PLoS ONE: en systematisk analyse på DNA-methylering og udtryk for både mRNA og mikroRNA i Blære Cancer

Abstrakt

Baggrund

DNA methylering aberration og microRNA (miRNA) deregulering er observeret i mange typer af kræft. En systematisk undersøgelse af methylome og transkriptom i blære urothelial karcinom er aldrig blevet rapporteret.

Metode /vigtigste resultater

DNA methylering blev profileret af modificeret methylering-specifik digital karyotypebestemmelse (MMSDK) og udtrykket af mRNA’er og miRNA blev analyseret ved digital genekspression (DGE) sekventering i tumorer og matches normale tilstødende væv opnået fra 9 blære urotelial carcinoma patienter. Vi fandt, at et sæt væsentligt beriget veje afbrudt i blæren urothelial karcinom primært relateret til “neurogenese” og “celledifferentiering” af integreret analyse af genomenbaserede data. Endvidere har vi identificeret en spændende samling af cancerrelaterede gener, der blev dereguleret på de niveauer af DNA-methylering og mRNA-ekspression, og vi validerede flere af disse gener (HIC1, SLIT2, RASAL1, og KRT17) ved bisulfit Sequencing PCR og Reverse Transcription qPCR i et panel af 33 blære kræft prøver.

konklusioner /betydning

Vi karakteriseret profilerne mellem methylome og transkriptom i blære urothelial karcinom, identificeret en række væsentligt beriget centrale veje, og screenet fire afvigende methylerede og udtrykte gener. Sammenfattende vores resultater kaste lys over en ny vej for grundlæggende blærekræft forskning

Henvisning:. Zhu J, Jiang Z, Gao F, Hu X, Zhou L, Chen J, et al. (2011) en systematisk analyse på DNA-methylering og udtryk for både mRNA og mikroRNA i blærekræft. PLoS ONE 6 (11): e28223. doi: 10,1371 /journal.pone.0028223

Redaktør: Amr H. Sawalha, University of Oklahoma og Oklahoma Medical Research Foundation, USA

Modtaget: Juli 5, 2011; Accepteret: November 3, 2011; Udgivet: November 30, 2011

Copyright: © 2011 Zhu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National High Technology Research and Development Program Kina (863 Program, 2009AA022707 til XZ), fremme Program for Shenzhen Key Laboratory, Shenzhen, Kina (CXB200903090055A og CXB201005250016A til ZC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

som genetiske og epigenetiske abnormiteter er blevet observeret i udviklingen af ​​kræftceller [1], er det blevet teoretiseret, at de begge spiller en vigtig rolle i onkogenese, overtalelse ændringer i gen-aktivitet og kromosom struktur [2]. Grundforskning til afsløre mekanismer carcinogenese er ekstremt vigtigt for diagnose, behandling og prognose af kræft i klinikken. Aberration af DNA-methylering i cancer kan forekomme som global hypometylering eller locus-specifik hypermethylering i CpG island-rige promotorer [3]. DNA hypometylering i en cancercelle menes at føre til kromosom ustabilitet og onkogen aktivering [4]. Omvendt er aberrerende promotor methylering eller hypermethylering af CpG-øer-associerede gener stærkt forbundet med transkriptionel inaktivering af disse [5] generne. Ud over DNA methylering kan deregulerede miRNA i kræft påvirker ekspressionen af ​​gener og veje, der er involveret i kræft patogenese hele vejen fra start til metastaser. Nogle miRNA tjener som formodede tumor undertrykkere og andre fungerer som onkogener [6].

Blærekræft er en af ​​de mest almindelige kræftformer i verden. I 2008 blev en anslået 386,300 nye tilfælde diagnosticeres, og 150,200 mennesker døde af blærekræft [7]. Urotelial carcinom i blæren, den mest udbredte histologiske type af blærecancer, udgør mere end 90% af de maligne tilfælde af blærecancer [8]. DNA hypometylering er et almindeligt fænomen i blærekræft [9], [10]. I mellemtiden har forholdet mellem DNA-methylering og blærecancer primært blevet undersøgt med hensyn til promotoren hypermethylering af tumorsuppressorgener. Upassende silencing af disse gener ved promotor hypermethylering bidrager til cancer initiering, progression, invasion og metastase [11], [12], [13]. En række studier har undersøgt både små og store paneler af DNA methylering begivenheder i blærekræft ved brug array-baserede teknologier [9], [10], [14]. Men for at genom-dækkende detektion undersøgelser opnå høj opløsning methylering data i blærekræft er sjældne. De tumor-suppressor og onkogene funktioner miRNA er blevet observeret i blærekræft samt [15], [16], [17]. Adskillige miRNA profileringer ved microarrays i blærekræft er også blevet gennemført, men ingen sammenhængende konklusion kunne altid trukket fra deres resultater [18], [19], [20].

Baseret på ovennævnte observationer, vi hypotese at en systematisk analyse af profiler af DNA-methylering og udtryk både mRNA og mikroRNA i blærekræft ville bidrage til at identificere de vigtigste ændringer af blærekræft. Således har vi gennemført en genom-dækkende methylering analyse matchede tumor og normale tilstødende væv fra 9 blære urotelial carcinoma patienter, der anvender modificerede methylering-specifik digital karyotypebestemmelse (MMSDK), kombineret med mRNA og miRNA udtryk data (kombineret med resultaterne af vores tidligere undersøgelser af mRNA [21] og miRNA [22] for blærekræft), som blev opnået fra tag sekventering ved hjælp af anden generation sekventering teknologi.

Resultater

En oversigt over methylome og transkriptom i blære urothelial karcinom

for DNA methylering, et gennemsnit på 4,445,972 og 4,525,269 unikt kortlagte tags, der var 17 og 18 nt i længde blev opnået fra 9 forskellige blære urothelial carcinomer og deres matchede normale tilstødende væv, henholdsvis. For genekspression, DGE bibliotekerne genereret 3,307,536 og 3,136,370 høj kvalitet tags for tumor og normalt væv, hhv. I ikke-kodende lille RNA (sRNA’er) sekventering, læser blev opnået i alt 14.787.388 og 12.754.928 høj kvalitet for tumor og normale væv, henholdsvis. I alt blev 16,236 gener og 543 miRNA detekteres udtrykt i mindst en af ​​tumoren eller normale tilstødende vævsprøver.

For at få et overblik over de forskelle i DNA methyleringsmønstre med hensyn til genekspressionsprofilerne i blæren urothelial carcinomer og deres matchede normale tilstødende væv blev log2-transformerede, gennemsnit-fold ændringer mellem tumor og normalt væv for de tre typer af tags plottet for hele genomet (figur 1A). Ved en tærskel på | log2Ratio | ≥1, vi observerede nogle forskelle i mærkerne, der repræsenterer status methylering på bestemte

MluI

genomiske loci og mRNA ekspressionsniveauet mellem kræft væv og normale kontroller, desuden en global op -forordning af miRNA i blærekræft blev observeret.

A. Genom DNA-methylering, mRNA og miRNA profiler fra blærekræft væv og matchede normale tilstødende væv. De log2-transformerede gennemsnitlige fold ændringer (tumor /normal) for status for methylering (rød), mRNA-ekspression niveau (grøn), og miRNA ekspressionsniveauet (blå) fra alle patienter blev trukket over hele genomet. Y-aksen repræsenterer log2 ratio, og de stiplede linjer repræsenterer tærsklen signifikans (| log2Ratio | = 1). B. Fordeling af methylering niveauer i forskellige typer af fremkaldende regioner mellem blærekræft væv og matchede normale tilstødende væv. Box-plots for distribution af DNA methylering niveauer baseret på log2-transformerede tag fold ændring (tumor /normal) fra MMSDK tværs af alle patienter blev trukket. Typer omfatter CpG-rige initiativtagere, CpG-fattige initiativtagere, exoner og introns.

For yderligere at undersøge status for methylering ved forskellige genomiske regioner, vi sammenlignede methylering profiler af initiativtagere med eller uden CpG øer ( CGI’er), exoner og introner af blære urothelial carcinoma væv og de matchede normale tilstødende væv. En lignende niveauet for den samlede DNA methylering i de undersøgte genomiske regioner blev fordelt mellem to typer af væv (figur 1B, P 0,05, Wilcoxon rank-sum test).

Identifikation af divergerende loci af DNA methylering og differentielt udtrykt gener

for yderligere at studere status DNA methylering på bestemte genomiske regioner, den genomiske loci, der svarer til

Mlul

sites anerkendelse var forbundet med gener efter deres relative position i det humane genom. blev identificeret, baseret på UCSC Genome Browser op til 9034 individuelle genomiske loci af 5656 unikke gener. Vi identificerede også 299 individuelle loci, der svarer til 274 gener, der viser en signifikant forskellig DNA methylering plan mellem tumorer og kontroller (| log2Ratio | ≥1, FDR P-value≤0.05) (tabel S1). Af den betydeligt forskellige loci, blev 36 loci hypermethyleret og 263 loci blev hypomethylated i tumoren vævsprøver forhold til de matchede normale hosliggende vævsprøver. BSP validering bekræftede 16 tilfældigt udvalgte

MluI

genomiske loci, der blev karakteriseret som havende forskellige methylering niveauer med en gennemsnitlig succesrate på 93,8% (figur 2A).

A. Validation resultaterne af MMSDK med BSP. For at sammenligne de BSP-Sanger sekventering data og dybe sekventering MMSDK data,

MluI

loci, der blev bestemt til at blive differentieret methylerede i gennemsnit med dyb sekventering valideret ved anvendelse BSP. Højden af ​​søjlerne repræsenterer log2-transformerede gennemsnitlige fold ændring (tumor /normal) i methylering plan på tværs af de 9 patienter. B. BSP og RT-qPCR resultater for fire cancer-associerede gener undersøgt hos 33 patienter blærekræft. De methylering niveauer af promotorer af fire udvalgte gener (SLIT2, HIC1, RASRAl1, KRT17) og deres ekspressionsniveau blev evalueret i et panel af 33 prøver. Højden af ​​søjlerne repræsenterer log2 gennemsnitlige fold ændring (tumor /normal) i methylering niveau (blå) eller ekspressionsniveau (rød) på tværs af alle patienter. Søjlerne repræsenterer standardafvigelsen. Antallet af prøver (n), der anvendes i valideringen analysen er angivet ved siden af ​​hver standard fejl bar.

Mellem blærekræft væv og de matchede normale kontroller, blev påvist 2975 kodning gener som differentielt udtrykt herunder 1560 op -regulated gener og 1415 ned-regulerede gener, og 196 miRNA blev differentielt udtrykt herunder 156 opreguleret og 40 ned-regulerede miRNA (| log2Ratio | ≥1, FDR P-value≤0.05) (tabel S2 og tabel S3, en del af mRNA og miRNA data kom fra vores tidligere undersøgelser af mRNA [21] og miRNA [22] for blærekræft). Ifølge målrette forudsigelse, 56 af 196 differentielt udtrykte miRNA blev forudsagt at målrette 285 forskellige mRNA’er (tabel S4). Som vist i tabel 1, flere solut carrier familiemedlemmer (SLC) var konsekvent under-udtrykt i de fleste blære cancertumorer undersøgt, herunder en lettere glucose transporter (SLC2A4), en mitokondrie bærer (SLC25A25), en natrium /calcium varmeveksler ( SLC8A1), en zink transporter (SLC39A14), en kationisk aminosyretransporter (SLC7A2), en stor neutral aminosyre transporter (SLC43A1), og en monocarboxylsyre transporter (SLC16A1). Desuden har vi bemærket, at to natrium-selektiv ikke-spænding-gated epitelial natrium kanal (ENaC) gener (SCNN1B og SCNN1G) er involveret i reguleringen af ​​intracellulære natrium homeostase var signifikant opreguleret i vores undersøgelse [23], [24]. En hepatocytvækstfaktor-receptoren (HGFR), også kendt som MET, var også kraftigt opreguleret i alle de undersøgte i vores undersøgelse samt tumorer. I overensstemmelse med nyligt offentliggjorte undersøgelser, miR-182, mir-183, miR-10a, mir-203, og MIR-224 var alle signifikant opreguleret i tumorer, mens miR-1, miR-143, miR-145 var signifikant nedreguleret i tumorvæv [25]. Desuden blev en typisk nedregulering af MIR-133a, MIR-133b og MIR-125b detekteret i vores undersøgelse også observeret tidligere [26]. Bemærkelsesværdigt, tumor suppressorer MIR-1 og MIR-133a var begge betydeligt under-udtrykt i vores undersøgelse, hvilket resulterer i aktiveringen af ​​den forudsagte målgenet transgelin 2 (TAGLN2), som er blevet identificeret som et potentielt onkogen. Dette resultat er i overensstemmelse med den eksisterende viden om genekspression ændringer i blærekræft [16].

Vi udførte integreret analyse af udvalgte gener mellem DNA methylering og genekspression. I alt blev 4772 gener med begge DNA methylering data og genekspression data identificeret. Som det fremgår af supplerende tabel S5, vi identificeret 82 samtidigt forskelligt methylerede og udtrykte gener ved at opfylde følgende betingelser: | log2Ratio | ≥1, justeret P-value≤0.05, for både DNA methylering og genekspression data. Flere kendte cancerassocierede gener (herunder ADAMTS9, CCND1, HIC1, etc.) udviste konsekvent afbrudt methylering og ekspressionsvektorer status i størstedelen af ​​blæren urothelium cancer prøver.

Gene ontologi (GO) og Kegg pathway berigelse analyse

for at generere yderligere indsigt billede af sti forstyrrelse underliggende blærekræft, vi udførte GO og Kegg pathway analyse på gen-sæt, der indeholder forskelligt methylerede steder, differentielt udtrykte gener identificeret fra mRNA sekventering og målgener af deregulerede miRNA.

Blandt alle generne indeholdende divergerende DNA-methylering loci, GO analyse for “biologiske processer” og “molekylær funktion” viste en signifikant berigelse af 19 og 13 GO vilkår, henholdsvis anvendelse af en FDR P-værdi cutoff på 0,05. De væsentligste beriget GO vilkår i “biologisk proces” var “neuron udvikling”, hvilket tyder på en kritisk rolle for differentieret methylering i neurogenese. Tilsvarende blev kun “Axon vejledning” sti betydeligt beriget (FDR P-værdi: 3.29E-13) via Kegg pathway analyse, hvilket afspejler en konkordans med GO analyseresultat. Dette resultat antyder en vigtig mekanisme af epigenetisk abnormitet i neuron-gener, som spiller en rolle ved blærecancer, cancer-relaterede axonogenesis og neurogenese er blevet observeret i prostatacancer [27]. De resterende berigede GO vilkår fra “molekylære funktion” analyse primært relateret til forskellige transportør aktiviteter (tabel S6).

For differentielt udtrykte gener, 226 GO vilkår i kategorien “biologisk proces”, og 8 GO vilkår i kategorien “molekylær-funktion” blev væsentligt beriget på en FDR tærskelværdi på P-value≤0.05 (tabel S7). Fra “biologiske processer” analyse blev en fremherskende negative regulering gener observeret i de typiske ned-regulerede gener. I mellemtiden har vi også bemærket en betydelig hyppige forekomst af gener involveret i reguleringen af ​​cellecyklus og mitose blandt de up-regulerede gener. De berigede GO form af “molekylær funktionen” blev primært relateret til “protein kinase aktivitet”. Kegg pathway analyse viste også, at flere kendte cancerassocierede veje var signifikant forstyrret (FDR P-value≤0.05), f.eks ECM-receptor-interaktion, cellecyklus, p53 signalering, og Calcium signalvej. Der blev også observeret forskellige metaboliske veje (såsom dem involveret i aminosyre metabolismen), der skal beriges i de liberaliserede gener identificeret af vores undersøgelse (FDR P-value≤0.05).

For målgener i alle dereguleret miRNA, 149 GO indhold blev beriget fra “biologiske processer” analyse under anvendelse af tilsvarende tærskelværdi. Generelt cellulær proces, blev fundet biologiske og metaboliske proces vilkår at blive beriget blandt miRNA-target gener, der blev liberaliseret i vores undersøgelse. Den “molekylære funktion” analyse viste 11 GO vilkår, der blev væsentligt beriget med en FDR tærskel på P-value≤0.05. Den mest markant beriget GO sigt var “protein kinase aktivitet”, hvilket tyder på en rolle i kinase aktivitet regulering. Desuden sti analyse af målene i de liberaliserede miRNA viste også en signifikant forstyrrelse af cellecyklus, axon vejledning og MAPK signalveje (justeret P-value≤0.05) (tabel S8).

For yderligere at granske tilslutning blandt de tre kategorier af omics, blev analyseret yderligere GO form af molekylære funktioner og biologiske processer, samt de Kegg veje, der blev beriget med mere end én kategori. Farten og KO vilkår beriget med mere end én kategori er præsenteret i tabel S9. Så mange som 106 beriget GO vilkår og Kegg veje blev beriget i vores undersøgelse blev hvoraf størstedelen tæt forbundet med kræft. Bemærkelsesværdigt, overlappende væsentligt beriget GO vilkår og Kegg veje blandt tre kategorier af -omik blev gennemført senere, herunder en vigtig neural udvikling sti med navnet “Axon vejledning”. Desuden 7 beriget “biologisk proces” GO vilkår og singlen “molekylære funktion” GO sigt primært relateret til “neurogenese” og “celledifferentiering”, hvilket tyder på en kombineret regulering af nøgleprocesser og funktioner ved differentiel methylering og mRNA og miRNA udtryk regulering.

kræft-relaterede gener betydeligt liberaliseret i blærekræft

Gennem GO sigt berigelse og Kegg pathway analyse af udvalgte differentielt regulerede gener, observerede vi, at visse gener var både differentielt methylerede og udtrykte som var involveret i betydelige forstyrrelse veje, og disse veje var tæt forbundet til forskellige tumorgenese processer. For eksempel blev SLIT2 involveret i Axon vejledning pathway, og CCND1 var involveret i cellecyklus og p53 signalvej. Desuden har vi identificeret en række kanoniske cancer-associerede gener, som ikke blev beriget med de væsentligt forstyrrede veje, såsom ADAMTS9, HIC1, RASAL1, både i methylering statusser og udtryk data (tabel 2).

Som DNA methylering aberration i genpromotorer er rapporteret at påvirke deres ekspressionsniveauerne blev disse methylering sites placeret i promotorområder analyseret i detaljer. Hypermethyleret i kræft 1 (HIC1) og skar homolog 2 (SLIT2) blev identificeret som havende forskelligt opreguleret methylering status for deres promotorregioner og dramatisk nedreguleret udtryk niveau på tværs af alle blære urothelial karcinom vævsprøver. Desuden fandt vi, at RAS protein aktivator gerne 1 (RASAL1) og keratin 17 (KRT17) var klart hypomethylated i promotor-regionen og over-udtrykt i tumorprøver sammenlignet med kontrollerne. Disse fire gener er blevet identificeret som potentielle tumorsuppressorgener eller onkogener i studier af andre typer tumorer [28], [29], [30], [31], men er ikke blevet impliceret i blærekræft.

for yderligere at undersøge methylering og udtryk ændringer af HIC1, SLIT2, RASAL1, og KRT17, massiv bisulfit sekventering PCR og revers transkription qPCR blev udført i matchede par af kræft og normale tilstødende væv fra yderligere ~33 blære urotelial carcinoma patienter (se metoder for detaljer ). Som vist i figur 2B, blev aberration af regional promotor methylering stramt associeret med ændret genekspression i disse fire gener i blærekræft. I de menneskelige blære urotelial karcinom undersøgte prøver, blev forhøjet HIC1 promotor methylering påvist i 100% (30/30) af prøverne og reduceret ekspression blev observeret i 70,0% af de 30 tumorprøver. Hypermethylering af SLIT2 promotoren blev observeret i 58,6% (17/29) tilfælde, og en betydelig reduktion af udtryk blev opdaget med en hastighed på 86,2% (25/29). Den nedsatte methylering frekvens for RASAL1 var 96,7% (29/30), og KRT17 havde en frekvens på 93,9% (31/33). De tilsvarende øget genekspression priser til RASAL1 og KRT17 var 63,3% (19/30) og 78,8% (26/33), hhv. I alt steg HIC1 og SLIT2 promotor methylering og reduceret ekspression blev observeret i 70,0% og 51,7% af tumorprøver, hhv. I mellemtiden blev påvist hypometylering af RASAL1 og KRT17 initiativtagere og nedregulering af deres udtryk med hastigheder på 63,3% og 75,8%, hhv.

Diskussion

MMSDK teknologi giver en effektiv og omkostningseffektiv effektiv metode til at analysere genom-dækkende DNA methylering profiler med en relativ høj følsomhed [32]. Den methylering niveau opdaget af MMSDK korrelerer godt med disse valideringsresultater af bisulfit sekventering PCR i tilfældigt udvalgte

MluI

loci i vores undersøgelse. DGE sekventering er også et nyttigt og følsomt værktøj, der muliggør nøjagtig påvisning af en lang række ekspressionsniveauer af begge mRNA’er og miRNA og dermed giver mulighed for differentiel ekspression analyse af et større udvalg af transkripter [33] [34]. Disse to teknologier både par tag generation via enzym fordøjelse med næste generation dyb sekventering og muliggøre en følsom sammenlignende analyse af DNA-methylering og genekspression.

Generelt en lignende genom-dækkende methylering mønster blev fundet mellem blæren tumorvæv og normalt tilstødende væv. Methylering niveauer på CpG rige og fattige initiativtagere, exoner og introner var også ens mellem tumor og normalt væv, understøtter ovenstående konklusioner vedrørende de tilsvarende globale mønstre for methylering. I gen-niveau, er det velkendt, at inaktivering af tumorsuppressorgener ved stedspecifik hypermethylering bidrager til initiering og progression af humane maligniteter [2], [35]. Hypermethylering af HIC1 og den dermed forbundne fald i HIC1 ekspression er et fælles træk i flere kræftformer, såsom human brystcancer [28], akut myeloid leukæmi [36], og prostatacancer [37]. I blærekræft, har en lignende undersøgelse også blevet gennemført, at kvantitativ methylering-specifik PCR blev udført ved 17 genpromotorer herunder HIC1 i 96 maligne og 30 normale urothelial prøver [38]. fandt, at methylering frekvenser af HIC1 promotor i maligne og normale urothelium var 21,9% og 16,7%, hhv. De viste ikke signifikant forskel mellem ondartet og normalt urotelial væv. Her rapporterede vi hypermethylering af HIC1 og den deraf faldt ekspressionen af ​​HIC1 mRNA i blærekræft. Forskellen mellem vores undersøgelse og Yates DRs undersøgelse kan forklares ved den anden opløsning af teknologier, som vi anvendte høj opløsning dyb sekventering teknologi, mens Yates DRs gruppe anvendt relativt lav-løsning teknologi kvantitativ MSP, eller af forskellige stikprøver strategi, som vi indsamlet præcis matchede prøver af tumorvæv og normale tilstødende væv fra de samme patienter par, mens de fleste af tumorvæv, som Yates DRs gruppe indsamlet ikke har matchet normale væv. HIC1 er en kandidat tumor suppressor placeret på 17p13.3, en region ofte anset for at være hypermethyleret eller slettes i mange typer af fremherskende humane tumorer [39]. Hele HIC1 genregion er omfattet inden en tæt CpG ø, der er normalt umethylerede. HIC1 (hypermethyleret i kræft 1) er blevet påvist at være involveret i et kompleks signalvej der svækker p53-medieret apoptotisk DNA beskadigelse respons i tumorigeneseprocessen [40], [41]. Epigenetisk inaktivering af HIC1 ville inducere deacetylering af p53, forstyrrer dens funktion og resulterer i en reduceret apoptotisk respons på DNA-skade, der fører til onkogenese og fremme tumor progression [35], [41], [42]. Derfor er vores forskning viste, at promotor CpG ø hypermethylering forårsaget HIC1 transskription inaktivering og kan forstyrre den komplekse HIC1-p53 signalvejen i blærekræft.

Slit genfamilien (SLIT1, SLIT2, og SLIT3) er et nyligt karakteriseret familie af udskilte repellanter i axon vejledning og neuronal migration under udviklingen af ​​centralnervesystemet [43], [44]. En række undersøgelser har vist, at SLIT2 epigenetisk er tavse af hypermethylering af promotorregionen i et bredt spektrum af andre tumorer, såsom lunge-, bryst-, gliom, colon og livmoderhalskræft, hvilket fører til inaktivering af SLIT2 ekspression [29], [ ,,,0],45], [46], [47]. Det konditionerede medium fra SLIT2-transficerede celler reducerer cellevækst og inducerer apoptose af kolorektal carcinom-cellelinier, implicerer at SLIT2 har tumor-suppressor aktiviteter [45]. Derudover har flere undersøgelser vist, at SLIT2 hæmmer tumorvækst og metastase ved en mekanisme, der involverer regulering af tumor migration, invasion, apoptose, og væksten i brystkræft, fibrosarkom, og pladecellekræft [48], [49]. Hypermethylering på initiativtagerne til gener (SLIT1, SLIT2, SLIT3, ROBO1, og ROBO3) involveret i Slit-Robo pathway resulterer i nedreguleret genekspression blev også identificeret i invasiv livmoderhalskræft [46]. Dette arbejde er identificeret, at tumorsuppressorgen, SLIT2, som inhiberede tumorvækst og metastase, blev fundet inaktiveret ved promotor hypermethylering i blæren urothelial carcinoma samt.

Tidligere undersøgelser identificerede hypermethyled promotorregioner i nogle almindeligt methylerede gener (RASSF1A , p16, MLH1, MGMT, HoxA9) i forskellige typer af kræft. Vi forsøgte at bekræfte sådanne resultater i blæren urothelial karcinom så godt. Desværre var der ingen

Mlul

enzym fordøjelse steder, der skal findes i initiativtagerne til disse gener, så vi kunne ikke tage behørigt methylering niveauer af initiativtagere i disse almindeligt denatureret gener på grund af teknologiske begrænsninger. , Fandt vi imidlertid, at MLH1 og HoxA9, men ikke de andre af disse almindeligt denatureret gener, var betydeligt under-udtrykt i blærekræft, som var i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [10], [50].

I modsætning til hypermethylering, DNA hypometylering bidrager til tumorigenese ved at aktivere proto-onkogener [5], der bidrager til udviklingen af ​​kræft og progression [51]. Som det blev nævnt i resultaterne af massiv BSP og RT-qPCR tests, RASAL1 methylering niveauer signifikant nedreguleret, og ekspressionsniveauerne blev dramatisk forøget i blæren kræftceller i 66,7% og 53,3%, henholdsvis af patienterne med blærekræft undersøgt. Men modstridende resultater indikerer, at RASAL1 blev stille gennem promoter CpG methylering i flere tumorer [52], og at en reduktion i RASAL1 udtryk kan bidrage til carcinogenese og var forbundet med tumor progression [30], [53] er blevet offentliggjort. RASAL1 er et RAS-GTPase-aktiverende protein, som slukker RAS-aktivitet ved at omdanne GTPase fra dets aktive, GTP-bundne form, til dets inaktive, BNP-bundne form [54]. RAS-genfamilien er kendt som en af ​​de hyppigst aktiverede onkogener i humane cancere [55]. Overraskende RASAL1, RAS-signalet terminator, var meget over-udtrykt og hypometylering af promotoren blev også observeret i de fleste af de undersøgte blærekræft væv i vores forskning. er behov for yderligere undersøgelser af de mekanismer, der ligger til grund for RASAL1 overekspression og epigenetisk aberration i blærekræft.

Keratin 17, også kendt som cytokeratin 17, er involveret i dannelsen og vedligeholdelsen af ​​forskellige hud vedhæng, især ved fastlæggelsen af ​​formen og orienteringen af ​​hår. Ekspressionen af ​​KRT17 har vist sig at være opreguleret i cancervæv i cervikal [56], tunge [57], oral [58], og esophageale pladecellecarcinomer [59]. Forøget ekspression af keratin 17 i endotelceller kan bidrage til angiogenese [60] og kan fremme epitelproliferation og tumorvækst [31]. Keratin 17 er også blevet rapporteret som en potentiel diagnostisk markør for oral pladecellecarcinom [58], og det kan være forbundet med den kliniske progression og differentiering af cervical carcinoma [61], [62]. Der er dog nogle rapporter om epigenetisk regulering og ekspression af keratin 17 i blærekræft. I denne undersøgelse identificerede vi en stigning på KRT17 ekspression i blære kræft væv i forhold til deres normale kolleger. Vi observerede også hypometylering af KRT17 promotoren i blæren urothelial carcinoma. KRT17 kan være en formodet onkogen, der aktiveres gennem hypometylering på promotoren.

Vores undersøgelse fremhæver også vigtigheden af ​​at undersøge de funktionelle roller mRNA og miRNA i tumorigenese af blæren urothelial karcinom. Met-protoonkogen (MET), en hepatocytvækstfaktor-receptoren (HGFR), der er blevet foreslået at spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​forskellige epitel- og nonepithelial tumorer, viste sig at være signifikant overudtrykt i vores undersøgelse af blærecancer, i overensstemmelse med tidligere rapporter om blære kræft [63], hæmatopoietiske maligniteter [64] og nyrecellecarcinomer [65]. MET konstitutivt aktiveres som et proto-onkogen receptortyrosinkinase, som fremmer invasion og migration ved at aktivere en række signaltransduktionsveje i mange typer af carcinomer [66]. Interessant nok nedregulering af MIR-1, som er rettet mod MET, blev observeret i vores undersøgelse, svarende til tidligere undersøgelser i lungekræft og human rhabdomyosarcoma [67], [68]. MIR-1 menes at inhibere celleproliferation og migration ved negativ regulering af c-Met-signalvejen. Derfor karakterisering af onkogener er omfattet af miRNA vil være af stor værdi i at forbedre vores forståelse af de patogene mekanismer bag blærekræft.

Det er almindeligt anerkendt, at forstyrret veje, ikke bare deregulerede individuelle gener, drive tumorigenese proces . I vores søgen efter funktionel relevans af ændrede methylering niveauer og genekspression, fandt vi, at Kegg “axon vejledning” sti var signifikant beriget med differentielt udtrykte gener (mRNA og miRNA), og at der var overlapninger med de veje, der er beriget for relevante gener med forskelligt methyleret loci. Axon vejledning repræsenterer en vigtig fase, hvorunder axoner udvides til deres korrekte mål under dannelsen af ​​neuronale netværk og relaterede molekyler blev anset for at være almindeligt udtrykt og involveret i tumor udvikling, angiogenese og metastase [69]. Vi observerede også sådanne overlapninger for betydeligt beriget GO vilkår, som primært relateret til “neurogenese” og “celledifferentiering” (fx neuron differentiering, neurogenese, positiv regulering af celledifferentiering) mellem tre typer omik data.