tre patienter med adenocarcinom, og to patienter med endometrisk sarkom. Ekspression af tumorsuppressorgen LKB1 og to anti-apoptotiske gener, XIAP og FLIP, blev også påvist ved Western blotting i de samme prøver. (C) MTDH ekspression blev påvist ved immunhistokemi farvning under anvendelse af sygdommen spektrum (endometriecancer progression) vævsarray med over 50 prøver af endometriske væv fra benign til kræft. (I) normale endometrievæv, (ii) lav kvalitet endometrial adenokarcinom, (iii) høj kvalitet endometrial adenokarcinom, og (iv) endometriecancer metastatisk til bughulen. Original forstørrelse, × 400.

Knockdown af MTDH reducerer kolonidannelse

På grund af den forhøjede udtryk MTDH i de forskellige endometriecancer cellelinjer og humane endometriecancer prøver vi næste undersøgt den tumorigent potentiale MTDH i type II endometriecancer cellelinje Hec50co ved hjælp af en kort hårnål RNA (shRNA) specifikt for MTDH. En 3,49-gange reduktion i MTDH genekspression påvistes ved kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) i MTDH shRNA-transficerede Hec50co celler sammenlignet med kontrol røræg shRNA-transficerede celler (tabel S1). Udtømning af MTDH faldt kolonidannelse i celler, der stabilt udtrykker MTDH shRNA sammenlignet med kontrol shRNA (figur 2A, B). Disse resultater blev bekræftet ved hjælp af tre shRNA konstruktioner rettet mod forskellige regioner i MTDH. En lignende fænotype blev også observeret ved knockdown af MTDH i Ishikawa H Type I endometrial cancerceller, hvilket indikerer, at forhøjede MTDH ekspression generelt kræves for endometriecancer kolonidannelse.

Hec50co celler blev transficeret med kontrol eller MTDH shRNA ekspressionsvektorer . (A) Kolonier dannet ved kontrol eller MTDH shRNA-transficerede Hec50co celler er vist efter transfektion af shRNAs og efter selektion med 2 ug /ml puromycin i 3 uger. (B) Kvantificering af den relative kolonidannelse i kontrol versus MTDH knockdown Hec50co celler.

Identifikation af MTDH-regulerede gener i endometrie cancer cellelinjer

For at identificere nedstrøms gener medierer tumorigen virkninger af MTDH i endometriecancer cellelinjer, blev en Affymetrix oligonukleotid microarray (human gen-array 1.0 ST) anvendes til at påvise differentielt udtrykte gener i Hec50co celler stabilt transficeret med enten MTDH shRNA eller en kontrol shRNA (data er deponeret på GEO, GSE26134) . Udtømning af MTDH ved knockdown resulterede i mindst to-fold genekspression ændring af 57 gener (figur 3A). Adskillige af disse gener blev tilfældigt valgt til at bekræfte ændringerne ved QRT-PCR (figur 3B).

(A) Heat kort af to-gange ændring af genekspression (som bestemt fra Affymetrix array-data) mellem kontrol og MTDH knockdown Hec50co celler. (B) genekspression ændringer blev valideret af QRT-PCR for de angivne generne identificeret i mikroarrayet (* p 0,05). (C) Ekspression og /eller phosphorylering af de angivne proteiner blev undersøgt i Hec50co celler, der stabilt udtrykker enten kontrol shRNA eller MTDH shRNA. Samlet PDK1 og β-actin blev anvendt som indlæsning kontroller. (D, E) Angivelse af PIP3 blev påvist i kontrol (D) eller MTDH knockdown (E) Hec50co celler ved PIP3 immuno-fluorescerende farvning.

Data fra array viste, at MTDH regulerer ekspression af gener involveret i invasion, tight junctions, samt kemoresistens (tabel S1 og S2). For eksempel, galectin-1 (LGALS1) og calbindin 1 (Calb1) var markant nedreguleres på mRNA (figur 3B) og proteinniveauer (figur 3C) i MTDH shRNA-transficerede Hec50co celler. Calb1 og galectin-1 er to formodede MTDH downstream gener, der kan regulere metabolismen af ​​phosphatidylinositol, som er en del af PI3K /AKT-signalvejen almindeligvis opreguleret i endometriecancer [23]. Vi undersøgte også ændringer i genekspression i Ishikawa H endometriecancer celler som respons på MTDH lyddæmpning og observeres nogen overlapning med gener, der er blevet omformet i Hec50co celler (Tabel S3 og S4).

Vi næste søgt at forstå, hvordan MTDH regulerer PI3K /Akt pathway. Ekspression af galectin-1 opreguleres i forskellige typer af tumorer og angives at mediere tumorinvasion og metastase ved at øge ekspression af matrixmetalloproteinase MMP-9 og MMP-2 og fremme omorganisering af actincytoskelettet [24]. I overensstemmelse med en tidligere undersøgelse, hvor overekspression af MTDH fremmer aktivering af PI3K /AKT pathway i neuroblastom [7], vi har registreret en inhibering af bestanddele af PI3K /AKT signalvejen i Hec50co celler med forarmet MTDH sammenlignet med kontrol (figur 3C) . Konkret en dramatisk reduktion i PDK1 fosforylering på S241 og AKT fosforylering på både T308 og S473 forekom i MTDH knockdown celler, selv blev opdaget ingen signifikant ændring af den samlede PDK1 proteinniveau (figur 3C). Som vist i figur 3D og E, blev registreret en dramatisk reduktion i niveauet af PIP3 i Hec50co celler med MTDH shRNA sammenlignet med celler med kontrol shRNA. Disse resultater viser, at MTDH kan aktivere de pro-overlevelse veje for PI3K /AKT via opregulering af PIP3.

MTDH knockdown sensibiliserer celler til målrettede behandlinger mod kræft

For at overvinde modstanden mod terapier, HDAC inhibitorer, såsom LBH589 er blevet anvendt til at genoprette TRAIL-induceret apoptose i forskellige typer af cancere [18], [19]. Hec50co celler blev tidligere vist sig at være resistente over for TRAIL-medieret apoptose [13]. Derfor, for at teste indflydelsen af ​​MTDH på følsomhed over for TRAIL i disse celler behandlede vi Hec50co celler med eller uden MTDH (kontrol vs. MTDH knockdown) med kombineret TRAIL og LBH589 behandling i tre dage og derefter undersøgt cellelevedygtighed. Sammenlignet med røræg shRNA transficerede Hec50co celler, stabilt MTDH knockdown let øget følsomhed over Hec50co celler til enkelt middel terapi (enten LBH589 eller TRAIL alene, figur 4A, B). Som vist i figur 4B, en mere dramatisk induktion af sensitivitet forekom i stabil MTDH knockdown Hec50co celler med kombinationen af ​​LBH589 og TRAIL. Disse data tyder på, at MTDH udtryk er en vigtig faktor bag modstand til den kombinerede regime.

(A) Cell død induktion ved LBH589 som et enkelt middel blev påvist i kontrol eller MTDH knockdown Hec50co celler. Efter 3 dage blev celledød bestemt ved WST-1-metoden. (B) Cell død som følge af forskellige koncentrationer af TRAIL (5 til 50 ng /ml) alene eller i kombination med 5 nM LBH589 blev analyseret i kontrol- eller MTDH knockdown Hec50co celler.

Apoptosis regulatorer involveret i MTDH-medieret celledød

for at undersøge molekylære mekanisme for celledød i MTDH knockdown celler, blev ekspressionen af ​​proteiner forbundet med apoptose (både pro- og anti-apoptotiske faktorer) testet i MTDH kontrol og knockdown celler efter single behandling (LBH589 eller TRAIL) eller efter kombineret behandling (LBH589 og TRAIL). Kombinationen behandling ikke øge ekspressionen af ​​sporet receptorerne DR4 og DR5. Derudover var der ingen ændringer i ekspressionen af ​​anti-apoptotiske gener Bd-XL, MCL-1, eller FLIP i MTDH kontrol og knockdown Hec50co celler efter den kombinatoriske behandling (figur 5).

Kontrol eller MTDH knockdown Hec50co celler blev behandlet i 24 timer med vehikelkontrol, 20 nM LBH589, 25 ng /ml TRAIL eller LBH589 og TRAIL ved koncentrationerne noteret. Lysater blev opsamlet. Angivelse af DR4, DR5, og apoptose relaterede caspase-3, caspase-8, PARP-1, BID, FLIP, XIAP, Bim, MCL-1 og BCL-XL blev analyseret ved Western blotting.

Interessant nok pro-apoptotiske BH3-only protein Bim var opreguleret i ubehandlet MTDH knockdown Hec50co celler sammenlignet med kontrolceller (figur 5), hvilket indikerer, at udtømning af MTDH alene kan føre til induktion af pro-apoptotiske faktorer. Når kontrol Hec50co celler blev behandlet med LBH589 alene eller i kombination med TRAIL, ekspression af Bim steget. I modsætning hertil blev ekspression af Bim signifikant forøget i MTDH knockdown Hec50co celler uden behandling, mens behandling med enten LBH589 eller TRAIL yderligere styrket ekspressionen af ​​Bim. Imidlertid blev Bim udtryk faldet lidt i MTDH knockdown celler efter samtidig behandling med LBH589 og TRAIL.

I kontrol celler, posttranslationel modifikation af XIAP skete ved behandling med LBH589, hvilket fremgår af en højere migrerende arter, og reduktion af både total og modificeret XIAP blev kun påvist med LBH589 og TRAIL kombinationsbehandling (figur 5). Denne effekt blev forstærket, da MTDH blev slået ned, sådan at vi registreret en større reduktion i XIAP posttranslationel modifikation i MTDH knockdown Hec50co celler sammenlignet med kontrol celler efter LBH589 og TRAIL behandling. Endvidere blev signifikant induktion af spaltning af caspase-8, caspase-3 og PARP-1 påvist efter enkelt behandling med LBH589 eller TRAIL, eller kombinationen i MTDH knockdown Hec50co celler sammenlignet med kontrolceller. Reduktion af Bid blev også observeret i MTDH knockdown celler behandlet med kombinationen af ​​LBH589 og TRAIL. Kollektivt, disse data, at knockdown af MTDH kan øge ydre apoptose induceret af TRAIL og LBH589, og den vigtigste mekanisme er via opregulering af Bim. Nedregulering af XIAP og efterfølgende aktivering af caspase-8 og caspase-3 samt downstream substrater såsom PARP-1 forekommer også.

Cell cyklus checkpoint regulering af MTDH

For at bestemme den præcise mekanisme, hvorved MTDH giver resistens mod TRAIL og LBH589 behandling, vi næste undersøgt rolle MTDH i cellecyklus kontrol. Kontrol- og MTDH knockdown Hec50co celler, der var ubehandlet eller behandlet med TRAIL alene havde lignende cellecyklus profiler (Figur 6A). I modsætning hertil behandling med HDAC inhibitor LBH589 i celler, der mangler MTDH resulterede i en større del af celler vedholdende i G2 /M-fasen. Når Hec50co MTDH knockdown celler blev behandlet med både LBH589 og TRAIL, en nedsat andel af celler var i S-fasen og en øget andel af celler blev standset i G2 /M (fig. 6A). Disse data viser, at MTDH har en væsentlig rolle i reguleringen af ​​cellecyklus checkpoint i forbindelse med kombinatorisk TRAIL og HDAC inhibitor behandling.

(A) cellecyklus-profiler blev bestemt i kontrol- eller MTDH knockdown Hec50co celler efter 24 timer efter behandling med 20 nM LBH589, 25 ng /ml TRAIL eller LBH589 og TRAIL i kombination. Procentdelen af ​​celler i G1, blev S og G2 /M-faser bestemmes. (B) Ændringen i Aurora A, Aurora B, p21, histon H3 acetylering ved lysin 9, histon H3 phosphorylering i serin 10 og total histon H3 blev bedømt ved Western blotting efter 24 timers behandling med de angivne reagenser. Total histon H3 blev anvendt som en loading kontrol. (C) En model for belyst mekanisme, hvorved knockdown af MTDH øger celledød ved TRAIL og HDAC-hæmmer LBH589. MTDH knockdown nedsætter phosphorylering af PDK1 og dets substrat AKT, hvilket resulterer i forøget ekspression af proapoptotiske protein Bim. XIAP-ekspression nedreguleres som reaktion på kombineret LBH589 og TRAIL behandling, derved frigøre XIAP medieret inhibering af caspase-3 og -8 aktivering. Kollektivt, reguleringen af ​​disse veje fremmer apoptotisk celledød.

For at undersøge den mekanisme, hvormed MTDH regulerer cellecyklus blev udtryk for cellecyklus regulatorer målt. Forhøjelse af Aurora A på proteinniveauet blev observeret i MTDH knockdown celler i sammenligning med kontrolceller (figur 6B). Når kontrol og MTDH knockdown Hec50co celler blev udsat for LBH589, var der en stigning i Aurora A, Aurora B, acetylering af histon H3 ved lysin 9, phosphorylering af histon H3 på serin 10, og p53-uafhængig opregulering af p21 WAF1, inhibitoren af ​​cyclinafhængige kinaser (figur 6B). Interessant TRAIL behandling resulterede i et væsentligt fald i histon H3 phosphorylering, hvilket svarede til et fald i procentdelen af ​​celler i G2 /M-fase sammenlignet med ubehandlede celler. Samlet disse data implicerer en hidtil ukendt rolle for MTDH i regulering cellecykluskontrolpunkter.

Discussion

Selvom MTDH er blevet forbundet med både metastase og resistens mod kemoterapi i forskellige typer af cancere [1], [ ,,,0],25], mekanismen og biologiske funktion af MTDH er stort set ukendt. Udtømning af MTDH kan forstærke effekten af ​​kemoterapeutiske lægemidler, såsom doxorubicin, paclitaxel og 5-FU [10], [11]. Her rapporterer vi, at ekspressionen af ​​MTDH er stærkt forhøjet i endometrie kræftformer væv i forhold til normale endometrium. Vores data viser, at udtømning af MTDH med en bestemt shRNA kan også øge cellulære følsomhed over for målrettede behandlinger, herunder HDAC-hæmmer LBH589, TRAIL og en kombinationsbehandling med begge midler. Som afbildet i figur 6C, har vi identificeret den mulige mekanisme, ved hvilken knockdown af MTDH øger celledød som respons på behandling med TRAIL og HDAC inhibitor LBH589. Specifikt har celler, der mangler MTDH formindsket phosphorylering af PDK1 og dets substrat AKT, som igen stimulerer ekspression af proapoptotiske protein Bim. Kombinerede LBH589 og TRAIL behandling resulterer i nedregulering af XIAP, hvorved aktivering af caspase-3 og -8. Disse molekylære ændringer resulterer i apoptotisk celledød i celler, der mangler MTDH. Vore data foreslår derfor, at MTDH-medieret resistens sker gennem aktivering af pro-overlevelse signalveje og potentielt ved afvigende regulering af cellecyklus checkpoints.

Ved hjælp af en microarray tilgang, vi identificeret mange kandidatgener, der forskelligt reguleret i celler mangler (MTDH shRNA) eller ekspression (kontrol shRNA) MTDH. Af særlig interesse var calbindin 1 (CALB1) og galectin-1, to proteiner, som tidligere har været forbundet med pro-overlevelse signalveje. CALB1 er et calciumbindende protein med fire aktive calcium bindingsdomæner. CALB1 blev rapporteret at interagere med Myo-inositolmonophosphatase (IMPA) under anvendelse af fagdisplay og at inducere IMPA aktivitet op til 250-fold [26], [27]. IMPA er et enzym, dephosphorylerer myo-inositol-monophosphat, myo-inositol-1,3-diphosphat, og myo-inositol-1,4-diphosphat til at generere frie myo-inositol som spiller vigtig rolle i programmeret celledød [28]. Galectin-1, en beta-galactosidase-bindende protein, udtrykkes kraftigt i en række humane cancere og har vist sig at spille en rolle i PI3K-signalering og Akt aktivering [29]. I glioblastomceller, knockdown af galectin-1 påvirker evnen af ​​insulin-lignende vækstfaktor (IGF1) stimulation at løfte cellulære PIP3 niveauer (Perry et al., 2010, AACR 101

st årsmøde abstract 301). Vores data indikerer, at MTDH-medieret opregulering af galectin-1 og CALB1 kan være den mekanisme, hvorved MTDH stimulerer en stigning i PIP3 niveauer, for derved at aktivere PI3K /AKT /mTOR pathway. Denne vej spiller en vigtig rolle i endometrial carcinogenese, enten ved mutation af PTEN eller ved andre mekanismer, konstitutiv aktivering er reglen. Vores identifikation af overekspression af MTDH medføre forhøjede PIP3 niveauer giver endnu en potentiel forklaring på den høje aktivitet af PI3K og AKT ofte i livmoderkræft.

Inhibering af MTDH blev vist at forøge celledød induceret af LBH589 og TRAIL kombinationsbehandling (figur 4). TRAIL kan fremkalde ydre apoptose via direkte bindende med dødsreceptorer. Men mens TRAIL selektivt kan inducere apoptose i endometriecancer-celler, det kan ikke inducere apoptose i normale endometriske væv ved den samme koncentration. Desuden at koncentrationen af ​​TRAIL (200 ng /ml) er nødvendige inducere apoptose i endometriecancer-celler er langt højere end den, der tidligere er anvendt til celler fra andre faste tumorer (fx 25-50 ng /ml i pancreascancer) [13], [ ,,,0],30]. Dette indikerer potentiel baseline modstand mod TRAIL i endometriecancer, som kunne være knyttet til høj MTDH udtryk. For at overvinde modstand, har flere kemoterapeutiske stoffer eller målrettede inhibitorer, der er blevet rapporteret til at øge følsomheden over for TRAIL-induceret apoptose været anvendt i kombinatoriske regimer [12]. Her demonstrerer vi, at HDAC inhibitor LBH589 kan øge TRAIL-medieret caspase-8-aktivering og efterfølgende ydre celledød i endometriecancer-celler. Knockdown af MTDH kan endvidere stimulere caspase-8 spaltning induceret af LBH589, TRAIL, eller kombinationen af ​​de to. En stigning i XIAP post-translation modificering, en reduktion i total XIAP, og induktion af pro-apoptose genet Bim blev observeret i celler behandlet med alene LBH589. Tab af bud blev observeret i MTDH knockdown celler efter kombination LBH589 og TRAIL behandling, hvilket sandsynligvis skyldes Bid aktivering via spaltning. Konstateringen af ​​nedsat Bim med den samme behandling var noget uventet. Men vores data i figur 3 antyder, at MTDH knockdown negativt regulerer Akt pathway, som i første omgang kan resultere i forhøjet udtryk for Bim. Som celler fremskridt gennem apoptose, kan mindre stabile proteiner være genstand for nedbrydning. Da MTDH knockdown celler har fremskyndet celledød som respons på kombinationsbehandlingen (figur 4), er det muligt, at faldet i Bim er en afspejling af hurtig protein turnover.

Som reaktion på LBH589 behandling alene eller sammen med TRAIL de to vigtigste virkninger af MTDH knockdown på cellecyklus var et fald i procentdelen af ​​celler i S og en samtidig forøgelse i procent af celler i G2 /M, hvor cellerne synes at være standset. På det cellulære niveau, dog knockdown MTDH alene i fravær af behandling påvirkede ikke udtryk for kanoniske cellecyklus regulerende proteiner. F.eks LBH589 signifikant forøget histon H3 acetylering på lysin 9 (figur 6B), der kan tillade, at transkriptionel aktivering af p21-genet [31]. Imidlertid blev H3 modifikation ikke påvirket af shRNA knockdown af MTDH. Proteasom-medieret nedbrydning af Aurora A, Aurora B og c-FLIP blev rapporteret at være ansvarlig for stigningen i følsomhed over for TRAIL af HDAC-hæmmer behandling i nogle kræftceller [15], [32]. Der blev dog ikke observeret nogen væsentlige ændringer i Aurora A og B eller C-FLIP-niveauer i endometriecancer celler behandlet med LBH589 i vores studier.

Dette er den første rapport af MTDH indvirkning på modstand i målrettet behandling for endometriecancer . Til disse undersøgelser, valgte vi kombinationen af ​​LBH589 og TRAIL grund af virkningen af ​​disse midler på proapoptotiske veje. Vi demonstrerer heri, at knockdown af MTDH sensibiliserer celler til programmeret celledød, selvom en mekanisme, der involverer hæmning af PDK1 og Akt fosforylering, stigning i Bim, og reduktion i XIAP. Derfor kan vi målrette MTDH at øge følsomhed over for ikke blot kemoterapi, men også targeted midler, der virker gennem programmeret celledød. Disse data giver overbevisende dokumentation for, at ved at nedregulere MTDH i endometriecancer, kan vi forstørre de proapoptotiske veje og respons på behandlingen.

Materialer og metoder

Etik Statement

Normalt endometrie væv og endometrie væv fra livmoderkræft blev indsamlet med samtykke fra patienter under University of Iowa Institutional Review Boards godkendt protokol. Vi opnåede informeret skriftligt samtykke fra alle deltagere, der er involveret i denne undersøgelse.

cellelinjer og Cell Culture

Humane endometriecancer cellelinjer Hec50co, RL95, AN3CA, ECC1, Ishikawa H, og KLE blev opretholdt som tidligere beskrevet [33]. Celler blev dyrket i DMEM medium indeholdende 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin (alle fra Gibco BRL, Carlsbad, CA) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 og 95% luft. For at generere en MTDH knockdown model blev Hec50co celler transficeret med MTDH sh RNA eller kontrol-ikke-silencing shRNA konstruktioner ifølge producentens instruktioner (ORIGENE, Rockville, MD). Individuelle celle kloner resistente over for puromycin blev udvidet og udsat for screening for MTDH ekspression ved Western blotting.

Endometriale væv og væv Arrays

Normale endometrie væv og endometrie væv fra livmoderkræft blev indsamlet fra universitetet af Iowa Hospitaler og Klinikker. Endometrie sygdomsspektrum (endometriecancer progression) vævsarray (UT 801) blev indkøbt fra US Biomax, Inc. (Rockville, MD).

Reagenser, antistoffer og Western blotting

Human rekombinant TRAIL (TNF-relateret apoptoseinducerende ligand) blev indkøbt fra R og anti-spaltet caspase-3, caspase-8, DR4, DR5, Bim, Bid, FLIP, XIAP, p21, PARP-1 p-AKT S473, p-AKT T308, PDK1, p-PDK1 S204, histon 3, s -histone 3 serine10 og histon 3 lysin 9 acetyleringsniveauer antistoffer var fra Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA). Helcelle-proteinlysater blev fremstillet og analyseret ved Western blotting som tidligere beskrevet [34].

Expression Array og RT-qPCR Analyse

Totalt RNA blev isoleret fra MTDH knockdown og styre endometriecancer celle linjer (i biologiske tre eksemplarer til kontrol og MTDH knockdown celler) ved hjælp af

mir

Vana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX), og cDNA blev genereret ved hjælp af High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Et humant gen-array 1.0 ST (Affymetrix, Santa Clara, CA) blev forhørt under anvendelse af de biologiske triplikater i DNA Core Facility på University of Iowa, og Partek Genomics Suite (Partek Inc, St. Louis, MO) software blev anvendt til at generere genekspression værdier. Alle data er MIAME kompatibel og de rå data er blevet deponeret i en MIAME klage database GEO, som detaljer på hjemmesiden https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/query/acc.cgi?acc= GSE26134. Tiltrædelsesprocessen nummer for Hec50co celler er GSE26134 og for Ishikawa H celler er GSE27828. Adskillige MTDH nedstrøms gener blev tilfældigt valgt til at validere microarray data ved hjælp TaqMan-primere og prober (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) for kvantitativ RT-PCR-analyse.