PLoS ONE: Hæmningen af ​​Autophagy følsomt Colon Cancer Cells med Wild-Type p53, men ikke Mutant p53 til Topotecan Treatment

Abstrakt

Baggrund

Topotecan producerer DNA-skader, der inducerer autofagi i cancerceller . I denne undersøgelse, sensibiliserende topotecan til tyktarmskræft celler med forskellig P53 status via modulering af autofagi blev undersøgt.

Metode /vigtigste resultater

DNA-skader fremkaldt af topotecan behandling resulterede i cytobeskyttende autofagi i tyktarmen cancerceller med vildtype-p53. Men i celler med mutant p53 eller p53 knockout, behandling med topotecan induceret autofagi-associeret celledød. I vildtype p53 colon cancerceller, topotecan behandling aktiveret p53, opreguleret ekspression af sestrin 2, inducerede phosphorylering af AMPKα underenheden ved Thr172, og inhiberede mTORC1 pathway. Endvidere inhibering af autofagi forbedret anti-tumor effekt af topotecan behandling i vildtype p53 coloncancerceller men lettede antitumorvirkningen af ​​topotecan behandling i p53 knockout-celler in vivo.

Konklusioner /Betydning

Disse resultater antyder, at vildtype-p53-afhængig induktion af cellebeskyttende autofagi er en af ​​de cellulære reaktioner, der bestemmer den cellulære følsomhed til DNA-skadelige stof topotecan. Derfor er vores undersøgelse giver en potentiel terapeutisk strategi, der anvender en kombination af DNA-skadelige midler og Autophagy inhibitorer til behandling af koloncancer med vildtype-p53

Henvisning:. Li DD, Sun T, Wu XQ, chen SP, Deng R, Jiang S, et al. (2012) hæmning af Autophagy følsomt tyktarmskræft Celler med Wild-Type p53, men ikke Mutant p53 til Topotecan Treatment. PLoS ONE 7 (9): e45058. doi: 10,1371 /journal.pone.0045058

Redaktør: Gian Maria Fimia, Istituto Nazionale per le malattie infettive, Italien

Modtaget: Februar 13, 2012; Accepteret: August 15, 2012; Udgivet: 14 september, 2012 |

Copyright: © Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (30873085, 30972882, 81101670) (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default106.htm), Major Videnskab og Teknologi Projekt for National Basic Research Program (973 Program) Kina (2011CB504300) og Natural Science Foundation of Guangdong i Kina (S2011020002759). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Topotecan, en topoisomerase i-inhibitor, som inducerer DNA-ødelæggelse, anvendes til behandling af coloncancer, ovariecancer, lungecancer og fremskreden livmoderhalskræft [1], [2]. Mens DNA-skadelige midler er blevet udnyttet i løbet af de sidste 50 år, grunden til, at nogle patienter viser forskellige følsomheder til en DNA-skadelige stof er fortsat uklart. Derfor indsigt i de cellulære responser udløst af DNA-skadelige stoffer og de mekanismer, der bestemmer lægemiddelfølsomhed er kritisk at udvide anvendeligheden af ​​DNA -damaging lægemidler til behandling af cancere.

Autophagy er en katabolisk mekanisme involveret i genanvendelse og omsætning af cytoplasmatiske komponenter [3], [4]. Autophagy kan lette cellulær overlevelse eller død som respons på forskellige stress stimuli [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. Autophagy spiller også en væsentlig rolle i opretholdelsen af ​​genomisk stabilitet [13], [14], [15] ved at opretholde metabolisme og overlevelse under stress (fx DNA-skader) til gavn celle overlevelse [16]. Mange undersøgelser har vist, at autofagi er forbundet med en række patologiske tilstande, herunder cancer [10], infektionssygdomme, myopatier og neurodegenerative lidelser [17], [18], [19]. Fordi funktion autophagy i kræft er kompliceret og kan have modsatrettede konsekvenser [7], har mange hypoteser blevet foreslået med hensyn rolle autophagy i kræft. En af disse hypoteser antyder, at rollen som autofagi afhænger af det stadium af tumorudvikling [20]. På et tidligt tidspunkt af tumor udvikling, genetiske beviser indikerer fast, at autofagi undertrykker tumor initiering. Men overbevisende data tyder også på, at etablerede tumorceller, men ikke indlede tumorceller, kræver autophagy som et afgørende overlevelse vej på fremskredne stadier af tumor udvikling. Tumorer opholde ofte i et miljø berøvet næringsstoffer, vækstfaktorer og oxygen. Således er autofagi lokaliseret til de hypoksiske tumor regioner, der er længst væk fra næringsstof-forsyning blodkar, hvor det opretholder tumorcelleoverlevelse. En anden hypotese foreslår, at autofagi regulerer kræft i en celle- og vævsspecifik måde [21], [22]. Mange kræftceller undergå autophagic celledød efter kræftbehandling; dog autophagy beskytter også nogle kræftceller mod anticancerbehandlinger ved at blokere apoptotiske vej.

p53 tumor suppressor er et centralt molekyle i respons på DNA beskadigelse. Som reaktion på ugunstige betingelser, herunder genotoksisk, hypoxiske og /eller oncogen stress, p53 undergår hurtigt reversibel post-translationelle modifikationer, der letter dens stabilisering [23]. I kernen, kan aktive p53 binde til promotorregionerne og transaktivere en overflod af target gener involveret i cellecyklusprogression, apoptose og /eller metabolisme [24]. p53 medierer også transskription-uafhængig tumor-undertrykkende funktioner uden for kernen [25]. For eksempel kan cytoplasmatisk p53 relocalise til mitokondrierne og udløse mitokondriemembranen permeabilisering [26], [27].

I kræft, findes der mange links mellem autofagi og p53, der endnu ikke er fuldt forstået [28]. En undersøgelse rapporterede, at P53 fremmet autophagy gennem AMP-kinase (AMPK) aktivering og pattedyr mål for rapamycin (mTOR) hæmning [29]. Men akkumulere beviser indikerer, at P53 tumor suppressor kan modulere autofagi i flere måder afhængigt af dets subcellulære lokalisering [25]. På den ene side, p53 er en transskription faktor, der reagerer på cellulært stress og transaktiverer gener såsom DRAM, sestrins1 og sestrins2 der inducerer autophagy eller autophagic celledød [30], [31], [32]. Men på den anden side kan cytoplasmatisk men ikke nuklear p53 aktiverer mTOR og undertrykke autofagi [33]. Desuden kan p53 også fremkalde autophagy ved regulering af LC3 [34]. Men forstå, hvordan disse effekter opnås forbliver undvigende,.

I den foreliggende undersøgelse, rapporterer vi, at vildtype p53 kan aktivere AMPK, hæmmer mTORC1 og fremme kolon kræftceller overlevelse ved at aktivere cytobeskyttende autofagi som reaktion på topotecan behandling . Endvidere inhibering af autofagi sensibiliserer coloncancer-celler med vildtype-p53 til behandling med topotecan. I modsætning hertil inhiberingen af ​​autofagi lindres anti-tumor effekt af topotecan behandling i p53 mutant eller knockout colon cancerceller både in vitro og in vivo. Derfor er vores undersøgelse tyder på, at en kombination af DNA-skadelige midler og autofagi hæmmere potentielt kunne tjene som en ny kemoterapeutisk tilgang til behandling af tyktarmskræft celler med vildtype p53.

Resultater

Topotecan Behandling induceret autophagy i Colon Cancer Cell Lines

en punktformet LC3 farvningsmønster er blevet identificeret som en biologisk markør for autofagi [35], [36]. For at undersøge, om det DNA-ødelæggende middel topotecan kunne inducere autofagi blev HCT116, LS-174T og HT29-celler, der udtrykker LC3 fusioneret til gult fluorescerende protein (YFP-LC3) oprettet. Som vist i fig. 1A, i de ubehandlede celler, YFP-LC3 var jævnt fordelt i cytosolen. Imidlertid topotecan behandling inducerede en potent akkumulering af YFP-LC3 foci i disse celler. LC3 omdannes til lipideret LC3 (LC3-II) ved dannelsen af ​​en autophagosome, og LC3-II migrerer hurtigere i forhold til den ikke-lipideret LC3-I på en SDS /PAGE-gel [37]. Vi anvendte denne forskel i migration til yderligere at overvåge LC3-II niveauer efter behandling med topotecan og fundet, at forekomsten af ​​LC3-II blev induceret på et højt niveau ved topotecan behandling i en række forskellige tyktarmskræft cellelinjer (fig. 1B og fig. S1). Modne auto-lysosomer underkastes autophagic proteolyse, hvilket fører til et reduceret niveau af de autophagic substrater samt reducerede niveauer af autophagosome og auto-lysosom komponenter, såsom P62 /SQSTM1 [38], [39]. For yderligere at bekræfte, at autophagic proces blev induceret ved behandling med topotecan, detekteres vi P62-proteinet ved Western blotting. Resultaterne viste, at P62 blev nedbrudt efter topotecan behandling, hvilket indikerer autofagi blev induceret i disse colon cancerceller (fig. 1B og fig. S1).

A. HCT116, LS-174T og HT29-celler blev transficeret i 24 timer med en ekspressionskonstruktion kodende LC3 fusioneret til gult fluorescerende protein (YFP-LC3). Derefter blev cellerne behandlet med eller uden 1 pg /ml topotecan (TPT) i 24 timer og visualiseret under et konfokalt mikroskop. B. De angivne celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af topotecan i 24 timer. Lysaterne blev analyseret ved immunblotting med lC3 og P62-antistoffer.

Hæmningen af ​​Autophagy Øget følsomhed for Human Colon Cancer Cells med Wild-typen p53, men ikke Mutant p53 eller p53 Knockout Celler til Topotecan Behandling

for at undersøge topotecan-induceret autophagy nærmere, blev RNA-interferens brugt til at tømme to kendte centrale autofagi proteiner, beclin1 og ATG5 (fig. 2A og fig. S2A). Som vist i fig. 2B og fig. S2B, udtømningen af ​​beclin en eller ATG5 af siRNA behandling effektivt blokeret ophobning af LC3-II efter topotecan behandling, hvilket indikerer hæmning af autofagi. Endvidere inhibering af autophagy ved udtømningen af ​​beclin 1 eller ATG5 øget topotecan-induceret celledød i HCT116 og LS-174T-cellelinier, som er p53 vildtype-human colon cancerceller (fig. 2C). Disse resultater blev også bekræftet ved SRB-assay (fig. S3A). Disse resultater indikerer, at behandling med topotecan induceret funktionelle og cytobeskyttende autofagi i disse p53 vildtypeceller. For yderligere at bekræfte vores resultater, vi hæmmede også autophagic vej med farmakologiske hæmmere. Vi fandt, at en co-behandling af topotecan med chloroquin (CQ), en inhibitor af lysosomal funktion, der forhindrer færdiggørelsen af ​​autophagy ved det endelige trin, effektivt blokerede topotecan-induceret nedbrydning af P62. Vigtigt er det, inhibering af autophagy af CQ også sensibiliserede HCT116 celler til topotecan-induceret celledød (fig. 2D og fig. S2C).

A. Lysater fra HCT116 celler transficeret med beclin 1-siRNA eller Atg5- shRNA blev analyseret ved immunblotting. B. En immunblotting analyse viste ingen akkumulering af LC3-II i autofagi-defekt (dvs., beclin 1-siRNA eller Atg5-shRNA behandlede) celler efter behandling med 1 mg /ml TPT. C. HCT116 og LS-174T kontrol-celler, sibeclin 1-celler og shAtg5-celler blev dyrket ved 6000 celler per brønd i en plade med 96 brønde og udsat for forskellige koncentrationer af topotecan (0,039 til 1,25 ug /ml) i 72 h. Niveauet af vækstinhibering blev påvist under anvendelse af MTT-assayet. Data i C er middel ± s.d. (

n

= 3).

P

0,05, Students t-test. D. HCT116 celler blev inkuberet med 1 ug /ml topotecan og /eller 10 pg /mL CQ i 24 timer. Lysaterne blev analyseret ved immunoblotting med p62 antistoffer. HCT116-celler blev inkuberet med de angivne koncentrationer af topotecan eller en kombination af topotecan og 10 ug /ml CQ i 24 timer. Mængden af ​​celledød blev kvantificeret ved anvendelse af PI-farvning-assay ved flowcytometri. Data i D er gennemsnit ± s.d. (

n

= 3). *

P

0,05, **

P

. 0,01, Students

t

test

Interessant, i modsætning til den celler med vildtype p53, inhibering af autofagi af CK i p53 mutantceller blokerede celledød induceret af topotecan behandling (fig. 3A). Endvidere i celler, hvor p53-genet var blevet somatisk slået ud (HCT116 p53

– /-), inhiberingen af ​​autophagy af CQ behandling også blokeret topotecan-induceret celledød (figur 3B.). Tilsvarende har inhibering af autophagy af Atg5 depletering ikke sensibilisere HCT116 p53 – /- celler over for topotecan-induceret celledød (figur 3C og fig S3B..). Sammenfattende inhiberingen af ​​autofagi sensibiliserede colon- cancerceller med vildtype p53 til behandling med topotecan; imidlertid topotecan-induceret celledød blev lindret i p53 knockout celler efter autophagy hæmning.

HT29, SW480 og SW620-celler blev inkuberet med de angivne koncentrationer af topotecan eller en kombination af topotecan og 10 ug /ml CQ i 24 timer. Mængden af ​​celledød blev kvantificeret ved anvendelse af PI-farvning-assay ved flowcytometri. Data i A er middel ± s.d. (

n

= 3). *

P

0,05, **

P

0,01, Students

t

test B. HCT116 p53

+ /+ og HCT116 p53

– /- celler blev dyrket ved 6000 celler per brønd i en plade med 96 brønde og udsat for forskellige koncentrationer af TPT (0,0625 til 2 pg /ml) og /eller 10 pg /mL CQ i 72 timer. Niveauet af vækstinhibering blev påvist under anvendelse af MTT-assayet. C. lysater fra HCT116 p53

– /- celler transficeret med vektoren eller Atg5 shRNA blev analyseret ved immunblotting. MTT-assayet blev anvendt til at analysere niveauet af cellevækstinhiberingen. Data i B, C er gennemsnit ± s.d. (

n

= 3).

P

. 0,05, Students

t

test

Topotecan-induceret Autophagy blev medieret af p53 Gennem Aktivering af Sestrin 2 og AMPK i Colon Cancer Cells med vildtype p53

p53 tumor suppressor aktiveres ved flere forskellige typer DNA-skader og til gengæld inhiberer celleproliferation gennem induktion af specifikke målgener [40]. Således har vi siden forsøgt at undersøge, om P53 og dets målgener var involveret i topotecan-induceret-autofagi. Som forventet, topotecan behandling stimulerede en stigning i niveauet af P53 på en dosis-afhængig måde i HCT116 og LS174T cellelinier. Endvidere topotecan behandling også øget ekspression af P53 målgenet, sestrin 2. phosphorylering af AMPK blev også steg markant efter topotecan eksponering (fig. 4A og fig. S4A). Derudover behandling med siRNAs targeting p53 eller sestrin 2 effektivt ophævede den topotecan-induceret AMPK aktivering og LC3-II akkumulering (fig. 4B og fig. S4b). Disse resultater tyder på, at P53 medierer topotecan-induceret autophagy gennem aktivering af sestrin 2 og AMPK i kolon kræftceller med vildtype p53.

A. HCT116 og LS-174T-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af TPT i 24 timer. Niveauerne af p53, sestrin2 og p-AMPK blev analyseret ved immunblotting. B. HCT116-celler blev transficeret med p53 eller sestrin 2 siRNAs i 24 timer, behandlet med eller uden 1 pg /mL TPT i yderligere 24 timer, og de angivne proteiner blev derefter analyseret ved immunblotting. C. HCT116-celler blev transficeret med LKB1 eller CaMKKβ siRNAs, behandlet med eller uden 1 pg /mL TPT i yderligere 24 timer, og de angivne proteiner blev påvist ved immunoblotting.

Ca

2 + /calmodulin-afhængig kinase β (CaMKKβ) kan phosphorylere og aktivere AMPK som reaktion på øget calcium niveauer [41], [42]. Undersøgelser har også vist, at LKB1 serin-threoninkinase er påkrævet for aktivering af AMPK som reaktion på stress [43]. AMPK kan phosphoryleres af transformerende vækstfaktor-β-aktiveret kinase 1 (TAK1), som aktiverer AMPK ved TRAIL behandling [14]. For at undersøge, om disse kendte AMPK-aktivatorer var involveret i denne proces, blev udtryk for LKB1 og CaMKKβ slået ned ved hjælp af siRNA. Resultaterne viste, at selv efter en effektiv udtømning af LKB1 og CaMKKβ hverken topotecan-induceret AMPK aktivering eller LC3-II akkumulation blev påvirket (fig. 4C og fig. S4C).

Topotecan Behandling induceret Autophagy Gennem den AMPK-medieret hæmning af mTORC1 i Wild-type p53 Colon Cancer Cells

AMPK spiller en central rolle i at opretholde energi homeostase og autophagy aktivering [44]. At undersøge virkningen af ​​topotecan behandling på AMPK aktivitet, blev HCT116 og LS-174T celler eksponeret for topotecan på en dosis- og tidsafhængig måde. Topotecan behandling noteably aktiveret AMPK i de to testede cellelinier med vildtype-p53, hvilket blev vist ved phosphoryleringen af ​​AMPKα ved det aktive sted rest Thr172 (Fig. 5A og fig. S5A). Også, topotecan behandling inducerede en hurtig og vedvarende aktivering af AMPK, som var tydeligt ved en stigning i phosphorylering af acetyl-CoA-carboxylase (ACC), en velkendt AMPK substrat, på Ser79 (fig. 5B Fig. S5B). Undersøgelser har vist, at mTOR kan føle ændringer i den cellulære energitilstand gennem AMP-aktiveret protein kinase (AMPK), og inhiberingen af ​​mTORC1 af AMPK kan øge autofagi [45]. I overensstemmelse med disse resultater, fandt vi, at topotecan behandling inhiberede mTORC1 pathway, som var tydeligt ved en reduceret phosphorylering af ribosomal protein S6 kinase 1 (p70S6K), en direkte mTORC1 substrat (fig. 5A og fig. S5A).

HCT116 og LS-174T-celler blev behandlet med TPT i 24 timer. Ekspressionsniveauerne for de angivne proteiner blev analyseret ved immunblotting. B. HCT116-celler blev behandlet med 1 ug /ml TPT i de angivne tidsrum. Cellelysaterne blev analyseret ved immunblotting med phospho-ACC-antistoffer. C. Cellerne blev behandlet med 1 ug /ml TPT og /eller 20 pM forbindelse C i 24 timer, og ekspressionsniveauerne af de angivne proteiner blev analyseret ved immunblotting. D. HCT116-celler blev transficeret med kontrol eller AMPKα siRNAs i 48 timer, behandlet med eller uden 1 mikrogram /ml TPT, og niveauet af de angivne proteiner blev efterfølgende analyseret ved immunblotting.

For at bestemme om AMPK aktivitet var nødvendig for topotecan-induceret autophagy, vi hæmmede aktiviteten af ​​AMPK under anvendelse af en farmakologisk inhibitor eller RNA-interferens. Forbehandlingen af ​​cancercellerne med 20 pM forbindelse C, en potent og selektiv AMPK inhibitor, effektivt forhindret topotecan-induceret AMPK aktivering. Samtidig blev topotecan-induceret LC3-II akkumulering også blokeret af forbindelse C behandling. Disse resultater indikerer, at autofagi blev inhiberet ved AMPK inhibering (fig. 5C og fig. S5C). Nedbrydningen af ​​den katalytiske α1-underenhed af AMPK hjælp siRNA bekræftede også disse resultater. Inhiberingen af ​​AMPK aktivitet faktisk blokeret induktion af autophagy, som var tydeligt ved niveauet for LC3-II (fig. 5D og fig. S5D). Desuden udtømningen af ​​AMPKα restaureret p70S6K aktivitet, hvilket indikerede, at hæmning af mTORC1 var lettet (fig. 5D og fig. S5D). Disse data tyder på, at autofagi induceret af DNA-skadelige middel, topotecan, afhænger af AMPK-medieret hæmning af mTORC1.

Hæmningen af ​​AMPK aktivering Øget følsomhed for Human Colon Cancer Cells med Wild-typen p53 men ikke mutant p53 til topotecan behandling

for at bekræfte, om AMPK aktivitet var nødvendig for cellernes levedygtighed efter topotecan behandling i cancerceller med vildtype eller mutant p53, human tyktarmskræft celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af topotecan i nærvær eller fravær af AMPK inhibitor, sammensatte C. Som vist i fig. 6, den kombinerede behandling af topotecan med forbindelse C resulterede i en øget grad af cytotoksicitet i humane colon cancerceller med vildtype p53 (HCT116 og LS174-T-cellelinjer). Men forbindelse C behandling ikke bevidstgøre celler med mutant p53 (HT29, SW480 og SW620 cellelinjer) til topotecan behandling. Baseret på disse resultater, konkluderede vi, at aktiveringen af ​​AMPK fungerer som en central mediator i induktionen af ​​cytobeskyttende autofagi som respons på DNA-skade i tyktarmskræft celler indeholdende vildtype p53, men ikke mutant p53. Salg

Forskellige celler blev dyrket ved 6000-8000 celler pr brønd i en plade med 96 brønde og udsat for forskellige koncentrationer af TPT (0,15 til 2,5 ug /ml) og /eller 10 pM forbindelse C i 72 timer. Niveauet af vækstinhibering blev påvist under anvendelse af MTT-assayet. Data er middelværdier ± s.d. (

n

= 3).

P

0,05, Students

t

test

Anti-tumor aktiviteten af ​​topotecan i kombination med Autophagy Inhibitor i en HCT116 human tyktarmskræft xenograft. model

for at udforske in vivo effektiviteten af ​​autophagy inhibitor CQ at bevidstgøre vildtype p53 menneske tyktarmskræft celler til topotecan behandling blev en xenograftmodel i nøgne mus genereret. Athymiske nøgne mus blev injiceret subkutant med 4 × 10

6 HCT116 p53

+ /+ eller HCT116 p53

– /- kræftceller, og de resulterende tumorer fik lov at vokse i ca. 5 d for at frembringe en gennemsnitlig tumor volumen på 40 mm

3 før lægemiddelbehandling. De antitumorvirkninger af topotecan, CQ, eller en kombinationsbehandling af de to lægemidler blev evalueret i HCT116 p53

+ /+ og HCT116 p53

– /- xenotransplantater. Topotecan blev administreret intraperitonealt en gang hver 4. d (2 mg /kg), og CQ blev administreret intraperitonealt en gang dagligt (10 mg /kg). Som vist i fig. 7, blev en forsinkelse i tumorvækst observeret med topotecan behandling alene, og kombinationen af ​​CQ med topotecan behandling øget anti-tumor effekt i HCT116 p53

+ /+ xenograftmodel. Imidlertid blev det anti-tumor effekt af CQ ikke forøget ved kombinationsbehandling med topotecan i HCT116 p53

– /- xenograftmodel. Tværtimod kombinationen lægemiddelbehandling syntes at forringe anti-tumor aktiviteten af ​​topotecan i denne model.

athymiske nøgne mus blev injiceret subkutant med 4 × 10

6 HCT116 p53

+ /+ eller HCT116 p53

– /- kræftceller. Seks mus blev tildelt til hver af behandlingsgrupperne. Tumorerne fik lov at vokse i ca. 5 d for at frembringe en gennemsnitlig tumorvolumen på 40 mm

3 før lægemiddelbehandling. Topotecan blev administreret intraperitonealt en gang hver 4. d (2 mg /kg), og CQ blev intraperitonealt administreret dagligt (10 mg /kg). Den tumorvækst blev målt hver 4. dag ifølge fremgangsmåden beskrevet i afsnittet “Materialer og metoder” metode. Resultater er præsenteret som middelværdi ± s.d. (

n

= 6). *

P

. 0,05, Students

t

test

Desuden effekten af ​​AMPK inhibitor forbindelse C i kombination med topotecan på xenograftmodel var undersøgt. Efter at have fastslået virkningen in vitro for AMPK inhibitor-induceret chemosensitization til topotecan i p53 vild type human colon cancerceller blev xenograftmodellen i nøgne mus genereres at undersøge, om AMPK inhibering var involveret i chemosensitization til topotecan in vivo. Som vist i fig. S6, forbindelse C spillede en lignende rolle som CK i kombination med topotecan behandling. Forbindelse C kan øge antitumor effekt i kombination med topotecan i HCT116 p53 + /+, men ikke p53 – /-. Xenograftmodel

Derfor tyder vore resultater, at inhiberingen af ​​autofagi sensibiliserer coloncancer-celler med vildtype-p53 til DNA-ødelæggende lægemidler. Da AMPK fungerer som en central mediator i induktionen af ​​cytobeskyttende autofagi som respons på DNA-skade, kunne inhibering af AMPK også øge virkningen af ​​DNA-ødelæggende lægemidler til colon cancerceller med vildtype-p53.

Diskussion

Autophagy er en evolutionært bevaret lysosomal self-fordøjelsesprocessen. Virkningerne af autophagy i tumorigenese og kræft terapi er paradoksalt. Det er blevet rapporteret, at autofagi er i stand til at undertrykke tumorigenese ved at holde genomisk stabilitet og eliminering af P62. Men at udnytte autophagy som en cytobeskyttende mekanisme, tumorceller styre, for at overleve i barske mikromiljø. Som svar på mange anticancer behandlinger, er autophagy induceret som en pro-overlevelse strategi i humane cancerceller eller en medvirkende antitumorvirkningen. Derfor bør der gøres en stor indsats for at øge hvad beslutter cytobeskyttende og celledræbende funktioner autophagy, hvilket er afgørende i at målrette på de rigtige autophagic signalveje, der gør kræftbehandlingen mere lovende. Heri, fandt vi, at vildtype p53-medieret AMPK aktivering resulterede i cytobeskyttende autofagi som svar på DNA-skadelige stof topotecan i humane coloncancer-celler. Inhiberingen af ​​autofagi sensibiliserede colon- cancerceller med vildtype p53 til behandling med topotecan; dog autophagy hæmning svækkede antitumorvirkningen af ​​topotecan behandling i p53 mutant eller knockout colon cancerceller både in vitro og in vivo. Bortset fra kendte mekanismer, foreslog vi, at p53 kunne modulere autofagi og foreslog, at p53 status kunne bestemme celle skæbne efter DNA-skader drug topotecan-induceret autophagy og medvirke til at fastholde autophagic homeostase.

Med hensyn til kræft, findes mange links mellem autophagy og p53. I den foreliggende undersøgelse har vi fokuseret på skæbnen for autophagic cancerceller som reaktion på en DNA beskadigelse middel under forskellige p53-status. Først viser vi, at flere tyktarmskræft cellelinjer, herunder p53 vildtype og p53 mutant /knockout humane coloncancer-celler, udviser morfologisk og biokemiske træk karakteristiske for celler, som undergår autofagi efter behandling med DNA-skadelige stof topotecan. Desuden blokering af autophagy ved udtømning af Atg5 eller beclin 1 af RNA-interferens eller chloroquin behandling, men som lindres cytotoksicitet af topotecan i kræftceller med mutant p53 eller p53 knockout. Som vi kendte, bør topotecan ikke kun gøre DNA-skader, men også anholde celler til G1 /S anholdelse eller G2 /M anholdelse afhængig distinkte cellelinier. For at undersøge, om cellecyklusstandsningen er nok til at inducere forstærket celledød efter hæmning autophagy, brugte vi vincristin (VCR) som en anden type af anti-cancer medicin til at bekræfte vores resultater. VCR binder til tubulindimerer, inhibering samling af mikrotubuli strukturer. Afbrydelse af mikrotubuli arresterer mitose i metafase. I vores undersøgelse, at sammenligne med video behandling kun, kombination med autophagy inhibitor gør ingen stor forskel på coloncancerceller uanset status for p53 (fig. S7). Resultaterne antydede, at topotecan-medieret celledød og cytobeskyttende autofagi kunne være forbundet med DNA-skader i tyktarmen kræftceller. Vores tidligere undersøgelser har vist, at autofagi bidrager til celledød i CNE2 celler med mutant p53 og Hep3B celler, som er p53 deficient [46], [47], [48]. Selv om det forekommer rationelt at se p53 for sine proapoptotiske aktiviteter, viste vi, at forlængelse af celleoverlevelse gennem autophagy induktion var også en iboende egenskab af vildtype p53. Sådan cytobeskyttende funktion kan være relateret til den rolle, som vildtype p53 og autofagi i at opretholde intracellulær metabolisk homeostase. Men nogle kræftceller med mutant p53 eller p53 knockout mistet denne prosurvival træk ved autofagi. Faktisk kan blokering af autofagi fremme celledød i disse betingelser. Vores resultater sluttede et stigende antal eksempler, hvad er den funktion af autophagy i kræftbehandlingen, og hvad afgør skæbnen for autophagic kræftceller.

De mekanismer, hvorved vildtype p53 inducerer cytobeskyttende autofagi tilsyneladende primært skyldes den transkriptionelle styring af mTOR pathway regulatorer. Faktisk, flere p53-målgener, såsom AMPK, TSC2, og PTEN, er alle kendt negative regulatorer af mTORC1. Bemærkelsesværdigt, to p53 målgener, sestrin1 og sestrin2, er blevet identificeret som en kritisk sammenhæng mellem p53 aktivering og mTORC1 aktivitet [31], [49], [50]. På dette grundlag, vi antaget, at vildtype p53 og dets mål, sestrin 2, kunne aktivere AMPK, hæmmer mTORC1 og fremme celle overlevelse ved at muliggøre en cytobeskyttende autofagi som reaktion på topotecan. Baseret på data, der er vist i denne undersøgelse synes denne hypotese korrekt. Men to velkendte AMPK aktivatorer, LKB1 og CaMKKβ, var ikke ansvarlig for topotecan-induceret aktivering af AMPK og den deraf autofagi. Som forventet blev AMPK aktivering og phospho-p70S6K hæmning ikke observeret efter topotecan behandling i p53 mutant celler (Fig. S8). Endvidere vore data viser, at inhiberingen af ​​AMPK forøget cellulær følsomhed over for topotecan behandling i p53 vild type cancerceller, men ikke i p53 mutantceller. Vores resultater antyder, at i vildtype p53 colon cancerceller, men ikke mutant p53 celler, p53 aktiverede AMPK fungerer som en central mediator i induktionen af ​​cytobeskyttende autofagi som respons på DNA beskadigelse.

Kollektivt, den skæbne autophagic cancerceller sandsynligvis afviger mellem celler med forskellig p53 status. I tilfælde af cancerceller med vildtype p53, p53 fremmer overlevelsen faktor AMPK. Som et resultat, kan aktive AMPK fremme autofagi at beskytte kræftceller at modvirke cytotoksiciteten forårsaget af DNA-ødelæggende middel. Omvendt kunne p53 mutant eller tab ikke aktivere AMPK, men kunne fremme andre “stress-aktiveret protein kinase” såsom c-Jun NH2-terminale kinaser, tvinge et højt autophagy satser, og i sidste ende medføre autophagic celledød. Endvidere bekræfter vi, at inhibering af autofagi sensibiliserede colon- cancerceller med vildtype p53, som i modsætning inhiberede antitumorvirkning i dem med p53 knockout på DNA-skade behandling vivo. Derfor er vores undersøgelse, en potentiel behandling strategi, hvor kombinationen af ​​DNA-skade midler med autophagy inhibitor blev anvendt i cancerceller med vildtype p53 imidlertid kombinationen af ​​DNA-ødelæggende lægemidler og Autophagy induktorer kan udvikles til en nyttig strategi til behandling kræftformer udtrykker mutant p53 eller p53 knockout.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse og eksperimentelle protokoller blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Sun Yat- Sen University med tilladelse nummer 11002A.

Cell Culture

HCT116 blev LS174-T, SW480, SW620 og HT29-celler dyrket i DMEM medium suppleret med 10% FBS (varmeinaktiveret ved 56 ° C i 30 minutter), og de passende mængder af penicillin og streptomycin i en 37 ° C inkubator med en befugtet 5% CO

2 atmosfære. Den HCT116 p53

– /- cellelinje blev venligst stillet til rådighed af professor Jing-Xuan Pan (Sun-Yat Sen University, Kina)

Konfokal Mikroskopi og indirekte immunofluorescens

Cellerne var. transient transficeret med en gul fluorescerende protein (YFP) -mærket LC3 ekspressionsvektor under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11.668.019). Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne behandlet med topotecan. Efter en 24 timer topotecan behandling blev cellerne fikseret med 4% paraformaldehyd og undersøges under et laser-scanning konfokal mikroskop (Olympus, FV-1000).

RNA Interference

Cellerne blev transficeret