PLoS ONE: Rekonstituering af TGFBR2-medieret signalering Årsager opregulering af GDF-15 i HCT116 Kolorektal Cancer Cells

Abstrakt

Selvom inaktivere rammeforskydningsmutationer i

transformerende vækstfaktor beta receptor type 2 Hotel (

TGFBR2

) gen betragtes som førere af mikrosatellit ustabil (MSI) kolorektal tumorigenese, er følgeskader ændringer af nedstrøms target proteomanalyse ikke løst helt. Anvendelse af en klik-det kemi protein tilgang mærkning kombineret med massespektrometri i en MSI kolorektal cancer model cellelinje, vi identificeret 21

de novo

syntetiserede proteiner udtrykkes forskelligt på rekonstitueret TGFBR2 udtryk. En kandidat-gen, TGF-ß familiemedlem vækstdifferentieringsfaktor-15 (GDF-15), udviste TGFBR2-afhængig transkriptionel opregulering forårsager forøget intracellulær og ekstracellulære proteinniveauer. Som en ny TGFBR2 target gen kan det give en forbindelse mellem TGF-ß gren og BMP /GDF gren af ​​SMAD-medieret signalering

Henvisning:. Lee J, Fricke F, Warnken U, Schnölzer M, Kopitz J, Gebert J (2015) Rekonstituering af TGFBR2-medieret signalering Årsager opregulering af GDF-15 i HCT116 Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 10 (6): e0131506. doi: 10,1371 /journal.pone.0131506

Redaktør: Lu-Zhe Sun, University of Texas Health Science Center, UNITED STATES

Modtaget: Februar 25, 2015; Accepteret: 3 juni 2015; Udgivet: 26 Jun 2015

Copyright: © 2015 Lee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. den finansielle støtte blev leveret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (GE592 /6-2) til JK og JG. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer (CRC) kan opstå ved tre større veje, kendetegnet ved kromosomal ustabilitet [1], CpG island hyper-methylering fænotype [2] og mismatch repair (MMR) -deficiency [3, 4]. Tumorer, der har mistet normal MMR funktion vise et højt niveau af mikrosatellit instabilitet (MSI) normalt anerkendt som indsættelse /deletionsmutationer med korte mononukleotid gentagelser (mikrosatellitter) placeret i kodning og ikke-kodende gen regioner. Mere end 90% af MSI tarmkræft har erhvervet somatiske indsættelse /deletionsmutationer i kodningen mononukleotidbyggeblokken gentagelse (A10) i exon 3 i

transformerende vækstfaktor beta receptor type 2 Hotel (

TGFBR2

) gen fører til translationelle rammeforskydninger og forringet receptor signalering [5, 6]. Den TGFBR2 proteinet er en serin-threonin-kinase, som ved binding af dens ligand TGF-SS1, bibringer kanoniske SMAD-medieret signalering [7]. TGF-ß signalering spiller en central rolle i den normale funktion af kolonepitelceller men dens rolle i tumorigenese synes at være kontroversiel [8, 9]: i de tidlige stadier af tumorudvikling, TGF-ß fungerer som en klassisk tumor suppressor [10] , mens det fremmer EMT, migration og metastase på senere stadier af tumor progression [11]. Disse tilsyneladende paradoksale biologiske funktioner bestemmes af en lang række mål proteiner, hvis ekspression reguleres i en TGF-ß-afhængig måde [12].

De fleste af disse

bona fide

nedstrøms mål for TGF-ß signalering er blevet identificeret af screeninger på transkriptionsniveauet mens undersøgelser, der fokuserer på TGF-ß-afhængige proteom ændringer i kolorektale tumorceller er temmelig begrænsede og proteom udtryk profiler kan ikke altid udledes transkriptom mønstre. Selvom TGF-ß signalvejen allerede er blevet karakteriseret omfattende, dens indvirkning på protein udtryk dynamik, der bidrager til den biokemiske /proteomisk fænotype af kolon kræftceller endnu ikke er fuldt udforsket.

Da tumorceller i almindelighed og MSI tumorceller i særdeleshed har erhvervet en begrænset del af førerens mutationer, der bidrager til tumorudvikling blandt et stort antal irrelevante passager mutationer, afgrænsning af komplekse proteom ændringer med specifikke driver mutationer er en stor udfordring. For at forstå, hvordan fejl i et enkelt medlem af TGF-ß-signalvejen, den TGFBR2, ændrer den cellulære proteom og glycomic landskabet i MSI kolorektal kræftceller, vi tidligere etableret en MSI cellelinie model system, der gør det muligt for doxycyclin (Dox) – reguleret rekonstituering af TGFBR2 udtryk og signaltransduktion i en isogen baggrund [13].

Brug denne HCT116-TGFBR2 model cellelinie i kombination med et klik kemi tilgang til specifik isolering af

de novo

proteomanalyse [14] og efterfølgende massespektrometri (MS) analyse, identificerede vi et begrænset antal proteiner, der viste sig at være nyligt udtrykt eller hvis syntese blev afskaffet på TGFBR2 udtryk. En af disse kandidat mål, vækst- og differentieringsfaktor-15 (GDF-15) viste en TGFBR2-afhængig transkriptionel opregulering der korreleret med forøgede niveauer af intracellulære og udskilte protein. Disse data antyder, at GDF-15 er et TGF-ß-responsive gen.

Materialer og metoder Salg

Cellekultur

Cellelinjer blev dyrket i RPMI 1640 medium (Life Technologies , Karlsruhe, Tyskland) suppleret med 10% FBS (Life Technologies, Karlsruhe, Tyskland), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Life Technologies, Karlsruhe, Tyskland) under anvendelse af standardbetingelser. Genereringen af ​​doxycyclin-inducerbar HCT116-TGFBR2 cellekloner blev rapporteret tidligere [13]. Kort fortalt vildtype

TGFBR2

genet blev integreret i kolorektal cancer HCT116, der huser biallele inaktiverende

TGFBR2

læserammeforskydningsmutationer, ved hjælp af rekombinase-medieret kassette udveksling (RMCE), hvilket resulterer i to uafhængige celle kloner, # 5 og # 22, med forskellige enkelt kopi integration websted.

Metabolic mærkning

For metaboliske eksperimenter mærkning, 4×10

6-celler blev podet i tre eksemplarer på 10 cm plader. Næste dag blev mediet udskiftet, og cellerne blev enten dyrket i fravær eller nærvær af 0,5 ug /ml doxycyclin (Sigma, Taufkirchen Tyskland). Efter 11 timer blev cellerne vasket med PBS (Life Technologies, Karlsruhe, Tyskland), dyrket i 30 minutter i methionin-frit RPMI 1640-medium (Sigma, Taufkirchen Tyskland) og efterfølgende inkuberet med 10 ng /ml TGF-SS1 (Cell Signaling, Danvers, USA) og mærkningsreagenset (40 uM L-Azidohomoalanine (AHA) eller 4,625 MBq [

35S] -L-methionin) i nærvær eller fravær af Dox i 4 timer (proteinlysat) eller 24 timer (udskilte proteiner ). Som en kontrol for at identificere kun AHA-mærkede nysyntetiserede proteiner blev celler dyrket i tre eksemplarer i fravær af AHA og i nærvær af 200 ug /ml cycloheximid (CHX), en inhibitor af protein-biosyntese. Til analyse af virkningen af ​​GDF-15 på pSmad2 signalering, 100 ng /ml humant rekombinant GDF-15 (G3046, Sigma, Taufkirchen, Tyskland) blev tilsat til cellerne i 1 time. Celler blev vasket 3 gange med PBS, høstes og centrifugeres i mindst 10 min ved 1000 g ved 4 ° C i PBS indeholdende 1x protease inhibitor cocktail (Roche, Mannheim, Tyskland). Cellepellets blev direkte resuspenderet i lysisbuffer. Medium af de radioaktive-mærkede celler blev opsamlet efter 24 timer, centrifugeret ved 1000 g ved 4 ° C i mindst 10 min, og supernatanten blev underkastet GDF-15 immunfældning.

Click-iT Reaction

efter metabolisk AHA mærkning (C10102; Life Technologies, Karlsruhe, Tyskland) blev cellepellets lyseret med 100 pi 1% SDS i 50 mM Tris-HCI, pH 8, suppleret med protease inhibitor cocktail, sonikeret i 30 sekunder og inkuberet mindst 30 minutter ved 4 ° C under rotation som beskrevet tidligere [14]. Efter centrifugering ved 4 ° C i 30 minutter ved 12.000 g, blev proteinkoncentrationen bestemt ved Bradford assay (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munchen, Tyskland). 200 ug protein blev anvendt til at reagere med 40 pM Biotin Alkyn i DMSO (B10185; Life Technologies, Karlsruhe, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Efter methanol /chloroform (4: 1) udfældning blev præcipitaterne resolubiliseres i 200 pi RIPA buffer, sonikeret i 30 sekunder og roteret natten over ved 4 ° C. At fjerne unsolubilized materiale blev proteinet prøven centrifugeret ved 4 ° C i 20 minutter ved 12.000 g. Supernatanten blev derefter inkuberet på en rotator med 80 pi opslæmning af streptavidin-belagte magnetiske perler (Dynabeads MyOne Streptavidin T1, Life Technologies, Karlsruhe, Tyskland), der var blevet vasket 3 x med PBST (PBS /0,01% Tween 20). Efter 2 timer ved 4 ° C blev perlerne vasket 3 x med 1 ml PBST indeholdende 2% SDS efterfulgt af endelige vaske med PBS og 40 mM ammoniumbicarbonat.

massespektrometrisk analyse

I massespektrometri blev prøver fremstillet og analyseret som tidligere [14] beskrevne. Kort fortalt blev protein-loaded perler reduceret, alkyleret og trypsinysed ved 37 ° C natten over. Efter tilsætning af TFA prøven blev analyseret ved nanoLC ESI-MS /MS på LTQ Orbitrap XL massespektrometer (Thermo Scientific, Karlsruhe, Tyskland). MGF-filer genereret af Xcalibur software (Thermo Scientific, Karlsruhe, Tyskland) blev anvendt til databasesøgninger med MASCOT søgemaskine (Matrix Science, version 2.4) mod SwissProt database (SwissProt udgave 2013_02 (539165 sekvenser, 191456931 rester)) med taksonomi indstillet til menneske. Kandidat- proteiner blev klassificeret som differentielt udtrykt (TGFBR2-deficiente eller-dygtige) hvis de opdages i mindst en af ​​tre biologiske replikater i hver af de to cellekloner (# 5 og # 22), men ikke i parentale HCT116-Tet-On celler.

Kvantitativ Real Time (QRT) -PCR

1 ug totalt RNA blev isoleret under anvendelse af RNeasy Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) og revers transkriberet med oligo-dT-primere og SuperScript II revers transkriptase ifølge fabrikantens protokol (Life Technologies, Karlsruhe, Tyskland). Real-time PCR-analyse blev udført ved anvendelse PowerSYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland) og specifikke primere til TGFBR2 (for: 5′-CGGCTCCCTAAACACTACCAA-3′, rev: 5′-AACAAATTGGACTAATCCGGA-3′) og GDF-15 (for: 5′-AAGATTCGAACACCGACCTC-3′, 5′-AGAGATACGCAGGTGCAGGT-3′). Triplikater af forskellige cDNA prøver (- /+ Dox) blev analyseret i StepOnePlus termo-cykliseringsapparat (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland) under anvendelse af følgende program: 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Data blev analyseret ved StepOne Software V2.1 (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland). Genekspression blev normaliseret til udtryk af henvisningen genet

Hydroxymethylbilane syntase Hotel (

HMBS

) (for: 5′-CACCACAGGGGACAAGATTC-3′, rev: 5 ‘-GTGAACAACCAGGTCCACTTC-3’).

Western blot-analyse

RIPA proteinlysater og Western blot-analyse blev udført som tidligere beskrevet [13]. For immunoblotting blev 30-60 ug protein anvendes. Primære antistoffer blev anvendt som følger: muse-anti-TGFBR2 (sc-17799, Santa Cruz, Dallas, USA; 1: 500, 4 ° C, natten over); muse anti-ß-Actin (klon 4, MP Biomedicals, Solon, USA; 1: 20.000, RT, 30 min); kanin-anti-GDF-15 (HPA011191, Sigma, Taufkirchen Tyskland; 1: 500, 4 ° C, natten over); kanin-anti-phospho-Smad2 og kanin-anti-Smad2 (Ser465 /467) og (86F7); Cellesignalering, Danvers, USA; 1: 1000, 4 ° C, natten over). Blots blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med sekundære antistoffer: fåre-anti-muse-IgG HRP (1: 5000; GE-Healthcare, München) eller gede-anti-kanin-IgG HRP (1: 2500; Promega, Madison, USA ). Detektion blev enten udført af standardprocedure hjælp Amersham Hyperfilm ECL eller ChemiDoc MP System (Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Tyskland).

GDF-15 Immunopræcipitering (IP)

Efter [

35S] -L-methionin mærkning (American Radiolabeled Chemicals, Inc., St. Louis, USA), cellepelleten blev resuspenderet i 200 pi RIPA buffer indeholdende 2x proteaseinhibitorcocktail. Proteinlysater blev opnået som beskrevet ovenfor. For GDF-15 immunfældning, 0,3 ml lysat indeholdende 1,8 mg protein eller 5 ml kultursupernatant blev roteret med 1,5 ug GDF-15-antistof (HPA011191, Sigma, Taufkirchen, Tyskland) og 2x proteaseinhibitorcocktail natten over ved 4 ° C. 25 pi protein A /G agarose opslæmning (Oncogene Science, Uniondale, USA) blev vasket 3 gange med RIPA-buffer og derefter inkuberet med lysatet eller kultursupernatanten og antistoffet i 2 timer ved rotation ved 4 ° C. Perlerne vaskedes 5x med 500 pi RIPA buffer og elueret med 2x 200 pi 1x SDS-prøvepuffer (106 mM Tris-HCI, 141 mM Tris Base, 2% SDS, 10% glycerol, 0,51 mM EDTA) ved 99 ° C i 5 min ved 800 rpm. Prøverne blev derefter blandet med 10 ml scintillationscocktail og tælles under anvendelse af en væskescintillationstæller analysator (TRI-CARB 2900TR, Packard, PerkinElmer, Waltham, USA).

proliferationsassav

10

3-celler blev podet i seksdobbelt i 96 brønde en dag før tilsætning af følgende reagenser: 0,5 ug /ml Dox, 10 ng /ml human rekombinant TGF-SS1 og 100 ng /ml humant rekombinant GDF-15. Efter 6 dage blev MTS proliferationsassays udføres med CellTiter 96 Aqueous kit (Promega, Madison, USA) ifølge producentens anvisninger. Spektrofotometriske målinger blev udført under anvendelse af Genios mikropladelæser (Tecan Group Ltd., Männedorf, Schweiz) og absorbansværdien af ​​cellefri medium blev subtraheres fra absorbansen værdierne for prøverne.

Resultater og Diskussion

3.1. Identifikation af

de novo

syntetiseret TGFBR2-afhængige målproteiner

For at sikre TGFBR2-afhængig regulering, vi tidligere genererede en model cellelinje, heri omtalt som HCT116-TGFBR2 [13]. Kort fortalt HCT116 cellelinien muteret for begge alleler for

TGFBR2

fører til fravær af fuld-længde proteinet. De to etablerede HCT116-TGFBR2 cellelinier (klon # 5 og # 22), indeholder imidlertid en enkelt kopi integreret vildtype

TGFBR2

gen, som udtrykkes kun i tilstedeværelse af doxycyclin (Dox). Time-kursus analyse viste, at 11-12h Dox behandling af disse celler var tilstrækkelige til at nå peak niveauer af TGFBR2 protein (S1 Fig).

For at bestemme TGFBR2-afhængige

de novo

proteom, både HCT116-TGFBR2 kloner (# 5 og # 22) blev udsat for ligand TGF-SS1 i nærvær (TGFBR2-dygtige) eller fravær (TGFBR2-deficient) af doxycyclin og nascente proteiner metabolisk mærkede med methionin surrogat L- Azidohomoalanine (AHA). Efter click-det-medieret biotinylering blev mærkede proteiner indfanget af streptavidin-coatede magnetiske perler og analyseret ved massespektrometri. For at tage højde for proteiner, der viser uspecifik binding til perlerne eller proteiner, der findes

a priori

på de kommercielt tilgængelige streptavidinovertrukne perler, det samme forsøg blev udført i fravær af reagenset mærkning (-AHA) [14]. Mindst 480

de novo

blev påvist syntetiserede proteiner i gennemsnit i både celle kloner (S1 Table) og under begge betingelser (-Dox: TGFBR2-mangelfuld; + Dox: TGFBR2-dygtige) efter stimulering med TGF-SS1 und dermed forblev upåvirket af TGFBR2 ekspression status (tabel 1). Endvidere blev celler dyrket i tilstedeværelsen af ​​oversættelsen inhibitor cycloheximid (CHX) for at identificere bona fide

de novo

syntetiserede proteiner (markeret med en asterisk i S1 tabel). Op til 56 proteiner blev også identificeret i kontrolceller dyrket i fravær af AHA, cirka 10 gange mindre end antallet af proteiner identificeret i nærvær af AHA etiketten, hvilket bekræfter specificiteten af ​​denne bioorthogonal tilgang mærkning. Sammenlignende analyse af TGFBR2-afhængige

de novo

proteom afslørede 21 kandidater, der viste sig at være forskelligt udtrykt enten i TGFBR2-utilstrækkelige eller TGFBR2-dygtige celler, men i mindst én af tre udtages og i hvert af både cellekloner. Protein forekomst i begge cellekloner blev anvendt som den stærkeste udvælgelseskriterium grund af nogle variationer i protein forekomst blandt tredobbelte prøver. Især 12/21 proteiner udelukkende forekom i TGFBR2-deficent celler, hvorimod de resterende proteiner (9/21) blev påvist udelukkende i TGFBR2-dygtige celler, der udviser rekonstituerede TGF-ß-signalering (tabel 2). Ifølge GO sigt klassificering, differentielt udtrykte proteiner forbundet med væsentlige cellulære processer som immunitet (1B59), signaltransduktion (ASM, CSN3, DOCK8, GDF-15, TGFBR2), protein modifikation (CHIP, PP2AA), transskription (DTD2, RBM42, T2FA, TE2IP, TFAM, UBF1) og protein transport (ERP29, RB6I2, HGS, TMEM9). Kun få af disse proteiner har angiveligt været knyttet til TGF-ß /SMAD signalvejen (ASM, CHIP, HGS, PP2AA, SYNE2, GDF-15), men direkte regulering af deres udtryk af TGFBR2 receptoren i colon cancerceller har ikke blevet påvist. Da den eksperimentelle strategi forfølges i den foreliggende undersøgelse fokuserede på identifikation af nyligt syntetiserede proteiner, vores kandidatliste over differentielt udtrykte proteiner sandsynligvis repræsenterer potentiel ny

bona fide

mål for TGFBR2-medieret signalering i MSI HCT116 kolorektal kræftceller .

Det er klart, nogle velkendte downstream mål for kanonisk TGF-ß /SMAD signalering ligesom SMAD7 [15], SERPINE [16] eller JunB [17] der mangler fra vores liste over differentielt udtrykt kandidat-proteiner. Flere årsager kan forklare denne begrænsning: Først blev vores kriterier for kandidat proteiner udvælgelse baseret på forskellen udtryk i mindst én prøve i hver af de to celle kloner, som måske ikke tegner sig for variationer i proteinekspression mellem disse to cellelinje kloner. F.eks JunB og CSK1 [18], en anden vækst undertrykker og TGF-ß målgen i epitelceller, blev ikke rekrutteret til vores liste over differentielt udtrykte kandidat-proteiner, fordi de blev kun detekteret i én klon af TGFBR2-dygtige og TGFBR2-deficient celler. For det andet blev vores eksperimentelle strategi for at afdække kun

de novo

syntetiserede proteiner med klar begrænsning til udtrykket status TGFBR2 signal transducer og kvantitative ændringer i protein niveauer upon TGFBR2 rekonstituering og dermed kan forklare, hvorfor nogle kandidater har måske undslap detektion. Alternativt kan manglende påvisning skyldes forskelle i inkorporeringseffektivitet af methionin og dens analoge AHA og /eller også kan afhænge af antallet af methioninrester, der faktisk findes i hvert protein. Tredje, TGF-SS1 ligand eksponering var begrænset til en kort tidsramme på 4 timer, som måske ikke tilstrækkelig til at inducere påviselige niveauer af nogle nyligt syntetiserede TGF-SS1 målproteiner [19]. Endelig, som en advarsel, vi kan ikke udelukke, at nogle af de kandidater, der er identificeret i denne undersøgelse faktisk ikke repræsenterer

de novo

syntetiserede proteiner blot på grund af deres tilknytning til

bona fide

TGFBR2 målrette proteiner via protein-protein interaktioner. Vigtigst er dog, at vi entydigt identificeret TGFBR2 protein selv i begge kloner af vores TGFBR2-rekonstituerede model cellelinie, som støtter kraftigt gyldigheden af ​​vores eksperimentelle tilgang.

3.2. TGFBR2-afhængig ekspression af GDF-15

Blandt

de novo Salg syntetiserede proteiner specifikt induceret i TGFBR2-rekonstituerede celler, identificerede vi væksten og differentieringen faktor 15 (GDF-15). Svarende til TGF-ß selv, kan GDF-15 udviser afvigende funktioner i cancerceller [20]. For eksempel kan den fungere som en tumorsuppressor og udløse apoptose ved overekspression i HCT116-celler [21], men det er også fundet i forøget mængde i senfase cancere tyder på anvendelighed som en markør for tumorudvikling [22]. For at analysere TGFBR2-responsive gener i flere detaljer, fokuserede vi på GDF-15 som en potentiel kandidat-gen, fordi det er stadig uvist, om medlemmer af TGF-ß-familien af ​​cytokiner kan reguleres på en TGFBR2-afhængig måde i kolorektal cancer celler.

Som et første skridt, vi undersøgte reguleringen af ​​GDF-15-ekspression på udskrift niveau. TGFBR2-dygtige og TGFBR2-deficiente HCT116 celler blev udsat for TGF-SS1 for to forskellige tidsperioder (2 timer og 4 timer) og GDF-15-mRNA-ekspression blev bestemt ved real-time PCR-analyse (Fig 1A). Stimulering med TGF-SS1 i 2 timer forårsagede en omtrent fordobling af GDF-15 transkriptniveauer i begge HCT116-TGFBR2 kloner ved sammenligning TGFBR2-dygtige versus TGFBR2-manglende celler. Denne induktion faktor faldt en smule til omkring 1,5 gange, når ligand eksponeringstid blev udvidet (4 timer). Forældrekontrol HCT116-Tet-On kontrol celler viste ikke Dox-afhængige ændringer af GDF-15 udtryk, som udelukker eventuelle uspecifikke effekter knyttet doxycyclin. Bortset fra TGF-SS1-afhængige udtryk ændringer, vi også observeret en forskel på GDF-15 udtryk blandt både HCT116-TGFBR2 kloner. Især gange forøgelse af GDF-15 transkriptniveauer var altid mindre i klon 22 sammenlignet med klone 5. Mest sandsynligt, kan dette skyldes, at de forskellige integrationssteder i

TGBFR2

transgen i disse kloner [13 ].

(A) opreguleres transkriptniveauer af GDF-15 i nærvær af Dox hjælp af real-time QRT-PCR-analyse. (B) Western blot-analyse af GDF-15-protein-ekspression i samlede proteinlysater (30 ug) af TGF-SS1 stimulerede celler (4 h). Ekspression af GDF-15 forøges, når TGFBR2 udtrykkes (+ Dox) i begge cellekloner, men ikke i den parentale Tet-On cellelinie. TGF-SS1 signalering er angivet ved forhøjede pSmad2 niveauer i TGFBR2-udtrykkende kloner. Tilsætning af cycloheximid (CHX) reducerer ekspressionsniveauet af GDF-15. ß-Actin og Smad2 tjente som en loading kontrol.

Ud over disse transkriptionelle ændringer, undersøgte vi, om GDF-15-proteinniveauer også moduleres af TGFBR2 ekspression status i vores model system. Totale cellelysater blev fremstillet ud fra Dox-behandlede og ubehandlede HCT116-TGFBR2 kloner og HCT116-Tet-On kontrol celler efter TGF-SS1 eksponering (4 timer), og undersøgt ved Western blot analyse (figur 1B). Efter aftale med de transkriptionelle data, rekonstituering af ligand-udløst TGFBR2 signalering forårsagede en stigning af GDF-15 protein niveauer i både celle kloner mens ß-actin niveauer forblev upåvirket. HCT116-Tet-On kontrol celler viste ikke Dox-afhængige ændringer i GDF-15-ekspression. Endvidere tilsætning af cycloheximid (+ CHX) faldt ekspressionen af ​​GDF-15 betydeligt i TGFBR2-udtrykkende celle klon # 5 i modsætning til ß-actin eller Smad2 proteiner, som forblev CHX resistente. Disse resultater underbygger den

de novo

syntese af GDF-15 og stærkt støtte vores proteomics resultater (tabel 2). Øget pSmad2 niveauer ved rekonstituering af TGFBR2 (+ Dox) bekræfter, at denne model system er i stand til at fremkalde en ordentlig Smad signalering.

For at validere de observerede ændringer i GDF-15 protein-ekspression i en mere præcis og kvantitativ måde udførte vi en metabolisk mærkning eksperiment med [

35S] -L-methionin. Proteiner blev radioaktivt mærket under de samme betingelser som i AHA mærkning eksperiment men mærket GDF-15-protein blev derefter immunpræcipiteret og talt under anvendelse af en væskescintillationstæller analysator (figur 2). Et ca. 2,5-3 ganges forøgelse af intracellulær GDF-15-protein-niveauet blev observeret i begge kloner af Dox-behandlede HCT116-TGFBR2 celler efter TGF-ß stimulation sammenlignet med det basale ekspressionsniveau af de samme celler dyrket i fravær af Dox ( fig 2A). Siden GDF-15 kan handle på en parakrin eller autokrin måde, vi analyserede også mængden af ​​[

35S] -L-methionin mærket udskilt GDF-15 protein ved GDF-15 immunpræcipitering fra dyrkningsmediet (Fig 2B). Rekonstitueret TGFBR2-medieret signalering i både celle kloner førte til en betydelig forøgelse af udskilt GDF-15 protein svarende til stigningen af ​​intracellulære niveauer. Den parentale Tet-On-cellelinien viste ingen ændringer i nysyntetiserede GDF-15-ekspression hverken i proteinlysater eller i celledyrkningsmediet (data ikke vist). Som konklusion antyder disse data at TGFBR2-afhængig forøget ekspression af GDF-15 synes at transporteres til dets virkningssted i det ekstracellulære miljø.

[

35S] -L-methionin blev anvendt til metabolisk mærkning og efterfølgende immunfældning af intracellulær GDF-15 fra de samlede lysater (A) eller secerneres GDF-15 fra celledyrkningsmediet (B). Celler blev stimuleret med TGF-SS1 i 4 timer i (A) og 24 timer i (B) på

GDF-15 er kendt for at eksistere i forskellige former [23]:. Propeptidet er spaltes af en protease for at generere det modne bioaktive protein. Det modne GDF-15-protein er kendt for at blive secerneret men det er også blevet rapporteret for propeptidet [24]. Antistoffet anvendes i vores immunopræcipitationsforsøg kan genkende propeptidet, men ikke binder til den modne form. Derfor vil vi gerne understrege, at vores resultater gælder for propeptidet version af GDF-15, som stadig kan være bundet til den modne form eller også kan spaltes og uafhængigt anerkendt. For at præcisere, om den modne form påvirkes i et lignende omfang andre antistoffer skal testes.

For at teste for virkninger af GDF-15 på cellevækst og signalering udførte vi en proliferationsassay og pSmad2 Western blot-analyse under anvendelse af humant rekombinant GDF-15-protein (figur 3). TGF-SS1 eller GDF-15 tilsætning alene faldt proliferationshastigheden imidlertid vækstinhiberende virkning blev mere fremtrædende, når begge cytokiner blev tilsat samtidigt ved sammenligning TGFBR2 udtrykkende (+ Dox) til TGFBR2-manglende (-Dox) celler i HCT116- TGFBR2 # 5 (fig 3A). Proliferation af den parentale Tet-On cellelinje blev ikke ændret på alle ved stimulering med nogen af ​​cytokin og – /+ Dox i alle kombinationer (data ikke vist). Endvidere undersøgte vi virkningen af ​​exogen tilsætning af GDF-15 på Smad signalering. Rekombinant GDF-15 alene var i stand til at stimulere pSmad2 ekspression i TGFBR2 udtrykkende celler (+ Dox), men ikke i TGFBR2-deficiente celler (-Dox) (Fig 3B). I mangel af rekombinant GDF-15 og TGF-SS1 ligand blev opdaget nogen pSmad2, mens stimulation med TGF-SS1 alene viste en in stigning i pSmad2 niveau TGFBR2-dygtige celler. TGF-SS1 og GDF-15 tilsætning viste den stærkeste stigning af phosphorylerede Smad2 niveauer, som er i overensstemmelse med den observerede reducerede proliferationshastighed når begge ligander blev tilsat samtidigt (fig 3A). Det er, så vidt vi ved, den første rapport, der viser fosforylering af Smad2 af GDF-15 i en TGFBR2-afhængig måde i humane kolorektale cancerceller. I forbindelse med cancer og sygdomsprogression hvor TGFBR2 er ikke-funktionel, kan faldet af GDF-15-ekspression medføre en vækstfordel i forhold til vildtypen, TGFBR2-udtrykkende celler, der simulerer snarere ikke-kræft fænotype. I Western blot analyse er det også vist, at TGF-SS1 alene øger niveauet af pSmad2 ekspression i fravær af TGFBR2 sammenlignet med den ustimulerede celler (Fig 3B). Denne basale niveau af pSmad2 blev observeret i forældrenes HCT116-Tet-On og TGFBR2-udtrykkende celle-klon og er i overensstemmelse med vores tidligere offentliggjorte arbejde [13]. Der er én rapport om potentiel regulering af GDF-15 mRNA med TGF-SS1 [25]. Hidtil har dette kun været observeret i makrofager, og der er ingen beviser endnu om TGFBR2-afhængig regulering af GDF-15-ekspression i andre væv eller sygdomme som tyktarmskræft. Men andre undersøgelser give nogle eksperimentelt bevis for den modsatte situation, dvs. at GDF-15 påvirker TGF-ß signalering. For eksempel undersøgelser i mus tyder på, at GDF-15 kan virke som en potentiel ligand for TGFBR2 [26]. Desuden GDF-15 synes at modulere TGFBR2 phosphorylering eller signalering som det er blevet påvist i rotte cerebellar granula-neuroner [27]. Disse observationer ikke nødvendigvis modsiger vores resultater, men snarere kan indikere en potentiel feedback GDF-15 på TGFBR2-medieret signalering.

(A) Proliferation assay vises som et gennemsnit af seks gentagelser. (B) Western blot-analyse af TGFBR2-afhængige pSmad2 niveauer. HCT116-TGFBR2 # 5-celler blev behandlet i fravær og tilstedeværelse af human rekombinant TGF-SS1 (10 ng /ml) og GDF-15 i 1 time. Smad2 tjente som en intern belastning kontrol.

Siden GDF-15 har både pro- og anti-tumor aktiviteter, afhængigt af den cellulære og microenvironmental sammenhæng resultatet af TGFBR2-afhængige GDF-15 overekspression og øget sekretion er vanskeligt at forudsige. En nylig undersøgelse viste, at cirkulerende GDF-15 er forbundet med en højere risiko for CRC, og at ikke-steroide anti-inflammatoriske lægemidler (NSAID’er) kan nedsætte risikoen [28]. Kontroversielt, er der publikationer, der viser, at disse NSAID inducerer ekspressionen af ​​GDF-15, som derefter fører til apoptose i HCT116 celler [21, 29], hvilket er i overensstemmelse med observationerne vi gjort i denne undersøgelse: TGFBR2 rekonstituering repræsenterer snarere vildtype situationen i som GDF-15 udtrykkes ved højere niveauer, mens mindre GDF-15 i tumoren tilstand (TGFBR2 mangel) udtrykkes og udskilles, og tumorcellerne kan undslippe apoptose.

med hensyn til type II-receptorer, der transducerer de signaler fremkaldt af superfamilien af ​​TGF-ß /knoglemorfogenetisk protein (BMP) /activin ligander, proteomics data afledt af TGF-SS1 stimuleret og TGFBR2-rekonstituerede celler i den foreliggende undersøgelse muliggøre en direkte sammenligning med proteomics data opnået i vores tidligere arbejde på activin A-stimulerede og ACVR2-rekonstituerede celler. Sammenlignet med den

de novo

proteomanalyse af HCT116-ACVR2 celler [14], er der ingen overlap med differentielt udtrykte sæt af kandidatgener identificeret i HCT116-TGFBR2 celler. Selv om begge receptorer er medlemmer af den samme familie af type II signaltransducere og sende deres signaler gennem fælles SMAD mediator proteiner i den kanoniske pathway, kan den observerede mangel på overlapning delvis skyldes binding til forskellige ligander.

Samlet set bruger en velkarakteriseret model system, der tillader inducerbar ekspression af en vigtig drivkraft for kolon tumorigenese i en isogen baggrund, identificerede vi et sæt

de novo

syntetiserede kandidat proteiner, hvis forskellen udtryk synes at være reguleret i en TGFBR2-afhængig måde. Blandt disse kandidater vi identificeret TGF-ß-superfamilien medlem GDF-15 som en potentiel hidtil ukendt skive, hvis mRNA, intracellulære og udskilte protein niveauer blev opreguleret efter TGFBR2 rekonstituering. Dette TGFBR2-GDF15 link kan være en del af en regulerende løkke, der også indebærer en tidligere beskrevet GDF-15-TGFBR2 link [27].