Abstrakt
Muskelsvind, der opstår med kræft kakeksi er forårsaget af en ubalance i satserne for muskel proteinsyntese og nedbrydning.
Apc
Min /+
mus er en model af kolorektal cancer, der udvikler kakeksi, der er afhængig af cirkulerende IL-6. Men den IL-6 regulering af muskel protein omsætning i initiering og progression af kakeksi i
Apc
Min /+
mus er ikke kendt. Kakeksi progression blev undersøgt i
Apc
Min /+
mus, der enten vægt stabil (WS) eller haft indledende (≤5%), mellemprodukt (6-19%), eller ekstrem (≥20% ) vægttab. Indledningen af kakeksi reduceret% MPS 19% og en yderligere -50% med yderligere vægttab. Muskel IGF-1 mRNA ekspression og mTOR mål blev undertrykt med progressionen af vægttab, mens muskel AMPK fosforylering (Thr 172), AMPK aktivitet, og raptor fosforylering (Ser 792) ikke blev forøget med indledningen af vægttab, men var induceret som kakeksi skred frem. ATP afhængig proteinnedbrydning steg i initiering og progression af kakeksi. Imidlertid blev ATP uafhængig protein nedbrydning ikke øges, indtil kakeksi havde udviklet sig ud over den indledende fase. IL-6-receptor-antistof administration forhindrede krop vægttab og undertrykt muskel protein nedbrydning, uden nogen effekt på muskel% MPS eller IGF-1 associeret signalering. Sammenfattende er MPS nedsættelse% i indledningen af kakeksi associeret med IGF-1 /mTOR signalering undertrykkelse, mens muskel AMPK aktivering og aktivering af ATP uafhængig proteinnedbrydning forekomme senere i udviklingen af kakeksi. IL-6-receptor-antistof behandling blokeret cachexia progression gennem suppression af muskel proteinnedbrydning, mens ikke redde undertrykkelse af muskel proteinsyntese. Dæmpning af IL-6-signalering var effektive til at blokere udviklingen af kakeksi, men ikke tilstrækkeligt til at vende processen
Henvisning:. White JP, Baynes JW, Welle SL, Kostek MC, Matesic LE, Sato S, et al. (2011) Forordningen af Skeletal Muscle Protein Omsætning under Progression af Cancer Kakeksi i
Apc
Min /+
Mouse. PLoS ONE 6 (9): e24650. doi: 10,1371 /journal.pone.0024650
Redaktør: Se-Jin Lee, Johns Hopkins University School of Medicine, USA
Modtaget: Februar 28, 2011; Accepteret: August 16, 2011; Udgivet: 19 September, 2011
Copyright: © 2011 White et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af tilskud 5R01CA121249 fra Nation Institutes of Health (NIH), og National Cancer Institute (NCI) til Dr. Carson. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Skeletal muskelmasse tab er kendetegnende for kakeksi, og muskelmasse bevarelse er afgørende for overlevelsen af mange kræftpatienter [1]. Ofte kræftpatienter ikke diagnosticeret indtil signifikant vægttab er opstået [2], som begrænser behandlingsmuligheder i kakektiske patienter [3]. I modsætning hertil patienter diagnosticeret under indledende faser af kakeksi ( 5% vægttab) har en langt bedre overlevelse tid og kemoterapi behandlingsresultater [5] – [6]. Forståelse reguleringen af muskelsvind hele progression af kakeksi er afgørende for at udvikle både forebyggelses- og interventions- til behandling af kakeksi [4]. Desværre har vi en begrænset forståelse af muskel protein omsætning regulering i de indledende faser af kakeksi. Endvidere progressionen af muskelsvind accelererer under progressionen af kakeksi [5]. Denne ikke-lineær proces skaber huller i vores viden, som er baseret i vid udstrækning på regulatoriske ændringer i de senere stadier af kakeksi.
Den cellulære signalering, der forstyrrer den fine balance mellem satserne for muskel proteinsyntese og nedbrydning menes som en afgørende fundament nødvendig for en bedre mekanistisk forståelse af muskelsvind med cancer. Mens accelereret muskel protein nedbrydning har erkendt betydning for udviklingen af spild, reguleringen af proteolytiske mekanismer i hele udviklingen af kakeksi er fortsat usikker. Muskel proteolyse, primært gennem ubiquitin afhængige mekanismer, er steget i sent stadium kakeksi [6], mens en enkelt rapport har rapporteret nogen forskel i muskel proteolyse i de indledende faser af kakeksi i tumor bærende mus [7]. Tilsvarende rolle proteinsyntese under progressionen af kakeksi er usikker. Mens reduktion i proteinsyntesen er blevet vist hos patienter med sent stadium kakeksi [8], og i tumorbærende mus, der har mindst en reduktion i kropsvægt 16% [7], regulering i de indledende faser af kakeksi og eventuel overgang til svær vægttab garanterer yderligere udforskning.
musklen evne til at syntetisere protein er lydhør over for mange stimuli, herunder energi status, anabolske hormoner, kataboliske hormoner, og lastning [9]. Insulin-lignende vækstfaktor-1 (IGF-1) signalering via PI3K /Akt /mTOR pathway kan integrere feedback fra en række vækstrelaterede stimuli til at regulere myofiber størrelse [10]. Cirkulerende IGF-1 og muskel IGF-1 genekspression er generelt faldet med spilde betingelser [11] herunder kakeksi [12], [13]. Desuden er muskel mTOR aktivering også reduceret efter mindst et tab på 12% af kropsvægten og falder yderligere i sent stadium kakeksi [14], [15]. IGF-1 signalering kan også regulere muskel protein nedbrydning gennem undertrykkelse af forkhead kasse O (FOXO), hvis transkriptionelle mål omfatter muskel atrogin-1 /MAFbx, Muscle ringfinger-1 (MuRF1) og autofagi gener [16], [ ,,,0],17], [18]. Muscle 5′-adenosinmonophosphat-aktiveret protein kinase (AMPK), en sensor af cellulær energi status, regulerer også proteinsyntesen [19], [20], [21]. AMPK aktiveres ved lav cellulær energi status og også muskelsammentrækning [22]. AMPK kan hæmme mTOR signalering gennem flere mekanismer, herunder phosphorylering af raptor på Ser792 [23], som forhindrer binding og efterfølgende phosphorylering af p70S6K og 4EBP1. Desuden har AMPK aktivering vist sig at øge proteinnedbrydning i myorør, idet forbundet med en stigning i FOXO transkriptionelle mål atrogin1 og MuRF1 [24]. I tumor bærende rotter og mus, er aktiveringen af AMPK under udviklingen af kakeksi vist sig at være variabel og er vanskelige at fortolke sin rolle i reguleringen af muskelsvind med kakeksi [25]. Nærværende undersøgelse har til formål at præcisere, hvilken rolle AMPK i reguleringen af muskel protein omsætning under kakeksi.
Der er spirende tegn for lysosomal /autofagi til at spille en rolle under muskelsvindsygdom [26], [27]. I lighed med andre metoder til muskelnedbrydning, autofagi er en vigtig proces i skeletmuskulatur kræves for at fjerne organeller, dvs. mitochondrier og dele af cytoplasmaet [28]. Sletning af Atg7, en kritisk gen involveret i autophagy, resulterer i skeletmuskelatrofi, unormal mitokondrier og forvaltningsmæssigt sarkomerer [29]. I modsætning til ubiquitin-systemet, autofagi er ikke-specifik, ATP-uafhængige proces, som fordøjer dele af cellen snarere end individuelle proteiner. De molekylære komponenter i autofagi /lysosomale veje er godt beskrevet, men er forordningen ikke velkendt. Adskillige gener er blevet identificeret som autofagi-relaterede herunder, LC3β, Gabarpl1, Atg12l, PI3kIII, Ulk2, Atg4β og Beclin1. Der har været rapporter, der viser autofagi gener stige i muskel dystrofi [30], diabetes [31], sepsis-induceret spilde [27] og kræft relaterede kakeksi [31], [32].
Pro- inflammatoriske cytokin IL-6 er blevet impliceret i reguleringen af muskelsvind under kakeksi hos både mennesker og gnavere [33]. Transgene mus, der overudtrykker IL-6 har muskelatrofi associeret med forøget ekspression af lysosomale og ubiquitin-relaterede mRNA og proteiner [34], [35]. Hos mennesker kan IL-6 administration forårsage en reduktion i skeletmuskulatur proteinsyntese [36]. På grund af kataboliske effekter, som kan medieres gennem IL-6 under kakeksi, er der blevet foreslået adskillige terapier til at inhibere IL-6 aktivitet for at forhindre progression af kakeksi. Indgivelsen af en IL-6-receptor-antistof har effektivt imødegås muskelsvind i tumor-bærende mus [36], [37]. Endvidere kan inhibering af IL-6 aktivitet reducere både ubiquitin og lysosomal nedbrydningsveje i musculus gastrocnemius af C-26 tumor-bærende mus [37]. Disse data antyder, at IL-6-inhibering kan reducere muskel proteinnedbrydning; imidlertid har effekt på muskel proteinsyntese ikke blevet undersøgt. Yderligere arbejde er nødvendigt for at belyse den tilhørende mellem IL-6-signalering og muskel proteinsyntese under udviklingen af kakeksi. Vi har tidligere rapporteret muskelsvind i
Apc
Min /+
musen til at være afhængig af cirkulerende pro-inflammatoriske cytokin IL-6 [38], [39]. Men reguleringen af protein omsætning i initiering og progression til mere alvorlige tab er ikke blevet godt undersøgt under kakeksi. Formålet med denne undersøgelse var at bestemme IL-6 regulering af muskel protein omsætning i indledningen af og progression i retning af mere alvorlig kakeksi i
Apc
Min /+
mus. Vi måles direkte muskel proteinsyntese, muskelprotein nedbrydning og tilhørende signalering under forskellige stadier af vægttab. Vi undersøgte også, hvis IL-6 receptor signalering var vigtigt for reguleringen af disse processer under udviklingen af kakeksi. Relateret til processer initierende kakeksi, vi hypotese, at proteinsyntese kun ville blive reduceret i løbet af sene stadier af kakeksi, mens ATP afhængig protein nedbrydning ville være hovedansvarlig for indledningen af muskel tab. Efter indledningen af kakeksi, vi hypotese, at undertrykkelsen af IL-6-signalering ville redde muskelmasse gennem induktion af muskel proteinsyntese og undertrykkelse af ATP afhængige protein nedbrydning.
Metoder
Dyr
The University of South Carolinas Institutional Animal Care og brug Udvalg godkendte alle dyreforsøg i denne undersøgelse.
Apc
Min /+
mus på en C57BL /6 baggrund blev oprindeligt købt hos Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) og opdrættet på University of South Carolina Animal Resource Facility som tidligere beskrevet [40]. Mand
Apc
Min /+
(n = 21) -mus mellem 14 og 20 uger gamle, blev huset i grupper og aflivet i en alder, der er fastsat lagdeling af vægttab for at tillade undersøgelse af progressionen af kakeksi . De 4 grupper anvendt i denne undersøgelse var vægt stabil (WS, n = 5), første (≤5%, n = 6), mellemprodukt (6-19%, n = 4), og ekstrem (≥20%, N = 6) grader af tab af kropsvægt, sammenlignet med peak kropsvægt. For at blokere progression af kakeksi, et separat sæt
Apc
Min /+
mus blev behandlet med en IL-6-receptor-antistof (n = 5) eller PBS-kontrol (n = 7) i to uger , begyndende ved efter udbrud af kakeksi (16 uger). Vildtype C57BL /6 kontroller blev også behandlet med IL-6-receptor-antistof (n = 6) eller PBS-kontrol (n = 6) ved 16 uger. Rummet blev opretholdt på en 12:12 light:dark cyklus med lyset, der starter ved 0700. Mus blev leveret standard gnaverfoder (Harlan Teklad Rodent Diet, # 8604, Madison, WI) og vand
ad libitum
.
muskel Collection
Mus fik en subkutan injektion af ketamin /xylazin /acepromazin cocktail (1,4 ml /kg legemsvægt) før gastrocnemius blev dissekeret. Tibia længde blev målt som en indikator for dyrekroppen størrelse og en korrektionsfaktor for skeletmuskulaturen vægte. Tredive minutter inden aflivning blev alle musene en intraperitoneal injektion af 150 mM
2H
5-phenylalanin (Cambridge Isotope Laboratories) i en 75 mM NaCl-opløsning i en dosis på 2 ml /100 g legemsvægt [41 ]. Ved aflivning blev gastrocnemius muskler skyllet i PBS, lynfrosset i flydende nitrogen, vejet og opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere analyse.
tarmvæv Collection
tarmvæv samling blev udført som tidligere beskrevet med en mindre ændring [39], [42], [43], [44]. Kort fortalt blev tyndtarmen omhyggeligt skåret ved den distale ende af maven og ved den proximale ende af coecum. Tyktarmen blev fjernet fra den distale ende af coecum til anus. Mesenteriet fedtvæv blev fjernet med pincet og tyndtarmen blev skåret i fire lige store dele. Alle tarm sektioner blev skyllet med PBS, åbnede på langs med en saks, og fladtrykt med en vatpind mellem to stykker trækpapir. Intestinale snit blev fikseret i 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS natten over og overført til PBS til opbevaring ved 4 ° C til yderligere analyse.
Polyp Tæller
polyp tællinger blev udført som tidligere beskrevet [ ,,,0],39], [42], [43], [44]. Kort fortalt 4% PFA-faste tarm sektioner fra alle dyr blev kortvarigt farvet i 0,1% methylenblåt, og de blev placeret under et dissektionsmikroskop. Polypper taltes af samme investigator i en blind måde. Polypper blev kategoriseret som store ( 2 mm i diameter), mellemprodukt (1~2 mm) eller lille ( 1 mm).
IL-6-receptor-antistof Administration
MR16 -1 IL-6-receptor-antistof var en generøs gave fra Chugai Pharmaceutical CO., LTD, Tokyo, Japan. Antistoffet blev indgivet i en dosis på 300 ug /mus i phosphatpufret saltvand ved intraperitoneal injektion hver tredje dag i to uger begyndende ved 16 ugers alderen. PBS blev injiceret som en kontrol køretøj.
myofibrillar proteinsyntese
musculus gastrocnemius prøver blev homogeniseret i 1 ml vand. Myofibriller og andre uopløselige proteiner blev pelleteret ved centrifugering, og supernatanterne indeholdende frie aminosyrer blev anvendt til at bestemme forholdet imellem frit
2H
5-phenylalanin (m /z 239 fragment) endogen (umærket) phenylalanin (m /z 234 fragment). Forholdene blev bestemt ved GC-massespektrometrisk analyse af de
t
butyldimethylsilyl derivater af disse aminosyrer. Myofibrillære proteiner blev vasket, hydrolyseret, og analyseret for
2H
5-phenylalanin berigelse ved at overvåge m /z 237 og 239 fragmenter, som beskrevet i detaljer af Welle et al. [41].
fraktioneret på myofibrillar syntese,% per dag, blev beregnet som% berigelse af sporstof i hydrolysatet af myofibrillært protein, divideret med sporstoffet berigelse i den frie aminosyre pulje af muskelvæv . Myofibrillært protein berigelse blev bestemt ud fra m /z 237 og m /z 239 ioner fordi den letteste isotopomer (m /z 234) mættet MS-detektor. Den myofibrillar /gratis berigelse forholdet blev ganget med 48 for at få% /dag værdier, fordi sporstof inkorporering skete over en periode på 30 minutter.
Protein Nedbrydning
For at analysere nedbrydningen af opløseligt muskel protein, en modificeret proteasomalaktivitet proteolyse assay rapporteret af Hu et al [45] blev anvendes. Musculus gastrocnemius blev fjernet og frosset i flydende nitrogen. Muscle ekstrakter (-40 MGS) blev homogeniseret i iskold høst buffer (5 mM Tris-HCl (pH 8,8), 1% glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, frisk udgjorde 1 mm β-Me, og 50 mm EP -475). Homogenaterne blev centrifugeret ved 30.000 x
g
i 30 minutter, og derefter de opløselige fraktioner blev anvendt til at måle proteinnedbrydning. For proteinnedbrydning bestemmelse blev muscle ekstrakter dialyseres mod en basal puffer [20 mM Tris-HCI (pH 7,6) 10% glycerol, 2 mm dithiothreitol (DTT), 10 mm magnesiumacetat og 20 mm kaliumchlorid] for at fjerne ophobet tyrosin. Alikvoter af ekstrakter blev inkuberet i 2 timer ved 37 C med eller uden et ATP-generation af systemet (1 mm ATP, 100 pg /ml creatinkinase, og 10 mm phosphocreatin); ubiquitin (250 ug /ml) blev også tilsat. Reaktionen blev standset med trichloreddikesyre blev udfældede proteiner fjernet ved centrifugering, og frie tyrosin blev målt fluorometrisk (450 nm excitation /550 nm emission) til at beregne hastigheden af proteinnedbrydning [46].
AMPK Activity
AMPK aktivitet blev bestemt under anvendelse af et kit fra Linco (St. Louis, MO). Kort fortalt, blev hele muskler homogenater tilsat til en plade med 96 brønde overtrukket med AMPK substrat IRS-1, inkuberet i 2 timer, efterfulgt af tilsætning af et sekundært antistof konjugeret til peberrodsperoxidase (HRP) og specifikt for phosphoryleret Ser 794 i IRS -1. Endelig lysende middel blev tilsat til pladen at kvantificere fosfor-IRS-1 og bestemme AMPK aktivitet.
RNA Isolation, cDNA Synthesis, og Real Time PCR
RNA-isolering, cDNA-syntese, og realtids-PCR blev udført som tidligere beskrevet [47], under anvendelse af reagenser fra Applied Biosystems (Foster City, CA). Fluorescens mærkede prober for IGF-1, skeletal alfa aktin, C2 proteasomalaktivitet subunt, C7 proteasomalaktivitet underenhed, atrogin1, murf1 (FAM farvestof) og de ribosomale RNA 18s (VIC dye) blev indkøbt fra Applied Biosystems og kvantificeres med TaqMan Universal mastermiksens. Data blev analyseret ved ABI software ved hjælp tærskelcyklen (C
T), som er det cyklusantal, ved hvilken fluorescensemissionen er midtvejs mellem detektion og mætning af reaktionen.
Western Blotting
Western blot-analyse blev udført som tidligere beskrevet [48]. Kort fortalt blev frosne musculus gastrocnemius homogeniseret i Mueller-buffer og proteinkoncentrationen bestemmes ved Bradford-metoden [49]. Rå muskelhomogenat 40 ug blev fraktioneret på 6% -15% SDS-polyacrylamidgeler. Geler blev overført til PVDF-membraner natten over. Membraner blev farvet med Ponceau rød at verificere lige belastning af hver gel. Membraner blev blokeret natten over i 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand med 0,1% Tween-20 (TBS-T). Primære antistoffer til p-Akt (Ser473), Akt, p-4EBP1 (Ser65), 4EBP1, p-mTOR (Ser2448), mTOR, p-S6K (Thr389), S6K, p-AMPK (Thr172), AMPK, p- STAT3 (Tyr705), Stat3, p-Raptor (Ser792), Raptor, Beclin-1, Atg7, LC3β, Ubiquitin, atrogin1 (Cell signalering) og SOCS3 (Santa Cruz) blev fortyndet 1:1000 til 1:500 i 5% mælk i TBS-T efterfulgt af 1 times inkubering med membraner ved stuetemperatur. Anti-kanin IgG peberrodsperoxidasekonjugeret konjugeret sekundært antistof (Cell Signaling) blev inkuberet med membranerne ved 1:2000 fortyndinger i 1 time i 5% mælk i TBS-T. Forøget kemiluminescens (ECL) (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) blev anvendt til at visualisere antistof-antigen interaktioner. Billeder blev digitalt scannet og blot blev kvantificeret ved densitometri hjælp videnskabelige imaging software (Scion Image, Frederick, MD).
Statistisk analyse
En en måde ANOVA blev anvendt til at bestemme forskelle i
Apc
Min /+
mus med varierende grader af kroppen vejer tab. En tovejs ANOVA blev anvendt til at bestemme forskelle mellem genotype og IL-6-receptor-antistof-behandling. Post-hoc analyser blev udført med Student-Newman-Keuls metoder. En præ-planlagt t-test blev anvendt til at sammenligne vildtype-mus med vægt stabil
Apc
Min /+
i tabel 1. Betydning blev fastsat til p. 0,05
Resultater
Kropsvægt, fedtmasse og inflammatorisk tilstand under progression af kakeksi i
Apc
Min /+
mus
mus blev aflivet mellem 14.-20 ugers alderen, som er den aldersgruppe for kakeksi udvikling i
Apc
Min /+
mus, og kategoriseret efter procent vægttab på tidspunktet for ofre i forhold til deres højdepunkt kropsvægt. Grupperne blev betegnet som vægt stabil (ingen vægttab), ≤5% kropsvægt tab (indledende), 6-19% vægttab (mellemliggende) og ≥20% tab (ekstrem). Vægt stabil
Apc
Min /+
mus (14 uger), havde kropsvægt svarende til vildtypemus alderen-matchede (tabel 1). Under indledningen af kakeksi, cirkulerende IL-6 (
P
= 0,02; tabel 1) og milt vægt (
P
0,001) blev øget en smule i forhold til vægten stabil
Apc
Min /+
mus og steg yderligere med progression til formidlende organ vægttab (
P
0,001; tabel 1). Der var ingen yderligere ændring i cirkulerende IL-6 eller milt vægt under progression fra mellemprodukt for ekstreme vægttab. Epididymal fedtmasse blev reduceret med 63% (
P
0,001; tabel 1) under indledningen af kakeksi og fortsatte med at falde med progressionen af kakeksi (
P
0,001; Table 1). Tibia længde, et indeks for den samlede kropsstørrelse, var ikke forskellig mellem nogle grupper (tabel 1) indikerer, at normal knoglevækst blev opstår under udviklingen af kakeksi.
myofibrillært proteinsyntese reduceres under indledningen af kakeksi
Under indledningen af kakeksi,
Apc
Min /+
mus gastrocnemius muskelmasse faldt 17% (
P
= 0,001; tabel 1), og som kakeksi skred muskelmasse fortsatte med at falde (
P
0,001; figur 1A). Under indledningen af kakeksi var der en tilsvarende 19% reduktion i antallet af myofibrillært proteinsyntese (
P
= 0,001, figur 1A), som fortsatte med at falde yderligere med mellemliggende vægttab (
P
0,001). I modsætning til muskelmasse tab, var der ingen yderligere fald i antallet af myofibrillært proteinsyntese mellem
Apc
Min /+
mus udviser mellemliggende eller ekstrem vægttab. Gastrocnemius muskelmasse var korreleret (
P
= 0,003, figur 1B) med myofibrillar proteinsyntese sats i alle grupper af
Apc
Min /+
mus. Muskelmasse og proteinsyntese før kakeksi udvikling var ens mellem vildtype og vægt stabil
Apc
Min /+
mus (Figur S1A og B).
proteinsyntese og IGF 1-ekspression blev målt i
Apc
Min /+
mus under udviklingen af kakeksi. A) myofibrillært proteinsyntese. B) Sammenhæng mellem muskel vægte og proteinsyntese. C)
Øvre
: repræsentativ western blot af phosphorylerede og samlede former af Akt (Ser 473), mTOR (Ser2448), p70S6k (Thr389) og 4EBP-1 (Thr37 /46).
Lavere
: Forholdet mellem phosphoryleret og total Akt, mTOR, p70 og 4EBP1 i musculus gastrocnemius normaliseret til WS gruppen. D) IGF-1-ekspression og E) korrelation mellem IGF-1-genekspression og proteinsyntese. F) Skeletal alfa aktin-mRNA-ekspression. Værdier er middelværdier ± SE. Signifikans blev fastsat til p 0,05. † Betyder forskellig fra WS mus. Betegner forskel fra mus med ≤5% tab af kropsvægt. $ Betyder forskel fra mus med 6-19% tab af kropsvægt. WS, vægt stabil.
For at vurdere ændringer i cellulær signalering er involveret i reguleringen af proteinsyntese, vi målte IGF-1 /Akt /mTOR pathway aktivering under initiering og progression af kakeksi. Akt fosforylering (Ser 473), typisk i forbindelse med fremme muskel anabolisme, var uændret under initiering af kakeksi. Med overgangen til mellemliggende og ekstrem vægttab fandt vi muskel Akt fosforylering øges ca. 2 gange (
P
0,001; Figur 1C). Under indledningen af kakeksi, var der en tendens til mTOR phosphorylering på Ser-rest 2448 at falde (
P
= 0,06, figur 1C), medens phosphorylering af mTOR mål, p70 (Thr389) og 4EBP1 (Ser65), blev reduceret 20% (
P
= 0,001, figur 1C) og 55% (
P
0,001) under indledende faser af kakeksi henholdsvis. Med overgangen til mellemliggende vægttab, blev den mTOR (-50%), og p70 (-37%) fosforylering yderligere reduceret (
P
0,001; Figur 1C). Med ekstrem krop vægttab havde kun p70 fosforylering et yderligere fald (figur 1C)
Muskel IGF-1 mRNA-ekspression faldt 28% (
P
= 0,001, figur 1D). Under indledningen af kakeksi. Selvom IGF-1-mRNA-ekspression blev yderligere reduceret med mellemliggende vægttab (figur 1 D), var der ingen yderligere reduktion i muskel IGF-1-ekspression med ekstrem vægttab. Muskel IGF-1-ekspression og hastigheden af myofibrillært proteinsyntese blev korreleret på tværs af alle vægttab grupper (
P
= 0,03; Figur 1E). Muskel IGF-1-ekspression i vægt stabil
Apc
Min /+
og vildtypemus var ens (figur S1c). Trods reduktionen i myofibrillært proteinsyntese, fandt vi ingen effekt af kakeksi på skeletal alfa aktin-mRNA-ekspression (figur 1F), hvilket indebærer, at reduktionen i myofibrillært proteinsyntese ikke skyldes en reduktion i mRNA tilgængelighed.
Muskel AMPK fosforylering induceres under ekstrem kropsvægt
muskel AMPK fosforylering (Thr 172) og aktivitet ikke blev ændret under indledningen af kakeksi (figur 2A og 2B). Som kakeksi skred frem, blev både AMPK phosphorylering og aktivitet steg med mellemliggende vægttab, og øges yderligere med ekstrem vægttab (figur 2A og 2B). AMPK aktivitet og phosphorylering status var tilsvarende mellem vildtype og
Apc
Min /+
forud for udviklingen af kakeksi (fig S2A og B). AMPK kan hæmme mTOR aktivitet gennem flere mekanismer, det ene er fosforylering af raptor på Ser792. Ændringer i raptor fosforylering faldt sammen med AMPK fosforylering under udviklingen af kakeksi. Raptor fosforylering blev ikke steget i indledningen af kakeksi, men steg med mellemliggende vægttab og blev yderligere forøget med ekstrem vægttab (Figur 2C).
AMPK aktivering blev målt i
Apc
Min /+
mus under progressionen af kakeksi. A) AMPK aktivitet i musculus gastrocnemius normaliseret til WS mus. B)
Øvre
: repræsentativ Western blot af phosphoryleret AMPK (Thr172) og total AMPK i gastrocnemius.
Lavere
: Forholdet mellem fosforyleret til de samlede former for AMPK i gastrocnemius musklen. C)
Øvre
: repræsentativ western blot af fosforyleret raptor (Ser792) og total raptor i gastrocnemius.
Lavere
: Forholdet mellem fosforyleret til de samlede former for raptor i gastrocnemius musklen. Værdier er middelværdier ± SE. Signifikans blev fastsat til p 0,05. † Betyder forskellig fra WS mus. Betegner forskel fra mus med ≤5% tab af kropsvægt. $ Betyder forskel fra mus med 6-19% tab af kropsvægt. WS, vægt stabil.
Muscle proteinnedbrydning er reguleret af både ATP-afhængige og uafhængige processer
Samlet proteinnedbrydning, bestemt ved tyrosin release assay var ikke forskellig mellem vildtype og vægt stabil
Apc
Min /+
mus (figur S3). Imidlertid blev total nedbrydning øget med 45% (
P
= 0,001, figur 3A) i mus med indledende vægttab, mens nedbrydning blev forøget 134% og 188% i løbet af mellemliggende og ekstrem vægttab hhv. Den initiale stigning i proteinnedbrydning skyldtes ATP-afhængig nedbrydning. Under ekstreme kakeksi, var der en stigning i både ATP afhængig og uafhængig nedbrydning. I modsætning til ATP-afhængig nedbrydning, ATP uafhængig nedbrydning fortsatte med at stige med mere alvorlige vægttab (figur 3A). Total protein nedbrydning stærkt korreleret med gastrocnemius masse inden for alle grupper af vægttab (
P
0,001; figur 3B). Desuden blev protein nedbrydning signifikant korreleret til den procentdel af kroppens vægttab i
Apc
Min /+
mus (
P
0,001; figur 3C). For yderligere at undersøge rollen af ATP uafhængige og afhængige proteolytiske pathways, målte vi bestanddele af ubiquitin afhængige proteasomalaktivitet pathway. Under indledningen af kakeksi, muskelprotein ubiquitinering steg 56% (
P
= 0,001, figur 3D) og yderligere øget (
P
0,001) med større vægttab. C7 og C2 proteasomalaktivitet underenhedsekspression steget med 94% (
P
= 0,001) og 81% (
P
= 0,008, figur 3E) henholdsvis under initiering af kakeksi og yderligere øget med progression til ekstrem kakeksi. Der var ingen forskelle i ubiquitinering, C7 eller C2 udtryk mellem
Apc
Min /+
mus med mellemliggende og ekstrem vægttab.
Protein nedbrydning blev målt i
Apc
Min /+
mus med progressiv vægttab. A) proteinnedbrydning bestemt ved tyrosin release assay. Hvide søjler repræsenterer ATP afhængig nedbrydning; Sorte søjler repræsenterer ATP uafhængig nedbrydning. B) Korrelation mellem nedbrydning protein og gastrocnemius vægt. C) Korrelation mellem nedbrydning protein og procentdelen af vægttab. D)
Øvre
repræsentativt Western blot af ubiquitinerede proteiner i musculus gastrocnemius.
Lavere
Kvantificering af ubiquitinerede proteiner normaliseret at vægte stabile
APC
Min /+
mus. E) Gen-ekspression af C7 og C2 proteasomalaktivitet underenheder. F).
Øvre
: repræsentativ western blot af phosphorylerede og samlede former for Foxo3.
Lavere
: Forholdet mellem phosphoryleret og total Foxo3. G) genekspression af atrogin1 og MuRF1. H) repræsentative Western blot af atrogin1 protein. Værdier er middelværdier ± SE. Signifikans blev fastsat til p 0,05. † Betyder forskellig fra WS grupper. Betegner forskel fra mus med ≤5% tab af kropsvægt. WS, vægt stabil.
Akt signalering kan også regulere muskel nedbrydningsvej gennem phosphorylering og efterfølgende inhibering af transkriptionsfaktoren Foxo3 ved Ser 253. Under indledningen af kakeksi, blev Foxo3 phosphorylering reduceret med 39% (
P
= 0,001, figur 3F), og yderligere reduceret under overgangen til mellemliggende vægttab, men ikke yderligere reduceret med ekstrem vægttab (figur 3F). Atrogin-1 og MuRF1 mRNA-ekspression, Foxo reguleret muskel E3 ligaser, demonstrerede forskellige ekspressionsmønstre under udviklingen af kakeksi. Atrogin1 mRNA steg 79% (
P
= 0,01, figur 3G) under indledningen af kakeksi, og blev yderligere induceret med mellemliggende og ekstrem vægttab. MuRF1 mRNA ekspression blev ikke øget under initiering af kakeksi eller overgang til mellemliggende vægttab. Men
Apc
Min /+
mus med ekstrem vægttab viste, en 92% (
P
= 0,02, figur 3G) stigning i MuRF1 udtryk. Atrogin1 proteinekspression blev øget med 79% (
P
= 0,004, figur 3H) under indledende vægttab.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.