PLoS ONE: Sammenligning af Nanostring nCounter® Data om FFPE Tyktarmskræft Prøver og Affymetrix Microarray Data om matchede Frosne Væv

Abstrakt

Prognosen for kolorektal cancer (CRC) fase II og III patienter er fortsat en udfordring på grund af vanskelighederne med at finde robuste biomarkører er egnede til at teste kliniske prøver. De fleste af de offentliggjorte gen underskrifter fra CRC er blevet genereret på friske frosne kolorektale væv. Fordi samling af frosne væv er ikke praktisk til rutinemæssig kirurgisk patologi praksis vil en klinisk test, der forbedrer prognostiske muligheder end standard patologisk iscenesættelse af tyktarmskræft skal udformes for formalin-fikseret paraffinindlejrede (FFPE) væv. Den NanoString NCounter

® platform er en genekspression analyseværktøj udviklet til brug med FFPE-afledte prøver. Vi har designet en brugerdefineret NCounter

® kodesæt baseret på elementer fra flere offentliggjorte friske frosne væv microarray-baserede prognostiske gen signaturer til tyktarmskræft, og vi brugte denne platform til systematisk at sammenligne genekspression data fra FFPE med matchede microarray array-data fra frosne væv . Vores resultater viser moderat korrelation af genekspression mellem to platforme og opdagelsen af ​​en lille delmængde af gener som kandidat biomarkører for tyktarmskræft prognose, der kan påvises og kvantificeres i FFPE vævssnit

Henvisning:. Chen X, Deane NG, Lewis KB, Li J, Zhu J, Washington MK, et al. (2016) Sammenligning af Nanostring NCounter

® Data om FFPE Tyktarmskræft Prøver og Affymetrix Microarray Data om matchede Frosne Væv. PLoS ONE 11 (5): e0153784. doi: 10,1371 /journal.pone.0153784

Redaktør: Xiaofeng Wang, Cleveland Clinic Lerner Research Institute, UNITED STATES

Modtaget: 12. februar 2016 Accepteret: April 4, 2016; Udgivet: 13. maj 2016

Copyright: © 2016 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Data tilgængelige i Gene Expression omnibus (GEO) database (GSE62932)

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af National Institutes of Health tilskud CA158472 og CA095103 til XC, NGD, KBL, JZ, MKW, og RDB. JL fået støtte i form af løn fra Affymetrix. Specifikke rolle denne forfatter artikuleres i afsnittet Forfatter Bidrag. Disse finansieringskilder spillet nogen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

identifikation af kolorektal cancer (CRC) patienter, der enten mere eller mindre tilbøjelige til at drage fordel af adjuverende systemisk kemoterapi efter kirurgisk resektion er en stor udækket behov i at yde sikker og effektiv pleje. Den nuværende praksis kan resultere i under-behandling af nogle stadie II højrisikopatienter, og potentialet over-behandling af fase II-lav risiko og stadie III patienter [1]. Kernen hindring er manglen på endelige diagnostiske biomarkører til at identificere kræft med en høj sandsynlighed for metastaser og tilsvarende dårlig klinisk resultat, der er mere tilbøjelige til at drage fordel af systemisk kemoterapi; og omvendt, for at identificere de patienter med meget lav risiko ( 10%), som sandsynligvis ikke vil få stort udbytte af kemoterapi [2-6]. Oversættelse af microarray-profiler i klinisk diagnostik som biomarkører kompliceres af, at den teknologi, der kræves for at gengive dem tidligere har krævet friske ikke-fikserede vævsprøver, og der er en kløft mellem en spirende krop af genomisk information og diagnostisk anvendelse. Evnen af ​​genekspression signaturer til at forudsige tilbagefald og klinisk resultat kraftigt hævder, at høj- og lavrisiko-fænotyper molekylært er kodet i primære tumorer [7-9]. Ikke desto mindre er en robust prognostisk signatur anvendelse i kliniske omgivelser har endnu ikke udviklet for tarmkræft på grund af variation i metoder og procedurer til bevarelse af kirurgiske prøver, variation i mængden og kvaliteten af ​​renset RNA til rådighed for analyse, tumor heterogenitet spørgsmål og reproducerbarhed og robusthed af assayet platform. Fordi samling af friske frosne væv ikke er rutine, vil en klinisk test for at forbedre iscenesættelse af tyktarmskræft skal udformes for formalin-fikseret paraffinindlejrede (FFPE) væv med henblik på at være bredt anvendelig.

NanoString NCounter

® system er blevet anvendt til at kvantificere genekspression af forskellige gen underskrifter for flere vævstyper, herunder FFPE prøver [10-13]. Vi har designet en brugerdefineret NCounter kodesæt for kvantitativ vurdering af ekspressionen af ​​414 gen elementer. Denne analyse består af flere publicerede gen signaturer til tyktarmskræft prognose plus adskillige kandidat gen elementer afledt af igangværende undersøgelser i tarm stamcellebiologi og epitelial-til-mesenkymale overgang (EMT). For at afgøre, hvilke elementer af prognostiske signaturer kan oversættes fra frisk frossen væv til arkivering FFPE afledt patient RNA-prøver, vi systematisk sammenlignet udtrykket resultaterne for de 414 gener fra NCounter platformen ved hjælp FFPE-afledt væv og fra en microarray-array platform ved hjælp matchet frosne væv.

Materialer og metoder

Eksperimenter design og prøve beskrivelse

Humane væv anvendes til microarray analyse blev indsamlet og kommenteret efter fastlagte protokoller og godkendt af de relevante Institutional Review Boards (IRB) ved Vanderbilt University (VUMC). Alle væv blev indsamlet for den periode 1999-2011. Tumor etape blev vurderet af amerikanske Joint Commission on Cancer retningslinjer. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter før inklusion i undersøgelserne. Kvalitetsvurderingskriterier objektglas blev opnået at verificere diagnosen og mængden af ​​cellulært materiale for hver prøve. De-identificerede humane tumorvæv til immunohistokemi blev opnået med VUMC IRB godkendelse. For microarray undersøgelser, repræsentative afsnit af friske vævsprøver blev lynfrosset i flydende nitrogen inden for 20 minutter resektion og opbevaret ved -80 ° C indtil RNA isolation trin. Den mediane (minimum-maksimum) frosne væv opbevaringstid fra datoen for resektion til RNA-ekstraktion er 455 (35-2858) dage. RNA blev oprenset fra vævssnit indeholdende 80% epiteltumor vævet med RNeasy (QIAGEN, Valencia, CA) ifølge producentens instruktioner. Prøverne blev hybridiseret til Affymetrix arrays Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChip Expression Arrays, Santa Clara, Californien), som omfattede ca. 39.000 humane gener. Prøverne omfattede fire raske kontrol patient væv, 12 fase I, 17 fase II, 20 trin III og 15 stadie IV CRC patient væv. De detaljerede oplysninger Prøven herunder suvival data findes i S1 tabel.

For NCounter studier, arkiveret tumor FFPE prøver matchede til frosne væv beskrevet ovenfor blev identificeret og behandlet af Vanderbilt Translationel patologi og Imaging Core facilitet. Væv blev fikseret i 4% paraformaldehyd, indlejres i paraffin og opbevaret ved stuetemperatur indtil RNA-ekstraktion. Den mediane (minimum-maksimum) FFPE væv opbevaringstid fra datoen for resektion til RNA-ekstraktion er 1021 (364-3483) dage. Den første 20 um af vævet blev kasseret før opskæring sektioner til RNA-ekstraktion. Vævssnit blev monteret på uladede objektglas og en af ​​vævssnit objektglas blev farvet med H 10 arbitrære enheder) på NCounter platform og samtidig tættere på 23% af generne gav robuste signaler på microarray platform. Sammenfattende mængden af ​​brugbare data opnået ved anvendelse af NCounter platformen var lav i forhold til den, der opnås på microarray platform.

Hyppigheden af ​​genprober (414 elementer i alt) er afbildet mod median normaliserede ekspressionsniveauer værdier på tværs x aksen.

for at undersøge reproducerbarheden af ​​NCounter platformen blev seks FFPE prøver udvalgt til at generere to mere tekniske replikater for hver prøve. S2 Figur viser scatterplots af log2-transformerede tæller mellem alle par af gentagelser. Den gennemsnitlige Korrelationskoefficienten er 0,983, hvilket indikerer, at NCounter platformen er reproducerbar.

Sample og gen sammenhænge mellem NCounter og microarray

For hvert par af FFPE prøve kvantificeret ved NCounter og frisk frosset prøve kvantificeret ved mikroarray blev Pearson korrelation beregnes på basis af normaliserede, log2 transformeret genekspression værdier af de 414 gener. Den gennemsnitlige korrelation var 0,501 med 95% bootstrap konfidensinterval (0,412, 0,589), og den minimale og maksimale korrelation var 0,337 og 0,591 henholdsvis. Den Heatmap i figur 2 viser alle parvise korrelationer mellem FFPE og friske frosne prøver. Analysen er baseret på Spearman korrelation viste lignende resultater, som foreslået korrelationen mønstret mellem prøver blev ikke påvirket af forskellige normalisering procedurer da normalisering metoder ikke ændrer gen placeringer inden for hver prøve.

X-aksen repræsenterer friske frosne prøver og y-aksen repræsenterer matchede FFPE prøver.

for hver af 414 gener, blev Pearson korrelation også beregnet mellem to vævstyper. Vi plottede histogrammet af gen-wise korrelationskoefficienter i figur 3. Den gennemsnitlige korrelation af de 414 gener var 0,315 med 95% bootstrap konfidensinterval (0,248, 0,385), og den minimale og maksimale korrelation var -0,250 og 0,784 henholdsvis. Gene-wise korrelation repræsenterer overensstemmelse mellem genekspression værdier fra to udtryk platforme mellem to matchede vævstype. Grundet NCounter s enkelt sonde design, har nogle gener ikke passer godt mellem to platforme, der kan have bidraget til de svage eller negative korrelationer. Det er rimeligt at overholde denne moderat konkordans fordi variationerne i gen udtryk var fra to forskellige platforme og vævstyper. Mediet niveau af overensstemmelse mellem gener også ført til den tvetydige mønster mellem friske frosne og FFPE prøver vises i figur 2.

X-aksen repræsenterer Pearson korrelation af hver af 414 gener mellem friske frosne prøver og FFPE prøver og y aksen repræsenterer frekvensen.

Sammenligning af genekspression mellem NCounter og microarray

Efter forbehandling og normalisering, for at opdage differentielt udtrykte gener mellem 64 tumor og 4 normale prøver i NCounter eller microarray platforme separat, brugte vi legaliseret t-test som implementeret i

BioConductor

pakke

LIMMA

. Brug nominel p-værdi 0,05 som cutoff, blev 76 gener identificeret som væsentlig differentielt udtrykte gener i begge platforme. Blandt de 76 gener, blev 40 og 26 gener overudtrykt og nedreguleret i prøver kræft. Der var 30 og 60 betydelige gener opdaget i kun én platform ved NCounter og microarray henholdsvis og 248 gener var ikke signifikant ved enten platform. De fuldstændige gentestning lister herunder koefficient, nominel p-værdi og falsk opdagelse sats kan findes i S5 og S6 Tabeller for NCounter og microarray hhv. Figur 4 viser sammenligningen af ​​log2 gange ændring i tumor til normale signal intensitet mellem NCounter og microarray for hver af 414 gener, der blev udvalgt til NCounter kodesættet. De røde, grønne og blå prikker repræsenterer 76, 90 og 248 gener betydeligt udtrykkes forskelligt i både, enten, og hverken platforme hhv. Hvis vi bruger FDR 0.1 som cutoff, der var 48, 72 og 294 gener betydeligt udtrykkes forskelligt i både, enten, og hverken platforme henholdsvis.

log2 fold ændring i tumor til normal signal intensitet for 414 gener, der sammenligner resultater fra NCounter (x-aksen) og microarray (y-aksen). De røde, grønne og blå prikker repræsenterer 76, 90 og 248 gener betydeligt udtrykkes forskelligt i både, enten, og hverken platforme henholdsvis.

Foreningen af ​​NCounter og microarray genekspression med overlevelse udfald

Vi undersøgte også foreningen af ​​genekspression med total overlevelse resultater af 64 patienter ved hjælp af en Cox proportional hazard model. Ved hjælp af en nominel p-værdi 0,05 som tærskel, der var 6 signifikant associerede gener, herunder PPL, CCND1, EXT2, S100A11, USP9X, og PHLDA1 af begge platforme, 25 væsentlige gener ved NCounter og 24 væsentlige gener ved microarray. PPL, CCND1, S100A11, og PHLDA1 var forbundet med højere risiko, og EXT2 og USP9X var forbundet med bedre prognose. De fleste af de gener (359 gener) blev ikke signifikant associeret med total overlevelse resultater ved enten platform på grund af relativt lille stikprøve. Den komplette gen test lister herunder koefficient, nominel p-værdi og falsk opdagelse sats eller denne overlevelse dataanalyse er i S7 og S8 Tabeller for NCounter og microarray hhv. Figur 5 viser log hazard ratio for total overlevelse resultaterne af de 414 gener sammenlignes mellem NCounter og microarray data, med de røde, grønne og blå prikker angiver de seks, 49 og 359 gener med betydelig overlevelse forening i to, en og hverken platforme . For de seks gener identificeret af begge platforme, viste tidligere undersøgelser, at CCND1 og S100A1can anvendes som biomarkører for tyktarmskræft prognose [30, 31], og inhiberingen af ​​USP9X kan øge tumorcellen følsomhed over for visse kemoterapeutiske midler [32, 33] .

Log hazard ratio for tumor til normale signal intensitet for 414 gener vs. total overlevelse resultater sammenligner resultaterne fra NCounter (x-aksen) og microarray (y-aksen). De røde, grønne og blå prikker repræsenterer 6, 49 og 359 gener væsentligt forbundet med overlevelse resultater i både, enten, og hverken platforme henholdsvis.

Diskussion

Kvaliteten af ​​mRNA udskrift kvantificering i FFPE prøver er afgørende for translationel kræftforskning. I denne undersøgelse blev vores sammenligninger baseret på målinger af NanoString s NCounter platform ved hjælp af FFPE-afledte prøver og Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChip Expression Arrays på patientens matchede frisk frosset væv. Ideelt set ville mRNA kvantificering bruger den samme platform matchede FFPE og frosne væv gøre en mere direkte sammenligning. Men for at kunne fastslå, om gen signaturer udviklet ved hjælp af friske frosne væv er gældende for kliniske prøver, sammenligninger mellem de to platforme ved hjælp matchet, men differentieret arkiverede væv, er påkrævet.

NCounter-baserede mRNA profilering ved hjælp FFPE tekniske replikater viste høj reproducerbarhed af platformen svarer til den foregående undersøgelse [10]. Men den gennemsnitlige korrelationskoefficienter var 0,501 og 0,315 for parrede FFPE /frisk-frosset prøve korrelationer og matchede gen sammenhænge hhv. Disse resultater viste moderate korrelationer mellem NCounter (FFPE) og microarray (frisk frosset) data.

For tumor og normal gruppe sammenligninger, 166 af de 414 gener blev identificeret som væsentlig differentielt udtrykte gener ved enten platform og af disse 166 gener, 76 gener (46%) blev udtrykt samstemmende mellem de to platforme. Demonstration en forening med overlevelse resultater er mere udfordrende, kun 11% gener (6 gener) blandt signifikant associerede gener (55 gener) ved enten platform var overensstemmende.

Flere faktorer kan påvirke disse eksperimentelle resultater. Den NCounter platform, i sagens natur, udgør en brugerdefineret build af kandidat gen elementer som biomarkør, dermed valget af gener i en NCounter kodesættet sagens natur grænser

i silico

sammenligninger med andre offentliggjorte undersøgelser. Graden af ​​RNA-nedbrydning er et udfordrende problem for transkriptom profilering strategier via FFPE-afledte prøver. For eksempel, en nylig undersøgelse om hepatocellulært carcinom viste, at mRNA-transkript målinger opnået ved hjælp af NCounter systemet til arkiverede sektioneret FFPE prøver sammenlignet dårligt med frisk skåret FFPE væv [11]. Dette spørgsmål vedrører både problemet med variation i prøveforberedelse og til spørgsmålet om iboende tumor heterogenitet afspejles i målbare molekylære forskelle mellem tilstødende vævssnit. I denne undersøgelse, NanoString Technologies forudsat enkelt sonde design baseret på udskrift frekvens for vores gen-panel, men ved hjælp af multiple sonde design kan være en strategi til at forbedre kvaliteten NCounter data.

Arkiverede FFPE konserveret tumorvæv forbliver den mest tilgængelige vævsprøve kilde til omfattende udvikling og validering af prognostiske og prædiktive gen underskrifter for tyktarmskræft. Identifikation af undergrupper af arkivers tumorvæv producerer højere kvalitet RNA-prøver til udtryk profilering er en metode til at forbedre biomarkør udvikling fra disse prøver. Forbedringer i teknologi såsom nye FFPE RNA ekstraktionsprotokoller, nye FFPE RNA forstærkning og mærkning metoder, og modificerede databehandling arbejdsgange kan også hjælpe til side-trins spørgsmål af RNA-nedbrydning og forbedre transkriptomet datakvaliteten fra RNA-Seq eller microarray [34- 36]. I den aktuelle undersøgelse, viste vi, at genet signatur udviklet på microarray genekspression data ved hjælp af friske frosne prøver måske ikke direkte anvendelse på NCounter data baseret på FFPE prøver. demonstrerede dog, at en lille delmængde af gener havde stabile ekspressionsmønstre i både NCounter og microarray platforme, og uafhængigt af, om lysaterne blev afledt fra friske frosne eller FFPE-afledte prøver. Opfølgende undersøgelser af disse gener kan hjælpe med at lede til mere klinisk nyttige biomarkører for tyktarmskræft.

Støtte Information

S1 Fig. Fordelingerne af signalintensiteter af 68 prøver (individuel box plots) ved NCounter og microarray

doi:. 10,1371 /journal.pone.0153784.s001

(PDF)

S2 Fig. Scatterplot af de normaliserede tællinger fra 414 individuelle gen elementer ved hjælp af en split prøve fra seks FFPE bevarede tumor ekstraktioner (blindede tekniske replikater) på NCounter platformen

doi:. 10,1371 /journal.pone.0153784.s002

(PDF)

S1 Table. Den kliniske oplysninger på 68 prøver

doi:. 10,1371 /journal.pone.0153784.s003

(CSV)

S2 Table. Den fulde liste med gen-symboler og kilderne til de 414-gener for NCounter kodesæt

doi:. 10,1371 /journal.pone.0153784.s004

(CSV)

S3 Table. Listen over matchede Affymetrix sonde id’er for de 414-gener for NCounter kodesæt

doi:. 10,1371 /journal.pone.0153784.s005

(CSV)

S4 tabel. RNA-ekstraktion RIN værdier

doi: 10,1371 /journal.pone.0153784.s006

(CSV)

S5 Table. De differentielt udtrykte gen test resultater for NCounter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0153784.s007

(CSV)

S6 Table. De differentielt udtrykte gen test resultater for microarray

doi:. 10,1371 /journal.pone.0153784.s008

(CSV)

S7 tabel. Resultaterne testning af association med overlevelse udfald for NCounter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0153784.s009

(CSV)

S8 Table. Resultaterne testning af association med overlevelse resultater for microarray

doi:. 10,1371 /journal.pone.0153784.s010

(CSV)