PLoS ONE: MIR-130 A og MIR-374a Funktion som nye regulatorer af cisplatin Modstand i human kræft i æggestokkene A2780 Cells

Abstrakt

kemoresistens fortsat en stor hindring for en effektiv behandling af patienter med kræft i æggestokkene, og for nylig stigende beviser tyder på, at miRNA er involveret i narkotika-resistens. I denne undersøgelse undersøgte vi rolle miRNA i regulering cisplatin resistens i ovariecancer cellelinje og analyseret deres mulige mekanismer. Vi profilerede miRNA differentielt udtrykte i cisplatin-resistente humane æggestokkræft cellelinje A2780 /DDP sammenlignet med forældrekontrol A2780 celler ved hjælp microarray. Fire unormalt udtrykte miRNA blev udvalgt (miR-146a, -130a, -374a og miR-182) for yderligere undersøgelser. Deres udtryk blev verificeret ved QRT-PCR. MiRNA efterligner eller inhibitor blev transficeret ind A2780 og A2780 /DDP-celler og derefter lægemiddelfølsomhed blev analyseret ved MTS array. RT-PCR og Western blot blev udført for at undersøge ændringen af ​​MDR1, PTEN genekspression. Der blev fundet i alt 32 miRNA, der skal udtrykkes forskelligt i A2780 /DDP-celler. Blandt disse blev MIR-146a nedreguleret og MIR-130a, -374a, -182 blev opreguleret i A2780 /DDP-celler, som blev verificeret ved RT-PCR. MIR-130 A og miR-374a efterligner faldt følsomheden af ​​A2780 celler til cisplatin, omvendt, kunne deres hæmmere resensitize A2780 /DDP celler. Endvidere kunne overekspression af miR-130a øge MDR1 mRNA og P-gp niveauer i A2780 og A2780 /DDP celler, mens knockdown af miR-130a kunne hæmme MDR1 genekspression og opregulere den PTEN proteinekspression .I en konklusion, dereguleringen af miR-374a og miR-130a kan være involveret i udviklingen og reguleringen af ​​cisplatin modstand i æggestokkene cancerceller. Denne rolle MIR-130a kan opnås ved regulering af MDR1 og PTEN genekspression

Henvisning:. Li N, Yang L, Wang H, Yi T, Jia X, Chen C, et al. (2015) MIR-130a og MIR-374a Funktion som Novel Regulators af cisplatin Modstand i human kræft i æggestokkene A2780 Cells. PLoS ONE 10 (6): e0128886. doi: 10,1371 /journal.pone.0128886

Academic Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, KINA

Modtaget: Februar 15, 2015; Accepteret: Maj 2, 2015; Udgivet: 4 jun 2015

Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af to fonde. Den ene er den lokale Foundation (No.2012SZ0022) fra Videnskab og Teknologi Institut i provinsen Sichuan (https://www.scst.gov.cn/info/), hvis bidragyder er WHJ deltager i undersøgelsen design og beslutning om at offentliggøre i denne studere. Den anden er Programmet til Changjiang Scholars og Innovative Research Team i University (NO.IRT0935, https://www.moe.gov.cn/), hvis finansieringskilder ikke havde nogen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den hyppigste dødsårsag i gynækologiske maligniteter [1]. Mere end 70% af patienter med kræft i æggestokkene har avancerede stadie (FIGO stadie III eller IV) sygdom på diagnosetidspunktet [2]. Cisplatin er den vigtigste behandlingsmetode til fremskreden ovariecancer imidlertid lægemiddelresistens minimerer effektiviteten af ​​cisplatin-basen kemoterapi i et stort antal patienter [3]. Flere faktorer og mekanismer, der bidrager til cisplatin modstand er blevet rapporteret, herunder øget stof efflux, abnormity af target narkotika, forbedring af DNA-reparation og ændring af apoptoseveje [4-7] .Nonetheless de underliggende mekanismer kemoresistens stadig dårligt forstået og effektive midler til at forbedre modstanden er indtil i fravær.

for nylig undersøgelser rapporteret, at microRNA (miRNA) var involveret i kemoresistens. MiRNA repræsenterer en klasse af små ikke-kodende RNA-molekyler, og kan binde til 3′-utranslaterede region (3′-UTR) af mål-mRNA’er, hvilket resulterer i RNA-nedbrydning og /eller translationelle undertrykkelse [8]. Således miRNA deltage bredt i reguleringen af ​​forskellige biologiske processer, såsom fosterudvikling, celledeling, differentiering, migration og apoptose [8,9]. Et stigende antal undersøgelser tyder på, at afvigende miRNA udtryk har været forbundet med alle aspekter af tumor biologi, herunder resistens over for forskellige kemoterapeutiske stoffer [10-12] .Ved eksempel blev miR-21 overudtrykt i kolorektal cancer væv, der var mindre følsomme over for 5 -FU [13], og inhibering af mIR-21-ekspression var i stand til at sensibilisere cellerne til 5-FU [14]. Desuden havde vores tidligere undersøgelse [15] fandt, at MIR-130a blev opreguleret i SKOV3 /DDP sammenlignet med SKOV3, og MIR-130a inhibering kan tilsidesætte den cisplatin modstand ved at regulere MDR1 /P-gp-vejen. rolle miRNA prensents celle specificitet, så udtryk for miR-130a eller andre miRNA og deres roller i andre æggestokkene cancer cellelinjer er imidlertid behov for yderligere undersøgelse.

I den aktuelle undersøgelse, screenet vi miRNA udtryk profil af A2780 og A2780 /DDP-celler, og udvalgt nogle af de differentielt udtrykte miRNA i A2780 /DDP til yderligere undersøgelse. Så kontrollerer vi udtryk for udvalgte miRNA ved QRT-PCR, og undersøgt deres rolle i at modulere cisplatin-modstand, som kan tilbyde nye kandidat mål for genterapi i cisplatin-resistente æggestokkræft.

Materialer og metoder

Cellekultur

Den humane ovariecancer-cellelinje A2780 og dens cisplatin-resistente sublinie A2780 /DDP blev dyrket i DMEM-medium (Gibco, USA) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco , USA), i en fugtig inkubator med 5% CO

2 ved 37 ° C. A2780 /DPP blev skiftevis fodret med medium indeholdende 9 mg /ml cisplatin for at opretholde narkotika modstand og yderligere dyrket i stoffri medium i en uge før opfølgende eksperimenter. Begge cellelinier blev opnået og bevaret i Gynækologisk onkologi af Biotherapy Laboratory, West China Second Universitetshospital, Sichuan University, Chengdu, Kina.

miRNA microarray analyse

Total RNA blev ekstraheret fra A2780 og A2780 /DDP-celler under anvendelse af Trizol (Invitrogen, USA) og miRNeasy mini kit (QIAGEN, Danmark) ifølge producentens instruktioner. Kvaliteten og mængden blev målt ved spektrofotometer (Beckman Coulter, DU730, USA) og RNA integritet blev verificeret ved gelelektroforese. RNA (1 ug) blev mærket med Hy3 fluorescerende hjælp af miRCURY Power mærkning kit (Exiqon, Vedbæk, Danmark) og derefter hybridiseret på miRCURYLNA Array (v.18.0 Exiqon) indeholdende 1887 humane miRNA indfangningsprober kommenteret i miRBase 18,0. Efter hybridisering blev det fluorescerende signal billeder erhvervet ved anvendelse af en GenePix 4000B scanner (Axon Instruments, Union City, CA, USA) og blev analyseret med GenePix Pro 6,0 soft-ware (Axon Instruments), hvori den mediane normalisering blev opnået. To-fold eller større ændring blev sat som en tærskel på signifikant forskel.

Bioinformatik

Potentielle mål for differentielt udtrykte miRNA blev forudsagt ved hjælp af PicTar eller Targetscan 5.2 software.

Real-time QRT-PCR

Vi kontrolleret ekspression af seleted miRNA i A2780 og A2780 /DDP celler ved QRT-PCR. Totalt RNA af hver cellelinie blev ekstraheret og vurderet som ovenfor nævnt. MiRNA og U6 cDNA blev dannet ved anvendelse miRNA specifik hårnåle-RT-primere ifølge AMV First Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, USA) protokol. Alle primere blev designet og syntetiseret af Guangzhou RiboBio (RiboBio, Kina). Real-time QRT-PCR blev udført i et 20 pi reaktionsvolumen på ABI Stepone plus instrument (USA). Relativ miRNA udtryk blev evalueret ved hjælp af 2

-ΔΔCt metode og normaliseret til ekspressionen af ​​U6 lille RNA. Alle QRT-PCR’er blev udført i tre eksemplarer.

Cell transfektion

miRNA mimic, hæmmer og negativ kontrol er designet og kemisk syntetiseret af Guangzhou RiboBio (RiboBio, Kina). 24h før transfektion blev celler udsået i plader med 96 brønde med 5000 celler /brønd og dyrket i medium uden antibiotika. Efter cellebinding blev transfektion udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) og Opti-Mem reduceret serum media (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. Mediet blev udskiftet 4-6 timer efter transfektion med ny frisk medium. Cellerne blev fremstillet til yderligere analyse 48h efter transfektion. Effektiviteten af ​​denne liposommedieret transfektion system blev dectected med hjælp af Cy3-siRNA. Cy3-siRNA er en slags 21-25nt lille RNA-molekyle, svarende til miRNA inhibitor eller efterligner, og kan excitere fluorescens ved en bølgelængde på 555 nm. De vigtigste trin er som følger: celler blev podet i plader med 24 brønde med 10.000 celler /brønd, og transficeret med Cy3-siRNA under anvendelse af lipofectamin 2000 og Opti-MEM-medium. 24 timer efter transfektion blev celler observeret under fluorescensmikroskop. Transfektionseffektiviteten blev præsenteret som forholdet mellem celler observeret under fluorescens til celler observeret under nomal ligtht. Alle forsøg blev gentaget tre gange.

Cellelevedygtighed matrix

Efter transfektion blev celler i plader med 96 brønde udsat for forskellige koncentrationer af cisplatin. Celleproliferation blev bestemt ved en kolorimetrisk assay under anvendelse af CellTiter 96 Aqueous One Solution celleproliferationsassay kit (Promega, Madison, WI, USA). Efter 48 timer af behandlingen blev 20 ul One Solution Reagent tilsat til hver brønd og inkuberet i 3 timer ved 37 ° C. Absorbansen ved 490 nm bølgelængde blev målt under anvendelse mikropladelæser (model 680, Bio-Rad, USA). Hvert forsøg blev udført med replikater af seks brønde og gentaget tre gange.

Semi-kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA fra ubehandlede celler eller transficerede celler blev isoleret ved anvendelse af Trizol Reagent. RT-PCR blev udført ved anvendelse af PrimeScript RT reagenskittet og Multiplex PCR Assay Kit ifølge producentens instruktioner (TaKaRa Biotechnology, Dalian, Kina). PCR-produkter blev identificeret ved hjælp af elektroforese med 1,5% agarosegeler og registreret under anvendelse af Gel billeddannende system (Bio-Rad, CA, USA). GAPDH-RNA blev serveret som input kontrol.

Western blot assay

Cellerne blev vasket med 1 × PBS og lyseret med RIPA buffer. Proteinkoncentrationen blev målt under anvendelse af BCA-metoden. Dernæst blev 20 ug af proteinet anvendt til påvisning af P-gp og PTEN-protein, og GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol. monoklonalt muse-anti-Pgp (fortyndet 1: 1000; Calbiochem, San Diego, CA, USA), anti-PTEN (fortyndet 1: 1000; Santa Cruz, CA, USA) og anti-GAPDH (fortyndet 1: 50000; Kangchen, Shanghai , Kina) blev anvendt som primære antistoffer. Det sekundære antistof blev konjugeret med peberrodsperoxidase. De bundne antistoffer blev påvist ved anvendelse af ECL kit. Den Mængde One-software blev anvendt til at kvantificere protein båndintensiteter.

Statistisk analyse

Dataene er præsenteret som middelværdi ± SD. Forskellen mellem middel blev analyseret ved anvendelse af Students t-test. Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af SPSS 13.0 software (Chicago, IL, USA). P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Differential udtrykte miRNA i A2780 /DDP sammenlignet med dets forældres celle A2780

miRNA udtryk profil æggestokkene cancercellelinie A2780s og A2780 /DDP blev påvist under anvendelse miRNA array i denne undersøgelse. Som vist i tabel 1, 32 miRNA (24 opreguleres, 8 nedreguleres) sig at være differentielt udtrykt i A2780 /DDP-celler i forhold til sine parentale celler. Den potentielt mål gen af ​​disse miRNA blev forudsagt og anført i tabel 1.

Real-time QRT-PCR for 4 differentielt udtrykte miRNA

Blandt 32 differentielt udtrykte miRNA, valgte vi 4 miRNA, til videreforarbejdning undersøgelse. Resultaterne af QRT-PCR viste, at A2780 /DDP-celler, ekspression af MIR-374a, 130a, -182 blev forøget med henholdsvis 2,06, 4,87, 1,28 folder og MIR-146a faldt med 133,56 gange sammenlignet med A2780s celler (

s

0,05), hvilket var i overensstemmelse med microarray. (Figur 1)

Niveauet af miR-146a i A2780 /DDP var ekstremt lav, kun tegner sig for 0,75 procent af det i A2780s (**

s

0,05). Udtrykket af miR-130a, -374a og miR-182 var 4,8, 2,08 og 1,28 folder højere end i A2780 celler (**

s

0,05, *

s

0,05) .Disse resultater viste konsekvente udtryk ændringer detekteret af microarray.

miR-130a og miR-374a efterligner eller inhibitorer regulere cisplatin følsomhed i A2780 og A2780 /DDP

i dette studie, brugte vi liposomet at mægle transfektion af miRNA-analoger. Så først opdaget vi transfektionseffektiviteten. A2780 og A2780 /DDP-celler blev observeret under fluorescensmikroskop efter 24 timers Cy3-siRNA transfektion. vi beregnet, at A2780s og A2780 /DDP celler med rød fluorescens henholdsvis tegnede sig for 85% og 93%, hvilket indictated at Liposome transfektion systemet kunne nå en høj effektivitet

Tre miRNA (miR-374a,. – 130 A, -182) efterligner og mIR-146a-inhibitor blev transficeret ind A2780 celler, for at se, om de transficerede celler erhverver resistens over for cisplatin. Resultaterne viste, at A2780 celler transficeret med MIR-374a og MIR-130a efterligner havde en signifikant højere overlevelse end kontrolgruppen under behandlingen af ​​0,8, 3,2 ug /ml cispaltin, men samme fænomen blev ikke observeret for MIR-182 efterligner og mIR-146a inhibitor. (P 0,05, figur 2A).

(A) De A2780 celler efter transfektion med MIR-130a-efterligning og MIR-374a-mimic viste et forøget forhold af overlevende celler under behandlingen af ​​0,8, 3,2 ug /ml cispaltin (*

s

0,05). (B) MIR-130a-inhibitor og MIR-374a-inhibitor faldt forholdet mellem overlevende celler under behandlingen af ​​8, 32 ug /ml cispaltin (*

s Restaurant 0,05).

Vi yderligere transficeret med miR-374a og miR-130 A-hæmmere i A2780 /DDP celler at undersøge, om de delvist kan vende cisplatin modstand. Som vist i fig 2B, MIR-374a og MIR-130a inhibitor væsentligt forbedret cytotoksiciteten af ​​cisplatin behandling sammenlignet med kontrollen (p 0,05).

MIR-130a regulerer ekspressionen af ​​MDR1 og PTEN i A2780s og A2780 /DDP celler

Vi undersøgte udtryk for MDR1, PTEN mRNA og protein i A2780 og A2780 /DDP celler ved RT-PCT og western blot. Som vist i figur 3, MDR1-mRNA og P-gp niveau i A2780 /DDP-celler var 2,33 og 1,88 gange højere end den for i A2780-celler (P 0,05), mens ekspressionen af ​​PTEN-protein var yderst lavt i både celle linier og ekspressionen af ​​PTEN-mRNA og protein udviste ingen signifikant forskel mellem dem (P 0,05).

(A) MDR1 og PTEN-mRNA-niveauer i A2780 og A2780 /DDP-celler. Ekspressionen af ​​MDR1-mRNA blev overudtrykt i A2780 /DDP forhold til A2780 (P 0,05), og PTEN mRNA-niveauet viste ingen forskel (P 0,05). (B) P-gp og PTEN protein udtryk niveauer i A2780s og A2780 /DDP celler. Ekspressionen af ​​P-gp i A2780 /DDP-celler var højere end for A2780 (P 0,05), og PTEN-protein var på et meget lavt niveau i A2780 og A2780 /DDP-celler. (1,2: A2780, A2780 /DDP)

For at undersøge, om miR-130a kunne regulere PTEN og MDR1 udtryk, de tilsvarende efterligner og hæmmere af de to miRNA blev transficeret ind A2780 og A2780 /DDP-celler. PTEN, MDR1 mRNA og deres proteinekspression blev bestemt ved 48 timer efter transfektion. Som vist i figur 4, MIR-130a inhibering forøgede PTEN proteinniveauer og svækkede expressio af MDR1-mRNA og P-gp (P 0,05), hvorimod MIR-130a overekspression resulterede i opregulering af MDR1-mRNA og P-gp-ekspression i A2780 og A2780 /DDP-celler (P 0,05) .Den udtryk for PTEN mRNA ændrede sig ikke med behandlingen af ​​miR-130a-hæmmer og efterligner i begge cellelinier (P 0,05).

(A1 , A2): PTEN og MDR1-mRNA i A2780 celler efter transfektion. MDR1-mRNA-niveau blev opreguleret af MIR-130a efterligner og nedreguleres af MIR-130a-inhibitor (P 0,01). (B1, B2): P-gp og PTEN protein i A2780 celler efter transfektion. Ekspressionen af ​​PTEN-protein blev signifikant forhøjet Når celler blev behandlet med MIR-130a-I, ekspressionen af ​​P-gp blev opreguleret af MIR-130-M og nedreguleres af MIR-130a-I. (C1, C2): PTEN og MDR1-mRNA i A2780 /DDP-celler efter transfektion. Den regulerende virkning af MIR-130a på A2780 /DDP-celler var lig den for A2780 celler. (D1, D2): P-gp og PTEN protein i A2780 /DDP celler efter transfektion. Virkningen af ​​MIR-130a var svarende til den i A2780s celler. (1,2,3: miR-130-M, miR-130a-I og miR-NC; * p 0,05, ** p 0,01)

Sammenfattende fandt vi 32 miRNA udtrykkes forskelligt i A2780 /DDP-celler i forhold til sine parentale celler ved miRNA array. Blandt dem, en nedreguleret miRNA (miR-146a) og tre opreguleret miRNA (miR-130a, -374a, -182) blev udvalgt til yderligere undersøgelse, og deres udtryk blev valideret i overensstemmelse med miRNA array ved hjælp af QRT-PCR. I transfektion eksperiment blev overekspression af MIR-130a og MIR-374a fundet at formindske følsomheden af ​​A2780 og A2780 /DDP-celler til cisplatin og nedregulering af MIR-130a og MIR-374a ekspression udøvede den modsatte virkning. Resultaterne af RT-PCR og western blot viste, at MIR-130a positivt kunne regulere mRNA og protein ekspression af MDR1 og negativt regulere PTEN protein, hvilket kan være en af ​​mekanismerne i MIR-130a rolle i kemoresistens.

diskussion

Selvom platinbaseret kemoterapi i høj grad har forbedret prognosen for kræft i æggestokkene, lægemiddel-resistens stadig som den vigtigste hindring for en vellykket behandling [3]. For nylig blev der rapporteret miRNA, der skal udtrykkes forskelligt i lægemiddelresistente cancersygdomme og kunne regulere lægemiddelresistens [16,17].

I den foreliggende undersøgelse, vi fandt, at 32 miRNA differentielt blev udtrykt i A2780 /DDP sammenlignet med A2780. Interessant, har nogle af disse miRNA blevet bekræftet at være involveret i kemoresistens. For eksempel MIR-27a var opreguleret i A2780 /Taxol-celler og knockdown af MIR-27a forøgede paclitaxel følsomhed [18]. Takiuchi [19] rapporterede, at MIR-181 nedsatte følsomhed pancreascancer celle til gemcitabin gennem aktivering NF-KB ved CYLD inhibering. Vores tidligere undersøgelse viste også, miR-130a var relateret til cisplatin-resistens i SKOV3 celler. Dataene i microarray afslørede, at ekspressionen af ​​MIR-146a i A2780 /DDP var ekstremt lav, og MIR-130a, -374a, -182 blev opreguleret. Desuden miR-130a rolle i cisplatin modstand A2780 celler, og om miR-146a, -374a, kunne -182 regulere resistens endnu ikke rapporteret, så vi vælger disse fire miRNA til yderligere undersøgelse. Disse fire miRNA udtryk blev verificeret ved QRT-PCR, noget tyder på, at microarray havde en høj nøjagtighed.

I transfektionsforsøg, fandt vi ændring af miR-130a og miR-374a udtryk kunne ændre graden af ​​cisplatin modstand i A2780 og A2780 /DDP. Adskillige undersøgelser har vist, at miR-130a fungerede som kemoterapi regulator. Opregulering af MIR-130a kan påvirke doxorubicin resistens i brystcancer [20], og MIR-130a inducerede modstand for leverkræft celle til cisplatin ved nedregulering af tumorsuppressorgen RUNX3 [21]. I vores tidligere undersøgelse [15], miR-130a blev overudtrykt i SKOV

3 /DDP celler, og hæmning af miR-130a kunne delvist genoprette cisplatin følsomhed, hvilket var consistant med ovennævnte undersøgelse.

I øjeblikket et par undersøgelser fokuserede på den rolle, miR-374a i tumor, som påpegede, at miR-374a blev overudtrykt i osteosarkom [22] og tyktarmskræft [23]. Desuden blev MIR-374a involveret i tumorgenese og metastase af brystcancer ved at regulere Wnt /catenin pathway [24]. Indtil videre er der ingen rapporter om den rolle, miR-374a i resistens. Her fandt vi, at miR-374a blev opreguleret i cisplatin-resistente celler, og faldende sit udtryk kunne gøre cellerne mere følsomme over for cisplatin, mens opregulering til udtryk i A2780s haft den modsatte effekt.

Derfor har vi overvejet at overekspression af miR-130a og miR-374a kan bidrage til udvikling og regulering af cisplatin modstand i æggestokkene cancerceller. Inhibering af ekspressionen af ​​miR-130a og miR-374a kan være en ny tilgang til at overvinde resistens i kræft i æggestokkene. Som et resultat, vi også udført RT-PCR og western blot for at finde den mekanisme af MIR-130a regulerende virkning på medikamentresistens.

Vores undersøgelse viste ekspressionen af ​​MDR1-mRNA og dens proteinprodukt P-glycoprotein (P -gp) niveauer i A2780 /DDP var signifikant højere end den i A2780s, hvilket antyder, at overekspression af MDR1-genet kan være en af ​​mekanisme af resistens over for lægemidler dannelse i A2780 /DDP-celler. P-gp er en ATP-afhængig membran pumpe, der transporterer lægemidlet ud af celler, hvilket resulterer i multiresistens [25]. Masser af beviser viste, at miRNA var forbundet med P-gp-medieret resistens lægemiddel i mange kræftformer. For eksempel MIR-451 overvandt doxorubicin resistens ved at nedregulere P-gp-ekspression i doxorubicin-resistente brystkræft cellelinier MCF-7 /ADR [26]. Inhibering af MIR-27a forøgede paclitaxel følsomhed i A2780 /Taxol ved modulering MDR1 /P-glycoprotein-ekspression [18]. Vi konkluderede, at inhibering af ekspression af MIR-130a resulterede i nedregulering af MDR1-mRNA og P-gp. Dette resultat er i overensstemmelse med vores tidligere eksperimenter.

Vi fandt også, MIR-130a reguleres negativt ekspressionen af ​​PTEN-protein. PTEN protein er en dobbelt specificitet phosphatase, der kan blokere cytokin-medieret signaltransduktion, derefter inhibere celleproliferation, invasion og metastase og fremme apoptose [27]. I en række forskellige maligne tumorer, herunder colorectal cancer, brystcancer, leukæmi, ovariecancer osv, PTEN gen og protein har forskellige grader af deletion eller nedregulering [27,28]. Det er blevet rapporteret, at PTEN-protein kunne bidrage til lægemiddelfølsomhed ved at undertrykke PI3K /Akt pathway, og tjene som målgen af ​​mange miRNA, såsom MIR-21, MIR-22 og MIR-222 [29,30]. I dette eksperiment ekspressionen af ​​PTEN-protein i A2780s og A2780 /DDP-celler var ekstremt lav og havde ingen signifikant forskel mellem disse to cellelinier. Vi udledte, at restaurering af PTEN ekspression kan være en af ​​mekanismerne i kemosensitivitet stigning i ovariecancerceller. Men A2780 og A2780 /DDP-celler transficeret med MIR-130a-inhibitor ikke udøver højere celleaktivitet inhibering sammenlignet med kontrolgrupperne under behandlingen af ​​lavdosis cisplatin (0.2ug /ml og 2 ug /ml), beregnede vi årsagen til dette fænomen er, at PTEN-medieret celle apoptose delvist afhængige af cellebeskadigelse af cisplatin og de har en synergistisk virkning. Kun en lille mængde celler forarbejdet til apoptose eller død i denne lave dosis af cisplatin, og cellevækstinhiberingen medieret af PTEN havde ikke nok evne til at gøre en betydelig forskel mellem forsøgs- og kontrolgrupper. Interessant Vi fandt, at MIR-130a ikke regulere PTEN-mRNA-ekspression ligeledes PTEN protein, hvilket antyder, at MIR-130a kan regulere PTEN gentransskription ved posttranslationel niveau ved ufuldstændig binder til 3′-utranslaterede region (3′-UTR ) i PTEN mRNA.

PicTar andTargetScan software forudsiger, at de potentielle målgener af miR-374a omfatter Akt3, ABI1, PDCD6, ABCC5 og så videre. Blandt dem, der ABI1 vist sig at være forbundet med hæmning af cellevækst og proliferation [31], hvilket kan være en af ​​reguleringsmekanismer af miR-374a på cisplatin modstand, men det er fortsat at blive yderligere bekræftet af expriments.

for nylig, Xiang et al. [32] rapporterede, at miR-152 og miR-185 signifikant blev nedreguleret i SKOV3 /DDP og A2780 /DDP celler, sammenlignet med deres følsomme forældre linje SKOV3 og A2780, og opregulering af ekspression af mIR-152 eller mIR-185 forøgede cisplatin følsomhed SKOV3 /DDP og A2780 /DDP-celler ved at undertrykke DNA methyltransferase 1 (DNMT1) direkte. Inkonsekvent, miR-152 og miR-185 (nedsat med 0,4 og 0,6 gange i A2780 /DDP celler sammenlignet med A2780 celler i Xiang undersøgelse) viste sig at være op- eller nedreguleret i mindre end to gange i A2780 /DDP celler sammenlignet med A2780 celler, så disse miRNA blev ikke opført som miRNA af interesse. Men vi bør være opmærksomme på, at miRNA array er en indledende screeningstest, hvis resultater har brug for yderligere validering såsom ved QRT-PCR, og mindre end to gange differentielt udtrykte miRNA kan også have indvirkning på resistens af kræft i æggestokkene.

som konklusion, denne undersøgelse viser, at differentielt udtrykte miRNA i cisplatin-resistente ovariecancerceller sandsynligvis spille en vigtig rolle i udviklingen eller regulering af cisplatin modstand. Desuden transfektion med MIR-130a og MIR-374a inhibitorer forøgede cytotoksiske virkning af cisplatin. Rolle MIR-130a i lægemiddelresistens blev i det mindste delvis opnås ved at regulere ekspression af P-gp og PTEN-protein. PTEN kan være et target-gen af ​​miR-130a, men den har brug for validering af dobbelte luciferase rapporter. Disse resultater tyder på, at miR-130a og miR-374a kunne være lovende som nye terapeutiske mål for at overvinde resistens.

Tak

Denne undersøgelse blev støttet af Program for Changjiang Scholars og Innovative Research Team (PCSIRT) i University (IRT0935), og den lokale Foundation for Videnskab og Teknologi Institut for Chengdu (nr 11DXYB133SF-027).