PLoS ONE: ADAMTS Expression i kolorektal cancer

Abstrakt

Er ADAMTSs familien af ​​udskilte proteinaser Det er, når andelen Llo protestantiske tur inase DOMAIN med Matrix (MMP’er). Ved at handle på den store panel af ekstracellulære substrater, de kontrollerer flere cellefunktioner såsom Fusion, vedhæftning, proliferation og migration. Gennem deres thrombospondin motiver de også have anti-angiogene egenskaber. Læs ADAMTSs undersøgt, om RTI cipate i kolorektal cancer progression og invasion. Deres rene udtryk undersøgt på Både mRNA og protein niveauer. Brug RT-PCR, udtryk for

ADAMTS-1

,

-4

,

-5

og

ADAMTS-20

ren anslået i kolorektale tumorer Forskellige fase af kræft og anatomiske websted og cellelinier af 3 forskellige aggressivitet. En overekspression af ADAMTS-4 og -5 rene observeret, især i vævsprøver, mens ADAMTS-1 og -20 PROSTITUERET Fundet at producere nedreguleret. Western blot analyse støttes yderligere RT-PCR resultater, afslører desuden nedbrydningen af ​​ADAMTS-1 og -20 i cancer. In situ-ekspression og lokalisering af

ADAMTS-1

,

-4

,

-5

og

-20 ren

også undersøgt af immunhistokemisk analyse. Vores data tyder på en positiv sammenhæng mellem

ADAMTS-4

og

-5

udtryk og kræft progression, i modsætning til de anti-angiogene medlemmer af familien,

ADAMTS-1

og

-20

, hvilket PROSTITUERET Fundet at producere nedreguleret. Vores resultater Støtte Forestillingen om, at overekspression af ADAMTS-4 og ADAMTS-5 i kolorektal cancer kan producere en mulig vil nvasive mekanisme af kræftceller for at nedbryde proteoglycaner af ECM

Henvisning:. Filou S, RPE Tinou A, Kyri er i ulou D, D Bounias, Stavropoulos M, Ra viral zoula P, et al. (2015) ADAMTS Expression i kolorektal cancer. PLoS ONE 10 (3): e0121209. doi: 10,1371 /journal.pone.0121209

Academic Redaktør: Alberto G. Passi, University of nsubria, ITALIEN

Modtaget: Oktober 1, 2014 Accepteret: 2 jan 2015; Udgivet: 18 Marts 2015

Copyright: © 2015 Filou et al. Dette er en Open adgang artiklen distribueret under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og Resource Er krediteret

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir

finansiering:.. forfatterne har ingen finansiering eller støtte til rapporten

konkurrerende Interesser:. forfatterne har erklæret ingen konkurrerende at eksistere Interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest hyppigt diagnosticeret kræft og den anden hyppigste årsag til kræftdødsfald i USA [1] og Europa, så godt. Selvom CRC er ncidence, i økonomisk udviklede lande, stabiliseres eller rettere faldt [2] Der er stadig brugeren et spørgsmål til større forståelse af biologi angiogenese og invasion med henblik på opdagelsen af ​​antiangiogeniske /anti-Israel nvasive molekyler. Akkumulerende e foreligger stadig flere beviser viser den afgørende rolle proteolytiske enzymer såsom Matrix (MMP’er) og nært beslægtede ADAMTSs (en disintegrin og har en llo protestantisk tur inase med thrombospondin motiv) i kræft progression og udvikling [3]. Er det særskilte ADAMTS gruppen af ​​zink-afhængige metalloproteinaser og vise høje kvens ligheder med familien af ​​slange reprolysin- venomases. Den komplette menneskelige ADAMTS familie består af 19 gener [4] (ADAMTS-5 og ADAMTS-11 deler den samme Gene), og selv om de er opløselige proteiner, mange af dem synes at binde den ekstracellulære matrix gennem deres thrombospondin motiver eller deres spacer Region [5 -7]. ADAMTS har varierende funktioner, herunder Clementine Specifik avage af Matrix proteoglycaner aggrecan, versican og brevican (ADAMTS-1, -4, -5, -8 og -15) [7-9], hæmning af angiogenese (ADAMTS-1, -8 ) [8-12], og collagen behandling (ADAMTS-2, -3 og -14) [13].

ADAMTS-1 og -8 anses for at producere anti-angiogene faktorer, årsag fødsel af samspillet mellem deres thrombospondin motiver og CD36, en membran glycoprotein receptor af endotelceller [11, 12]. Disse proteaser er blevet vist at inhibere VEGF-induceret angiogenese i chorioallantoiske membran (CAM) assay [10] og undertrykke FGF-2-induceret vaskularisering i hornhinden Pocket assay. Men ADAMTS-1 skal producere en mere betragtes som lecule med anti eller protestantiske-metastatiske virkninger afhængigt af Clementine avage site, under sin Auto-proteolytiske Clementine avage [14]. ADAMTS-8, synes også at inhibere epidermal vækstfaktorreceptor signalering sammen med nedsat niveau af phosphoryleret MEK og ERK [15]. Desuden har 12q12 locus af Gene ADAMTS-20 vist sig at give underlagt translokationer og andre ændringer i menneskelige maligniteter [16-19] og også flere patologiske forhold, herunder Parkinsons sygdom [20].

Der er det væld af e foreligger stadig flere beviser demonstrerer ADAMTS der er dereguleret i human cancer. Faktisk har tidligere undersøgelser vist, at ADAMTS-20 er overudtrykt i Brain og brystcarcinomer, tyder denne protestantiske drille Det kunne spille en rolle i tumor progression. For ADAMTS-1, er det blevet vist, at overekspression af sin fulde længde isoform øger tumorvækst og fremmer pulmonal metastase af TA3 brystceller eller Lewis lungeceller, mens det har vist sig faldet i ikke-småcellet lungekræft, pancreastumorer og prostata cancercellelinier [21, 22]. Det er også blevet vist, at ADAMTS-1, -5, -9, -12, -15 og -18 genpromotorer Er hypermethyleret i colorektal cancer, hvilket tyder nedsat ekspression af disse enzymer i denne stat [23]. Desuden Begge ADAMTS-15 og -18 gener undergår hyppige mutationer i kolorektal cancer Celler, men ingen e foreligger stadig flere beviser har endnu præsenteret deres effekt i udtryk eller funktion af enzymerne. I modsætning hertil Er ADAMTS-4 og -5 opreguleret i glioblastomer (GBMS), med den mulige rolle i øget nedbrydning af brevican dermed øge potentialet nvasive [24, 25]. Øget versican, som kan producere Relateret til ADAMTS modulerede udtryk, er også observeret i hunde colon adenomer og karcinomer [26]. Ikke decorin versican men ophobning er relateret til malignitet i mammographically opdaget høj tæthed og maligne forekommende microcalcifications i ikke-palpable bryst karcinomer [27].

For at få yderligere indsigt i, om det er sandsynligt, for det overudtrykte versican at producere nedbrydes af ADAMTS som kræft i nvasive mekanisme, læse undersøgt ADAMTS-1, -4 og -5 udtryk i Sund og kræft kolon væv og også i tyktarmskræft cellelinier af forskellige metastatisk potentiale. Da formålet med denne undersøgelse rene at afsløre potentielle mål for udvikling af nye anti-ikke den eneste nvasive men også anti-angiogene terapier, den ADAMTS antiangiogene undergruppe rene udtryk også estimeret. Derudover, da ADAMTS-1 antiangiogene effekt medieres af sine thrombospondin motiver [11] og ADAMTS-20 indeholder 14 gentagelser af det, også anslået dets samlede cellulære niveauer i neoplastisk og sund kolon.

Materialer og metoder

Materialer

Kanin polyklonale antistoffer, ab28284 (mod N-terminale ende af ADAMTS-1), ab84792 (mod C-terminale ende af ADAMTS-4), ab41037 (mod resterne 600-700 af ADAMTS-5) og ab60148 (mod katalytisk domæne af ADAMTS-20) PROSTITUERET købt hos Abcam (Cambridge, UK) og ged anti-kanin IgG conjucated med o xidase rene fra EMD den llipore Corporation (salon llerica, Massachusetts, USA). Muse-anti-tubulin (T9026) og o xidase konjugeret anti-muse IgG (A4416) PROSTITUERET opnået fra Sigma-Aldrich Inc. (St. Luis, USA). Expose mus og kanin Specifik HRP /DAB IHC Detection Kit (ab94710) ren fra Abcam. Totalt RNA ekstraheret fra ren frosne væv og dyrkede celler ved anvendelse af NucleoSpin Macherey-Nagel (Duren, Tyskland) ekstraktion kit, efter fabrikantens protokol. RT-PCR ren opnået fra Takara (Otsu, Shiga, Japan) Et skridt RT-PCR kit, der anvendes til frisk kolon væv og fra Takara PrimeScript 1

st cDNA-syntese kit og Finnzymes (Espoo, Finland) DyNAzyme II DNA i lymerase kit, der anvendes til dyrkede celler. Menneskelige Primere til alle prostitueret designet molekyler i laboratoriet, ved hjælp af PerlPrimer Program. Alle andre kemikalier, der anvendes i hele undersøgelsen PROSTITUERET af de bedste af den virale ilable analytisk kvalitet.

Undersøgelser på

Cells

cellekulturer.

Caco-2, DLD-1 og HT-29 kolon cancercellelinier PROSTITUERET indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Aggressivitet cellelinierne er lavere i Caco-2-celler og højere i HT-29-celler. DLD-1 og HT-29-celler PROSTITUERET dyrket i RPMI 1640 medium med 2 mM L-glu tamine og suppleret med 10 mM Hepes, 1 mm natriumpyruvat, 4,5 g /l glucose, 1,5 g /l natriumbicarbonat og 10% føtalt bovint serum (FBS), Når det kræves, som anbefalet af ATCC. Caco-2-celler PROSTITUERET dyrket i Eagles minimale essentielle medium med Earles BSS og 2 mm L-glu tamine (EMEM) og suppleret med 1,0 mm natriumpyruvat, 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 1,5 g /l natriumbicarbonat og 20% ​​føtalt bovint serum Når påkrævet, som også anbefalet af ATCC. Prostitueret Celler dyrket ved 37 ° C, 5%

2 og 100% fugtighed.

cellelyse.

pellets fra dyrkede celler behandlet med en prostitueret pPro relevant lysisbuffer, der indeholder 25 mm Hepes, 150 mM NaCI og 5 mM EDTA i 10% glycerol og 1% Triton X-100. Ekstraktioner PROSTITUERET udført i 30 min ved 0 ° C under omhvirvling i 4 sekunder hver 10 min, med tilstedeværelse af phosphotyrosylproteiner hørelse sphatase inhibitor Na

3VO

4 (50 mm) og af følgende protestantiske tease inhibitorer: aprotinin (1250 mikrogram /ml), Pefablock (1000 mg /ml), Leupeptin (10 mM), efter centrifugering i 10.000 rpm i 5 min.

Undersøgelser af humane prøver

Patienter.

den prostituerede kræft kolon væv fra patienter (38 patienter, gennemsnitsalder: 73, aldersgruppe: 50-81), som gennemgik kirurgisk operation på grund af kolorektal cancer. Am patienterne i fase (hertugens), tretten patienter i fase B, tolv patienter i fase C og fire patienter i fase D PROSTITUERET inkluderet i denne undersøgelse. Patienterne indgår i studiet af andre gratis PROSTITUERET Sygdom og led aldrig før nogen af ​​sygdom. Sund kolon væv (N = 6) PROSTITUERET også indgår i vores undersøgelse. Denne undersøgelse designet var blevet godkendt af Etisk Komité Universitetshospitalet i Patras, Grækenland, og rent skriftligt informeret samtykke opnået fra alle patienter, der kommer ind i studiet.

Sekventiel ekstraktion af ekstracellulære og celle-associerede komponenter fra væv.

de indsamlede normale og ondartede colon væv PROSTITUERET hakkede og sekventielt udvundet med 10 Vols af 10 mm dinatriumphosphat, 0,14 M NaCl, pH 7,4 (PBS), 4 M Butterflys nidine hydroklorid (GdnHCl) – 0,05 M natrium til Cetate pH 5.8 og 4 GdnHCl M-0,05 M natrium-Cetate af 1% Triton X-100, for at opnå den opløselige og membranbundne former af ADAMTSs. Ekstraktioner PROSTITUERET udført i 24 timer ved 4 ° C under forsigtig omrystning, med tilstedeværelse af følgende protestantiske turn inase inhibitorer: ε-amino-n-capronsyre (0,1 M), PMSF (0,4 mM), N-e thylma imidet (10 mM), dinatrium EDTA (10 mM) og fødsel er midine-HCI (5 mM). Ekstrakterne PROSTITUERET opsamlet og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse [28-30]. Udvindingen protokol rene udformet på en sådan måde at spille parate ADAMTS eksisterede i frie former i væv og skal producere udvindes i PBS (en sso initiativet betingelser), fra ADAMTS interagerer med andre ekstracellulære makromolekyler, der skal producere udvindes i 4M GdnHCl (di sso initiativet forhold) og fra ADAMTS eksisterende i cellemembraner, der skal producere udvindes især i GdnHCl 4M-1% Triton X-100.

Immunhistokemi.

Immunhistokemi (IHC) ren udført på 5 um snit skåret fra formalin fast, paraffinindlejret blokke som tidligere beskrevet [29], med primære polyklonale antistoffer mod ADAMTS-1, -4, -5 og -20 fortyndet 1: 6250, 1: 2000, 1: 650 og 1: 6250 henholdsvis i TBS indeholdende 1 % (vægt /volumen) BSA. Det opnåede antigen-antistof-komplekser PROSTITUERET visualiseret ved inkubation med gede-anti-kanin-HRP er njugate og farvning af rene fremkaldt med DAB /hydrogenperoxid af IHC Kit (Abcam) ifølge producentens anvisninger. Endelig sektioner PROSTITUERET modfarvet med hæmatoxylin. En positiv farvning ren scoret Ifølge hele intensitet hver en af ​​sektionerne.

Western blot-analyser

Om 20 ug protein, kvantificeret ved hjælp af Bradford assay (BioRad), fra væv og celler kulturer Ekstrakter, og cellekulturerne Media PROSTITUERET udfældet med 5 volumener ethanol, opløst i 20 pi Laemmli-prøvebuffer og anvendt til Lya crylamide gelelektroforese (PAGE) på geler af 10% koncentration i crylamide som tidligere beskrevet [28]. Makromolekylerne prostitueret overføres derefter til lyvi nylidene di (PVDF) -membraner (Immobilon-P, den llipore) ved en konstant strøm på 80 er ved 4 ° C i 20 timer i 0,05 M Tris /HCl, pH 8,3, og membranerne PROSTITUERET vasket med 0,14 M NaCl i 0,01 M phosphatbuffer (PBS), pH 7,2, indeholdende 0,1% (v /v) Tween-20 (PBS-T). Efter blokering med 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS-T, membranerne prostituere nedsænket i opløsning antistof mod enten ADAMTS-1, -4, -5 eller -20 fortyndet 1: 5000, 1: 500, 1: 250 og 1: 5.000 henholdsvis i PBS indeholdende 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS-T og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur. Efter gentagen vask med PBS-T, membranerne prostituere inkuberet med ordentlig Sekundært antistof fortyndet 1: 10.000 i PBS-1% BSA, inkuberet i 1 time ved stuetemperatur og vasket med PBS-T. Den immunoreagere bands PROSTITUERET visualiseret ved øget opmærksomhed på stikkene nescence metoden (ECL) (Amersham, UK), Ifølge producentens anvisninger og ved e Xposure til Agfa Curix røntgenfilm, i tiden varierede fra 1 til 30 min, afhængig af eksperimentet.

RNA ekstraktion og RT-PCR-analyser

Friske kolon væv pROSTITUERET pulveriseret i flydende nitrogen og dyrket som prostitueret Celler udsat for Total RNA ekstraktion, ved hjælp af Nucleospin udvinding kit, som beskrevet af producentens anvisninger og behandlet med RNase-fri DNase for at fjerne kontaminerende genomisk DNA. For colonvæv, rene streng cDNA syntetiseret fra 80 ng af total RNA i 50 pi reaktionskomponenter for ettrins RT-PCR kit, ifølge producentens anvisninger. Denne reaktionsblanding indeholdt i tilsætningen af ​​1 pM og følelse af ntisense primere vist i tabel 1. Amplifikationen ren udført i en GeneAmp 2400 termisk cykliseringsapparat (Perkin-Elmer Co.), og reaktionen profil bruges til alle primere indeholder ren: 95 ° C i 10 min for aktiveringen af ​​DNA i lymerase og inaktivering af revers TRANSLATION_LANGUAGE nscriptase og derefter 25-35 cyklusser, afhængigt af Analysis, ved 94 ° C i 30 sek, 52-58 ° C afhængigt af primersæt i 1 min og 72 ° C i 1 min til Phi forlængerring. Til cellekulturer, to trin RT-PCR ren anvendt og den første streng cDNA rent syntetiseret fra 1 ug totalt RNA i 20 pi reaktionskomponenter for PrimeScript 1

st cDNA-syntese kit, under anvendelse tilfældige 6mers, Ifølge producentens anvisninger. Derefter 100 ng amplificeret cDNA PROSTITUERET i 50 pi reaktionskomponenter til DNA i lymerase kit. Denne reaktionsblanding indeholdt desuden 0,5 pM af sense og ntisense primerne vist i tabel 1. Amplifikationen ren udført i en GeneAmp 2400 termisk cykliseringsapparat (Perkin-Elmer Co.), og reaktionen profil bruges til alle primere indeholder ren: 95 ° C i 2 min, 94 ° C i 30 sek, 52-58 ° C afhængigt af primersæt i 1 min og 72 ° C i 1 min til Phi ring udvidelse og ren gentages for 25-35 cyklusser, afhængigt af analysen. Den reaktionsprodukter PROSTITUERET separeret ved elektroforese i 2% (vægt /volumen) af garose GelStar Stain geler indeholdende vitamin ikke Alizé de amplificerede cDNA-fragmenter under UV. Den geler PROSTITUERET derefter scannet og bands prostitueret analyseret densitometrisk. Qu for Antioch tative forskelle Mellem prostitueret normaliserede cDNA prøver ved herunder GAPDH i alle forsøg.

Statistisk Analyse

Normalitet af fordelingen af ​​rene værdier testet med Kolmogorov-Smirnov test. Resultater PROSTITUERET statistisk analyseret ved hjælp af den uparrede t-test til påvisning af forskelle mellem grupper.

P ≤0.05

ren betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

ADAMTSs udtryk i tyktarmskræft cellelinjer

RT-PCR-analyser.

for at være nve stigate fremgår, at ADAMTSs i CRC, læse undersøgt deres udtryk på RNA og protein niveau i tre tyktarmskræft cellelinjer. Resultaterne er angivet i At RNA-niveau, ADAMTS-1 udtryk ren lidt afhængig af kræftcellen aggressivitet; det ren ikke fundet at producere udtrykt i Caco-2, mens det viste Lav udtryk i DLD-1, som steg en smule i rene HT-29 celler. Desuden er der i HT-29 celler dyrket i nærvær af serum, ADAMTS-1-ekspression rent Fundet forhøjet (fig. 1). Tværtimod høje niveauer af ADAMTS-4-RNA PROSTITUERET Tre Fundet i alle cellelinjer. Men ADAMTS-4 Fundet rene udtryk for at frembringe en forøget aggressivitet i-relateret måde, især når celler dyrket i fravær af serum. Desuden med undtagelse af DLD-1-celler, forøget ekspression af ADAMTS-4 ren observerede PROSTITUERET Når celler dyrket i nærvær af serum (fig. 1c). Som vist i fig. 1E, ingen ADAMTS-5 Fundet rent udtryk i Caco-2-celler, mens det rene hovedsageligt observeret i HT-29-celler. I modsætning, ADAMTS-1 og -4, at ADAMTS-5 Found rene udtryk producere nedreguleret i celler dyrket i nærvær af serum. A Different ekspressionsmønster observeret for rene ADAMTS-20. Som vist i fig. 1G, i DLD-1 og HT-29-celler, rene Fundet det at producere kun udtrykkes Når dyrket i fravær af serum. Men serum tilstedeværelse ikke ud til sammenløbet ADAMTS-20 ekspression i Caco-2-celler.

Semi-qu for Antioch tativ RT-PCR-analyse af (A) ADAMTS-1, (C) ADAMTS-4 (E) ADAMTS-5 og (G) ADAMTS-20 i dyrkede celler (hvid /sort søjle, tilstedeværelse /fravær af serum). Værdier er GAPDH-normaliseret gennemsnit ± standardafvigelse (B) ADAMTS-1 (D) og ADAMTS-4 (F) ADAMTS-5 protein i celle distribution og i ekstrakter af Media Celler dyrket. (S

+/-: tilstedeværelse /fravær af serum) *

P

≤0.05; statistisk signifikante forskelle sammenlignet med celler dyrket i nærvær af serum. **

P

≤0.05; statistisk signifikante forskelle i forhold til Caco-2 celler, ***

P

≤0.05; statistisk signifikante forskelle i forhold til DLD-1 celler. Til sammenligning, i celle tubulin immunoidentification ekstrakter ren inkluderet i B, D og F.

Western Blot-analyser.

ADAMTS-1 opdaget radioaktiv datering i ren form DLD-1 og HT 29 cellelinier, som båndet af 80 kDa i celleekstrakterne, mens kun fragmenter af ADAMTS-1 af 35 kDa PROSTITUERET påvist i medier (fig. 1b), uanset tilstedeværelsen af ​​serum. Disse fragmenter kunne producere produkter af enten autokatalytisk forarbejdede ADAMTS-1 eller katalytisk forarbejdede ADAMTS-1 af MMP. I betragtning af at sådanne fragmenter detekteret PROSTITUERET Ikke kun ekstra- og intra-cellulært, Er de mere muligt som følge af MMP aktivitet. I Caco-2-cellelinier efter dette er ren tease llo protestantiske Kun detekteret i nærvær af serum ved samme molekylære form som i andre begge cellelinier (fig. 1b). Et yderligere bånd på 65 kDa observeret i de rene Ekstrakter af DLD-1 celler dyrket i fravær af serum.

ADAMTS-4 detekteret radioaktivt dating i ren form DLD-1 og HT-29-cellelinjer og i nærvær Ikke for eller serum, som bandet på 90 kDa, intra- og ekstracellulært (fig. 1d). I tilfælde af Caco-2 celler, den 90-kDa bånd ren kun påvist i celleekstrakter, mens der i celle Media en ekstra i MMU ved en radioaktiv datering bånd på 50 kDa rent observeret, sandsynligvis som et resultat af sin egen autokatalytisk aktivitet (fig. 1d).

ADAMTS-5 opdaget radioaktiv datering ren form som et bånd på 74 kDa, i alle tre cellelinjer dyrket under alle forhold (fig. 1F). Yderligere bånd i forskellige størrelser, mindre end formen af ​​det radioaktive dating, PROSTITUERET observeret i celleekstrakterne af HT-29 og hovedsagelig af Caco-2 celler dyrket i fravær af serum. Interessant, ingen MMU er en lille gruppe af enhver radioaktiv datering SIZE ren påvist i Media nogen af ​​disse cellekulturer. Men ADAMTS-5 radioaktiv datering ren form også detekteret ekstracellulært, i HT-29 celler dyrket i nærvær af serum og i DLD-1 cellelinier. Desuden er der i HT-29-celler dyrket i nærvær af serum, yderligere bånd med mindre størrelser PROSTITUERET også detekteret ekstracellulært, hvilket antyder den posttranslationelle trunkering af enzymet som følge af enten sin egen aktivitet eller autokatalytiske MMP’er aktivitet.

I modsætning til alle andre ADAMTSs studerede, ADAMTS-20 Ikke rent protein påvist i disse tre tyktarmskræft cellelinjer.

in situ udtryk for ADAMTS-1, -4, -5 og -20 ved IHC

ADAMTS-1, -4, -5 og -20 in situ-ekspression og lokalisering Næste ren analyseret i colon vævssnit fra paraffinindlejrede blokke, anvendelse af antistofferne ifølge pPro relevant. Stærk farvning for ADAMTS-1 observeret i ren sund kolon, hovedsagelig i muskulære lag og i vævet af nnective mellem de to lag (fig. 2A, Sund). I CRC, ADAMTS-1 viste Stærk udtryk i muskelvæv (pilen i fig. 2A, St. C) og Nedre primært cytoplasmatisk udtryk i cancerceller af niveau C-prøver. Reduceret eller ingen farvning for ADAMTS-1 observeret i ren muskel vævsprøver af fase B (fig. 2A, St. B) og i andre faser af prøver (C og D), hhv. Farvning for ADAMTS-4 i Sund kolon væv observeret i de rene To lag muscularis Externa og ikke i BMU cosae (fig. 3A, Sund). Tidlig kræft i etaper, etaperne og B, ADAMTS-4 udviste et lignende udtryk mønster til ADAMTS-1, da det viste farvning i stroma (pile i fig. 3A, St., St. B) og ganske svagere eller ingen farvning i kræft celler (pilespidser i fig. 3A og St. B St. henholdsvis). Men med enheder af trin C og D, viste, kræftcellerne clare ges store cytoplasmatisk udtryk for ADAMTS-4 (pilespidser i fig. 3A St. C og D og deres St. mellemværker henholdsvis). Desuden mindre eller ingen ekspression af ADAMTS-4 ren stroma observeret i prøver af celler i trin C og D, henholdsvis (pile i fig. 3A og St. St.C D, henholdsvis). Som for ADAMTS-5, Low helt ren farvning observeret i langsgående lag af muscularis Externa i sund kolon prøver (pil i fig. 3B, Sund). I CRC, ingen farvning for ADAMTS-5 observeret enten i ren eller stroma i neoplastiske epitelceller etape af prøverne (pil og pilespids i fig. 3B, St.A henholdsvis), mens ekspressionen af ​​ADAMTS-5 rent detekteret i stroma Celler af fase B prøver (pil i fig. 3B, St. B). Som ADAMTS-4, ADAMTS-5 også udstillet Stærk cytoplasmatisk farvning i kræftceller i trin C og D prøver (pilespidser i fig. 3B St.C St. og D) og ingen udtryk i stromale etape D. Endelig ADAMTS- 20 udstillede også lav farvning i langsgående lag af muscularis Externa i sund kolon prøver (fig. 2B, Sund), mens det i CRC det rene opdaget Kun i kræftceller i fase B og hovedsageligt af scenen C prøver (pilespidser i fig. 2B, St. St.B og C).

Sund kolon væv og kræft kolon af scenen B og C, farvet for ADAMTS-1 (A) og ADAMTS-20 (B). (A, forstørrelse, x4, anatomisk site, coecum, forstørrelse, x4, anatomisk site, coecum, forstørrelse, x4, anatomisk site, endetarm og B, forstørrelse, x4, anatomisk site, coecum, forstørrelse, x20, anatomisk site, coecum, forstørrelse, x20, anatomisk sted, endetarmen). Mellemværker af A og B (alle forstørrelse, x10) viser slimhinden og ikke bmucosa lag. Pile i Sund kolon viser udtryk for ADAMTS i muskelvæv. Pile i kræft kolon viser ekspressionen af ​​ADAMTS i stroma, mens pilespidser viser ekspressionen af ​​ADAMTS i cancerceller.

Sund kolon væv og cancerøs kolon af trin A, B, C og D, farvet for ADAMTS-4 (A) og ADAMTS-5 (B). (A, forstørrelse, x4, anatomisk site, coecum, forstørrelse, x10, anatomisk site, coecum, forstørrelse, x20, anatomisk site, coecum, forstørrelse, x4, anatomisk site, endetarm, forstørrelse, x20, anatomisk site, endetarm og B, forstørrelse, x4, anatomisk site, coecum, forstørrelse, x10, anatomisk site, coecum, forstørrelse, x20, anatomisk site, coecum, forstørrelse, x4, anatomisk site, endetarm, forstørrelse, x10, anatomisk sted, endetarmen), farves for ADAMTS- fem. Mellemværker viser af slimhinden og ikke bmucosa lag på sund kolon (forstørrelse, x10) og den cytoplasmatiske lokalisering af ADAMTS-4-celler for kræft i trin C og D (forstørrelse, x20 og x40, henholdsvis). Mellemværker viser B af slimhinden og ikke bmucosa lag på Sund kolon (forstørrelse, x10) og cytoplasmatisk lokalisering af ADAMTS-5 i kræftceller i fase C (forstørrelse, x20). Pile i Sund kolon viser udtryk for ADAMTS i muskelvæv. Pile i kræft kolon viser udtryk for ADAMTS i stroma, mens pilespidser viser udtryk for ADAMTS i kræftceller.

ADAMTSs udtryk i tyktarmskræft væv

RT-PCR-analyser.

RNA niveauer af ADAMTSs PROSTITUERET undersøgt i Sund blindtarm, sigmoid og endetarmen. Af alle undersøgte proteaser, ADAMTS-1 viste det højeste udtryk (mere end dobbelt til den interne kontrol-GAPDH), mens ADAMTS-5 den mindre ren protestantiske udtrykte drille (næsten niveau på nul fighter) (data ikke vist). RT-PCR angivet analyser,

ADAMTS-1

rent nedreguleret i cancer eksemplarer af hvilket som helst tidspunkt i forhold til Sund kolon, med den største de krølle til omkring 20% ​​i den fase prøver (fig. 4A). Disse data er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, hvor

ADAMTS-1

havde vist sig at give nedreguleret i mange typer af kræft [21, 22]. A Different udtryk mønster fra

ADAMTS-1

ren observerede for

ADAMTS-4

og-

5 fotos, som PROSTITUERET Fundet at producere overudtrykt i fase C-prøver; næsten 14 gange og 20 gange sammenlignet med raske colon væv, (fig. 4C, E). Disse data prostitueret aftale med tidligere undersøgelser i andre former for kræft, hvor ADAMTS-4 og -5 var blevet fundet at producere overudtrykt for at nedbryde ECM proteoglycaner, såsom agreecan og versican at sprede litate cancercelleinvasion [24, 25 ]. Efter den samme eksperimentelle protestantiske procedure for

ADAMTS-20

, det rene Fundet forhøjet i stadium A og B-prøver sammenlignet med de sunde væv ved 50% og 100%, henholdsvis, men i fase C prøver det udstillede en de krølle til 20% (fig. 4G).

Semi-qu for Antioch tativ RT-PCR-analyse af (a) ADAMTS-1, (C) ADAMTS-4 (E) ADAMTS-5 og (G) ADAMTS-20. Værdier er GAPDH-normaliseret gennemsnit ± standardafvigelse Protein distribution af (B) ADAMTS-1 (D) ADAMTS-4, (F) og ADAMTS-5 (H) ADAMTS-20. *

P

≤0.05; statistisk signifikante forskelle sammenlignet med raske væv. **

P

≤0.05; statistisk signifikante forskelle i forhold til scenen A. ***

P

≤0.05; statistisk signifikante forskelle i forhold til at iscenesætte B. Sund blindtarm, Er sigmoideum tyktarm og endetarm væv vist;

Den C-

: hertugens CRC etaper. Pile ndicate af masseindvandring af molekylære markører. PBS, GdnHCl og Triton Er sekventielle udvinding brugte Solutions (Text glattere).

Western Blot-analyser.

ADAMTS-4, -5 og -20 PROSTITUERET påvist i coecum, sigmoid og endetarm, mens ADAMTS-1 rent opdaget Kun i sigmoid og coecum. Men de adskiller sig i deres ekstraherbarhed afsløre forskellige typer af interaktioner og /eller lokalisering af disse enzymer i colon væv.

ADAMTS-1 Kun ren påvist i PBS og GdnHCl /Triton Sund Ekstrakter af sigmoideum og coecum, som båndet af 120 kDa og 11 kDa, der repræsenterer den latente form af enzymet og uafsluttede syntesebiprodukter, mens ingen af ​​de Ekstrakter indeholdt det radioaktive dating formen (80 kDa) af enzymet. (Fig. 4b). ADAMTS-1 latent ren form også påvist i kræft coecum af fase B, ved hjælp af Creative di sso At betingelser viser det interageret med ECM komponenter, såsom TIMP-3 eller A2- makroglobulin, som vedligeholdes enzymet i sin inaktiveret form. I endetarmen af ​​kræft stadie det ren C påvist i GdnHCl som Uddrag af 35 kDa fragmentet, muligvis som følge af MMP-aktivitet (fig. 4b). Figur A Different rene opnået fra sigmoid, hvor ADAMTS-1 ren Ikke påvist i hvilket som helst stadium af kræft. Således kunne det producerer hævdet, at ADAMTS-1 Rolle i CRC afhænger i vid udstrækning af anatomiske webstedet.

Til Fortsæt, den latente form af ADAMTS-4 rene påvist i Triton Ekstrakter af alle Tre af anatomiske steder Sund kolon som et band på 110 kDa. Men i PBS og GdnHCl Ekstrakter af Både coecum og rektum, det radioaktive dating form af enzymet (90 kDa) og multiple fragmenter af forskellige molekylære størrelser og to forskellige fragmenter af 60 kDa og 70 kDa PROSTITUERET detekteret henholdsvis (fig. 4D). Tværtimod ADAMTS-4 ren detekteret i trin B og C prøver hovedsagelig i sin form radioaktiv datering. I trin B-cecum prøver, det radioaktive dating form af enzymet rene påvist i PBS og GdnHCl Ekstrakter, mens i trin C rektum prøver, med undtagelse af den radioaktive dating form, som rent Fundet i PBS Ekstrakter, et yderligere bånd på 110 kDa, som repræsenterer dets latente form , også rent påvist i alle Tree Uddrag.

efter samme eksperimentelle protestantiske procedure, ADAMTS-5 radioaktiv datering observeret i ren form og PBS GdnHCl Sunde Ekstrakter af tyktarmen, men også for alle stadier af kræft, dog med den fase-relaterede øget immunoreaktivitet (fig. 4F).

Endelig western blot analyse afslørede tilstedeværelsen af ​​latent form af ADAMTS-20 (161 kDa) i PBS og GdnHCl Ekstrakter af de anatomiske Tre steder i Sunde væv, bliver sigmoid indeholdende de laveste beløb. Interessant nok også ren påvist cancer i alle faser, dog med forskelle i ekstraherbarhed og i de molekylære former. I trin sigmoid prøver, den latente form af enzymet detekteret i rene PBS Ekstrakter, hvilket indikerer, at det fandtes temmelig frit i dette væv. ADAMTS-20 fragmenter fundet i PROSTITUERET GdnHCl og GdnHCl /Triton Ekstrakter (fig. 4H). Ekstrakter af GdnHCl i fase B cecum prøver, enkelt 60-kDa fragment af ren opnået, mens i PBS og Gdn-HCl Ekstrakter af scenen C rektum prøver, en ekstra mindre 50 kDa fragment af ren opnået.

Diskussion

akkumulerende e foreligger stadig flere beviser for ADAMTSs konsekvenser i humane maligniteter har vist deres store betydning i tumor progression [21, 24, 25]. Over-ekspression af disse proteaser er i overensstemmelse med kravene i carcinomceller at fjerne proteoglycaner af ECM, såsom aggrecan og versican, som en supplerende mekanisme til collagen nedbrydning med collagenaser og gelatinaser. Følgelig har forøget ekspression af versican blevet observeret i neoplasier af tyktarm og endetarm [26, 30]. Yderligere væsentlige oplysninger ville give studiet i ADAMTSs udtryk i CRC, da den potentielle nedbrydning af versican ville medføre radioaktiv dating versican fragmenter med etablerede roller i tumorprogression [14]. På den anden side er nogle medlemmer af ADAMTSs familie, der rapporteres at have potentiale antiangiogen Rolle, er epigenetisk til tavshed Fundet i forskellige former for kræft, herunder CRC [12]. I denne undersøgelse eventuel modulering af ADAMTS-1, -4, -5 og -20 fordeling og ekspression i coloncancer sammenlignet med ren sund kolon undersøgt.