PLoS ONE: Molekylær Marker Identifikation for Relapse forudsigelse i 5-FU-adjuverende kemoterapi i Mavesår og Colorectal Cancers

Abstrakt

For at bekræfte den kliniske betydning af NF-KB og JNK proteinekspression fra eksperimentelt identificerede kandidater til forudsige prognosen for patienter med 5-FU behandling, afprøvede vi proteinet ekspression af kirurgisk fjernede prøver. I alt 79 prøver blev opnået fra 30 gastriske og 49 kolorektal cancer patienter, som gennemgik R0 resektion efterfulgt af postoperative 5-FU adjuverende kemoterapi. Immunohistokemiske undersøgelser af NF-KB og JNK på væv microarrays (TMA’er) viste, at signifikant kortere time-to-tilbagefald (TTR) i både NF-KB (+) og JNK (-) undergrupper i både gastrisk (NF-KB (+) ,

s

= 0,0002, HR11.7 95% CI3 3,2-43,4;. JNK (-),

s

= 0,0302, HR4.4, 95% CI 1,2-16,6) og tyktarm (NF-KB (+),

s

= 0,0038, HR36.9, 95% CI 3,2 til 426,0, JNK (-),

s

= 0,0098, HR3.2, 95% CI 1.3-7.7) kræftformer. Disse protein ekspressionsmønstre viser også stærk discriminately magt i mavecancerpatienter for den samlede overlevelse, hvilket tyder på en potentiel anvendelighed som prognostiske eller kemosensitivitet markører. Baseline ekspression af disse proteiner under anvendelse af gastriske cancercellelinier demonstrerede gensidige mønstre mellem NF-KB og JNK, mens 5-FU eksponering af disse cellelinjer kun induceret NF-KB, hvilket antyder, at NF-KB spiller en dominerende rolle i reaktionen på 5 -FU. Efterfølgende siRNA eksperimenter bekræftede, at gen knockdown af NF-KB steg 5-FU-specifikke følsomhed, mens den for JNK ikke påvirkede kemosensitivitet. Disse resultater tyder på, at ekspressionen af ​​disse proteiner kan støtte i de involverede med adjuverende kemoterapi for mavetarmkanalen kræftformer beslutninger

Henvisning:. Ishida K, Nishizuka SS, Chiba T, Ikeda M, Kume K, Endo F, et al. (2012) Molekylær Marker Identifikation for Relapse forudsigelse i 5-FU-adjuverende kemoterapi i mave- og tarmkræft. PLoS ONE 7 (8): e43236. doi: 10,1371 /journal.pone.0043236

Redaktør: Anthony WI. Lo, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Marts 22, 2012; Accepteret: 18 Juli 2012; Udgivet: 14 august, 2012 |

Copyright: © Ishida et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af: Keiryokai Research Foundation (101) af SSN; KAKENHI (21591676); Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning (C) ved S.S.N; og MIAST (Medicinsk Innovation af Advanced Technology) projektet for Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi, JAPAN af S.S.N, K.K, N.U., C. M., T. S., og G.W. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Selvom flere standard kemoterapeutiske regimer er etableret, er der stadig et stort behov for at identificere kemosensitivitet eller prognostiske markører, der giver mulighed for forudsigelse af cancer kemoterapi effekt. Anvendelsen af ​​biomarkører med høj diskriminerende magt kan hjælpe klinikere undgå vanskelige kemoterapi med unødige bivirkninger samt give mulighed for en tidligere beslutning om at anvende alternative regimer. Trods anvendelsen af ​​adskillige high throughput screeningsmetoder i denne forbindelse, har identifikationen af ​​biomarkører været vanskeligt [1].

Under karakterisering af molekylære og cellulære karakteristika for et panel af 12 humane cancercellelinier, vi udviklet et system, hvor en konventionel

in vitro

kemosensitivitet under anvendelse klinisk godkendte lægemidler kombineret med kvantitativ proteinekspression profilering ved hjælp af en “omvendt fase ‘lysat array (RPA) blev anvendt til at identificere proteiner, der kan være relevante for aktiviteten af ​​de kemoterapeutiske midler [2]. Begge teknologier producere en kvantitativ output, som giver mulighed for analyse af et stort antal kombinationer mellem lægemiddelstyrke og proteinekspression [2], [3]. Samtidig opfylder systemet antager, at udtrykket profil af et protein kan være et prædiktor for kemosensitivitet til et givent lægemiddel. Efterfølgende validering er herefter forpligtet til at afgøre, om de markører er klinisk relevant med hensyn til kemosensitivitet.

En nylig samling af individuelle patientdata fra tyktarmskræft sager har vist, at 5-FU adjuverende kemoterapi giver en betydelig sygdomsmodificerende overlevelse (DFS) fordel ved at reducere tilbagefald sats, hvilket fører til en langsigtet samlet overlevelse (OS) fordel [4]. I østasiatiske lande, det er blevet godt accepteret, at resektabel lokalt fremskreden mavekræft vil drage fordel af 5-FU-adjuverende kemoterapi, såsom S-1, som er en oral fluoropyrimidin, for langvarig OS og tilbagefald overlevelse (RFS ) [5], [6]. Men cirka 30-40% af patienterne oplever tilbagefald, selv efter at have modtaget en helbredende operation og “standard” adjuvans kemoterapi [7], [8]. På trods af den intensive brug af 5-FU for gastrointestinale kræftformer, to-date de markører for 5-FU ikke har opnået standard-of-praksis nytten [9].

I den foreliggende undersøgelse, vi samlet 79 fjernes kirurgisk kræft prøver fra gastriske og tyktarmskræft patienter, som ikke havde fået nogen kemoterapi på tidspunktet for operationen og senere modtog 5-FU adjuverende kemoterapi for at afgøre, om nogen af ​​markørerne var forbundet med TTR. Vi producerede et væv microarray (TMA), der repræsenterer alle 79 eksemplarer på et objektglas og undersøgt dem med primære antistoffer [2], at anerkendt et specifikt protein identificeret som en kandidat markør for tilbagefald. For at bekræfte en direkte sammenslutning af protein-ekspression og 5-FU anti-tumor effekt, vi også udført gen knockdown af siRNA i flere humane kræftceller.

Materialer og metoder

Etik Statement

undersøgelsen er godkendt af Institutional Review Board på Iwate Medical University i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen. En individuel skriftlig tilladelse blev opnået fra alle patienter og den absolutte tavshedspligt blev bevaret, selv efter at patienten er død. Alle analyser blev udført anonymt så enkelte patienter blev ikke identificeret.

Forudsigelse af proteiner som kandidatlandene Markører for Prognose

Vi uropført en konventionel kemosensitivitet assay hvorved 144 kombinationer af 12 anticancer narkotika og 12 cellelinjer blev bedømt for kemosensitivitet anvendelse af en 50% vækstinhibering (GI

50) værdi (en matrix, fig. 1A) [2]. Basislinien Ekspressionsniveauet af 50 proteiner fra cellelinien panel blev analyseret kvantitativt ved anvendelse af en “omvendt fase” lysat microarray (RPA) [10], [11], som er et western blot i mikroskala dot format, efterfulgt af kvantitativ immunpåvisning ( P matrix) [12], hvor hver matrix visualiseres baseret på gennemsnittet-kobling hierarkisk klyngedannelse (fig. 1B) [2], [13]. En korrelation af korrelation mellem A og P matricer (AP matrix) blev derefter etableret ved hjælp af algoritmen rapporteret af Scherf et al. [14] (fig. S1, S2). AP matrix giver os mulighed for at forudsige en sammenhæng mellem protein-ekspression og kemosensitivitet. Under anvendelse af denne fremgangsmåde identificerede vi otte proteiner baseret på 5-FU kemosensitivitet (fig. 1C, tabel S1) [2].

(A) Baseret på en kemosensitivitet assay af en cancercellelinie panel, A ( aktivitet) × C (celler) = AC matrix blev oprettet. (B) Kvantitativ proteinekspression data for hver cellelinje bestemmes ved “omvendt fase” lysat microarray genererer C × P (protein) = CP matrix. (C) En Heatmap med hierarkisk klyngedannelse repræsentation af AP matrix, som genereres fra AC og CP matricer. (D) Immunohistokemiske farvninger af kandidat markører for 5-FU-behandling.

fjernes kirurgisk Prøver

Nioghalvfjerds kirurgisk fjernet prøver, herunder 30 gastriske og 49 kolorektal tilfælde blev indsamlet fra patienter, som ikke havde modtaget nogen anticancer agenter på tidspunktet for operationen. Alle kirurgiske tilfælde blev udført ved Institut for Kirurgi på Iwate Medical University Hospital mellem 1997 og 2008. Efter operationen blev alle tilfælde bekræftet at opfylde kriterierne for 5-FU-adjuverende kemoterapi sammen med en endelig klinisk-patologisk diagnose (tabel 1) .

TMA’er

en tumor-rigt område af hver vævsprøve blev markeret på en hematoxylin og eosin (H Cell Signaling Technology). Den samme tendens blev opnået for begge siRNAs. Kontrolprøver blev tilsvarende cellelinjer med siRNA transfektion uden lægemidler mod cancer.

Resultater

Patienter

Den mediane alder af de 79 patienter var 68 år (range, 37-83 år ), med 30 mavekræft og 49 kolorektal cancer patienter. Alle 79 patienter gennemgik enten en gastrektomi eller colorectomy med lymfeknude dissektion. Den operationelle hærdelighed var ingen residual tumor (R0) for alle tilfælde. Patologiske fund viste, at alle tumorer invaderet ud over mascularis propria. Seksogtyve (33%) af patienterne havde patologisk negative regionale lymfeknudemetastaser, mens ingen patienter viste fjerne metastaser. Alle patienter opfyldte følgende kriterier for 5-FU adjuverende kemoterapi: Histologisk bekræftet gastrisk ( fase II) eller kolorektal ( T2) kræft med tilsyneladende R0 kirurgi; ingen lever-, peritoneal eller fjernmetastaser; patientens alder mellem 20 og 85; ingen forudgående kemoterapi; og tilstrækkelig organfunktion. Kemoterapi blev anset for at være afsluttet, hvis en patient var i stand til at fortsætte følgende 5-FU baseret regimer: (i) S-1 (60 mg /m

2 /krop) i 1 år for mavekræft; og (ii) enten doxifluridin (800-1200 mg /dag), 5-FU (370 mg /m

2 /dag), eller UFT-E granulat (300 mg /m

2 /dag) i seks måneder for kolorektal cancer. Sixty (76%) patienter afsluttet kemoterapi, 15 (19%) patienter suspenderede behandling, og 4 (5%) patienter havde manglende oplysninger.

Den mediane observationstid efter operation var 3.41 og 5.04 år i mave og tyktarm henholdsvis (range, 1.41-7.00 år i maven, og 0.99-10.24 år i colon). Hos ikke-recidiverende tilfælde minimale observationstid var 2,43 og 2,36 år i mave og tyktarm, hhv. Medianen TTR var 1,56 og 1,52 år i mave og tyktarm, henholdsvis (interval, 0.72-3.33 år i maven og 0,27-4,47 i colon). Blandt 77 tilfælde, hvoraf overlevelse status blev bekræftet, den 3-årige samlede overlevelsesrate i recidiverende og ikke-recidiverende grupper var 0,60 og 0,65 i maven og 0,97 og 0,96 i tyktarmen, hhv. De klinisk-patologiske parametre på grundlag af tilbagefald status er vist i tabel S3.

Immunhistokemi

Immunofarvningen snesevis af alle ansøgerlande proteiner kunne evalueres (fig. 1D og fig. S3). NF-KB viste tydelig nukleare farvning, der blev spredt over hele kerner og ikke danne klynger. Nogle celler viste cytoplasmatisk farvning, men det var ikke så tydelig som dem med nuklear farvning. Farvningen af ​​JNK var ikke så stærk som for NF-KB, men var klart lokaliseret i cytoplasmaet. De resterende seks ansøgerlande proteiner og tre proteiner af interesse var i deres forventede subcellulære placeringer (Fig. S3). Efter bestemmelse af subcellulære lokalisering af proteinerne, blev styrken af ​​farvning scoret i en binær måde.

Sammenhæng mellem Protein Expression og klinisk-patologisk Resultater

En uforudsete parameter analyse af hvert protein i form af tilbagefald viste, at protein niveauer af NF-KB og JNK markant var forbundet med tilbagefald i maven (

s

= 0,0004 og 0,029 for NF-KB og JNK henholdsvis; tabel S4). Når ekspressionen af ​​disse to proteiner blev kombineret, uforudsete analyse viste en stærkere diskriminerende strøm end hver enkelt protein.

Baseret på en Kaplan-Meier-analyse, blev JNK og NF-KB ekspressionsniveauer forbundet med betydelige forskelle i den ikke-relapsraten (fig. 2). En log-rank test af Kaplan-Meier analyse viste en signifikant forskel i de ikke-tilbagefald mellem JNK (+) og JNK (-) grupper i både maven (

s

= 0,0302, HR4.4 , 95% CI 1,2-16,6) og kolon (

s

= 0,0098, HR3.2, 95% CI 1,3-7,7); og også mellem NF-KB (+) og NF-KB (-) grupper i både maven (

s

= 0,0002, HR11.7, 95% CI 3,2-43,4) og kolon (

s

= 0,0038, HR36.9, 95% CI 3,2 til 426,0, fig. 2). Interessant nok i maven, alle NF-KB (+) tilfælde var JNK (-), mens 58% af JNK (-) tilfælde var NF-KB (+). Sandsynligheden for tilbagefald, når disse markører blev kombineret viste større forskel end at bruge de individuelle markører i både maven og tyktarmen (fig. 2).

Vi har også screenet p53, Tymidine Synthetase, og MDR-1-ekspression i poolede mave og tyktarm prøver fordi det er blevet foreslået, at disse proteiner eller kodende gener kan være forbundet med 5-FU lægemiddel potens [18], [19], [20], [21]. . Der blev dog ikke observeret nogen signifikant sammenhæng mellem tilbagefald sats og ekspressionsniveauet af disse proteiner (. Fig S4)

Af den 3-årige OS på mavekræft, NF-KB (-) og (+ ) tilfælde var 0,94 og 0,77, henholdsvis og 0,82 og 1,00 for JNK (-) og (+) hhv. Af den 3-årige OS på tyktarmskræft, NF-KB (-) og (+) tilfælde var 0,79 og 1,00, henholdsvis og 0,72 og 0,90 for JNK (-) og (+) hhv. Men der var en signifikant forskel i OS sats af Kaplan-Meier estimation i gastrisk cancer (NF-KB (+), HR 7.9, 95% CI 2,1-30,3; JNK (-), HR 0,25, 95% CI 0.06- 1.09, fig. S5).

Subset analyse

For at identificere generelle sammenhænge mellem markører og klinisk-patologiske fund blev en delmængde analyse udført med mave og kolorektale samleprøver. Der var en signifikant sammenhæng mellem NF-KB-status og T-faktor /Stage for TTR (fig. S6), men blev ikke observeret nogen signifikant sammenhæng mellem JNK status og eventuelle variabler for TTR (fig. S7). Interessant, men der var en signifikant sammenhæng mellem den kombinerede markør status: og T-faktor /Scene TTR, og kemoterapi færdiggørelse status til OS (fig S8, S9.). Sammenhængen mellem OS og status for hver faktor blev også analyseret efter køn, alder, læsioner, TNM klassifikationer, og status for kemoterapi er afsluttet (fig. S10, S11). En multivariat analyse afslørede, at NF-KB-ekspression og T faktor var uafhængige faktorer for både tilbagefald og overlevelse.

Molekylær Responses med 5-FU

Baseline protein udtryk for NF-KB og JNK var målt ved western-blot. Interessant ekspressionsmønsteret var reciprok; cellelinier med høj NF-KB-ekspression viste relativt lav JNK-ekspression (fig. 3A). Den gensidige ekspressionsmønster var overensstemmende med retningen af ​​disse proteiner som biomarkører. Vi testede også proteinet induktion med 5-FU. NF-KB-ekspression blev induceret og forøget i den samlede fraktion protein ved 5-FU i en dosisafhængig måde (fig. 3B). Efterfølgende immuncytokemisk analyse viste, at nukleare NF-KB fremtrædende blev visualiseret efter 5-FU eksponering, mens JNK ikke udviste en mærkbar forandring i lokalisering (fig. 3C).

(A) Baseline proteinekspression af NF-KB og JNK i fem gastrisk cancer cellelinjer. Tublin blev anvendt som en loading kontrol. (B) Induktion af kandidat biomarkører i respons til 5-FU behandling i forskellige koncentrationer i MKN45 og KE39. (C) Undersøgelse af protein lokalisering af fluorescerende immuncytokemi hjælp MKN45. (D) Øget hæmmende vækst effekt ved anticancer agenter i gastrisk cancer cellelinjer efter transfektion af siRNA for NF-KB-p65 og JNK udskrifter. Kontrolprøver er de tilsvarende cellelinier transficeret med de anførte siRNA’er uden anticancermidler. Forkortelser er: CIS, cisplatin; DTX, docetaxel; og PXL, paclitaxel; og 5FU, 5-fluorouracil. *

s

. 0,05, Student

t

-test

Effekten af ​​NF-KB-p65 og JNK Gene Knockdown på cellevækst

Fire ud af fem cellelinier (GSS, KATOIII, KE39, og MKN45) udviste betydelig vækst undertrykkelse efter NF-KB siRNA transfektion og 5-FU behandling (

s

0,05, Student

t

-test;. figur 3D, fig S12).. Den 5-FU-afhængige, statistisk signifikant vækst undertrykkelse blev set i GSS, KATO-III, og MKN45. JNK siRNA behandling forventedes at inducere en anti-apoptotisk virkning på grundlag af tidligere undersøgelser [22], som blev hypotese at øge vækstraten i nærvær af lægemidler mod cancer. Fire ud af fem cellelinier behandlet med JNK siRNA demonstrerede 5-FU-medieret vækst induktion eller ingen ændring. Disse siRNA eksperimenter viste, at NF-KB og JNK synes at have gensidige roller i form af 5-FU-medieret vækstsuppression.

Discussion

Selv om valget af adjuvans kemoterapi efter resektion af mavekræft er lidt forskellige mellem lande, har 5-FU vist sig at være den mest effektive behandlingsform. Validering af postoperativ kemoterapi og kirurgi alene har vist 3-årige OS satser på 80,1% og 70,1%, henholdsvis i Japan [23]. Postoperativ kemostråleterapi (CRT) er blevet gennemført i USA for avanceret mavekræft, og OS efter CRT er blevet rapporteret til at være 50%, mens den for kirurgi alene var 41% [24]. I Europa, MAGIC retssagen afslørede effekten af ​​perioperative kemoterapi og viste, at den 5-årige OS var 36,3% og 23,0% i de perioperative kemoterapi og kirurgi alene grupper, henholdsvis [25]. På den anden side blev adjuvans kemoterapi (5-FU /LV) for fremskreden kolorektal cancer vist sig at forbedre OS i 1990’erne, og for nylig en yderligere forbedring af DFS og OS er blevet observeret med tilsætning af oxaliplatin [26]. Generelt er adjuverende kemoterapi for tarmkræft kun administreres i seks måneder, men har vist sig at give langsigtede fordele, herunder forlænget 5-års DFS og OS [4], [26].

Med en standard for pleje etableret, vi nu står over for spørgsmålet om, hvordan man behandler patienter, der ikke disse standardbehandling. Faktisk 30-40% af patienterne behandlet med standard adjuverende kemoterapi erfaring tilbagefald efter operation inden for fem år i avanceret gastriske og coloncarcinomer [8], [27]. Derfor har det været et vigtigt mål at forbedre behandlingsregimer for delmængde befolkning, hvor standard behandling kan være ineffektiv.

I den foreliggende undersøgelse, at validere nytten af ​​identificerede markører, indsamlet vi arkiverede væv fra patienter, der havde gennemgået helbredende resektion for gastrisk og tarmkræft. Alle patienter var berettiget til at modtage adjuverende kemoterapi, herunder patienter med stadie I /II tyktarmskræft. En tidligere rapport viste, at blandt 769 mp sager fra en retrospektiv kohorte af japanske patienter, gentagelse på trin I (mp, n0) patienter var 7% [28]. Selvom antallet af patienter var begrænset, kvasaren undersøgelse rapporterede, at en højere procentdel af fase I-patienter (25%), som havde fået kirurgi alene døde inden for fem år sammenlignet med patienter, som fik adjuverende kemoterapi [29]. Endvidere er det blevet rapporteret, at cirkulerende tumorceller blev fundet i 6% af trin I colorectal cancer patienter efter kurativ operation [30]. Disse kliniske og biologiske fund bør gøre det rimeligt at medtage trin I i den foreliggende undersøgelse.

Det er blevet rapporteret, at ca. 25% af patienter med stadie II tumorer anses for at have en øget risiko for tilbagefald på grund af : (a) gennemtrængning af serosa (T4); (B) extramural venøs invasion; (C) dårligt differentieret histologi; (D) fremlæggelse af en obstruktion; eller (e) med et udbytte på mindre end 10-12 lymfeknuder [31]. I den foreliggende undersøgelse, de fleste af de trin II kolorektal tilfælde besad et af disse kriterier risiko, bortset fra et tilfælde, hvor patienten var ung (37 år gammel), for hvilke QUASAR undersøgelsen berettigede berettigelse. Selv om brugen af ​​kemoterapi i trin I ikke anbefales, og fase II-sager har været kontroversiel, vi gennemførte validering, fordi det formål at vælge en person, der ikke kan drage fordel af “standard” kemoterapi eller har en potentiel risiko i lavere stadier, der er i modsætning til den fremgangsmåde af epidemiologiske undersøgelser.

Tidligere rapporter har vist betydningen af ​​NF-KB i prognosen, angiogenese, og kemoresistens i mave og coloncarcinomer [32], [33], [34], [ ,,,0],35], [36]. Vores nuværende data viste, at den nukleare lokalisering af NF-KB kunne forudsige udfaldet af patienterne på tidspunktet for operationen, som efterfølgende får adjuverende kemoterapi. Interessant nok blev fundet NF-KB (+) tumorceller spredt i afsnittene, hvor der var en klar sondring mellem positive og negative celler. Molekylære eksperimenter afslørede en klar gensidig sammenhæng mellem NF-KB og JNK udtryk, der foreslog en potentiel forening med 5-FU terapi og de patologiske fund. For at tydeliggøre rollen som NF-KB og JNK i tumoren respons på 5-FU, vi gennemførte gen knockdown eksperimenter. Knockdown af NF-KB (p65) genet afslørede, at størstedelen af ​​kræft testede cellelinjer demonstrerede klart 5-FU-specifik væksthæmning, mens andre lægemidler selv induceret cellevækst. Dette resultat tyder på en direkte forbindelse mellem 5-FU følsomhed og NF-KB-udtryk og understøtter den diagnostiske anvendelse af denne analyse for 5-FU adjuverende kemoterapi. Det skal også bemærkes, at taxaner og topoisomeraseinhibitorer aktiverer NF-KB-vejen, som fører til celleproliferation gennem MYC og IKK-aktivering, henholdsvis [33]. De kliniske implikationer af disse mekanismer mangler at blive belyst.

NF-KB er blevet impliceret i udviklingen af ​​lægemiddelresistens i en lang række af cancerceller. Hæmning af NF-KB-aktivering reducerede kemoresistens i mave- og kolorektale cancer cellelinjer, hvilket er i overensstemmelse med vores nuværende resultater [6], [32], [37], [38]. Konstitutiv aktivering af NF-KB er blevet foreslået som en mulig prognostisk faktor i gastrisk cancer [39], [40], [41] og korrelerer med progression og kemoterapi modstand colorektale carcinomer [42], [43].

JNK-proteiner har forskellige funktioner på celleproliferation og på induktionen af ​​apoptose ved stress-aktiveret protein kinase pathways, og er ofte nedreguleret i cancere [44], [45]. I den foreliggende undersøgelse synes rolle JNK i forbindelse med 5-FU reaktion at være passive i forhold til kemosensitivitet ifølge vores siRNA eksperiment. Den immunhistokemiske analyse i denne undersøgelse viste, at NF-KB og JNK var gensidige indikatorer for prognosen. Imidlertid knockdown af NF-KB sensibiliseret 5-FU, mens JNK ikke gjorde celler resistente over for 5-FU. NF-KB-aktivering af TNF-α er stramt reguleret af JNK i forbindelse med en proinflammatoriske respons, hvilket sker umiddelbart efter stimulation [46], [47], [48], [49]. På den anden side, aktivering af NF-KB i malignitet eller kemoresistens synes at være konstitutiv i en del af gastrointestinal tumor progression [47], [50]. I den foreliggende undersøgelse, selvom NF-KB nuklear farvning kun blev set i en lille fraktion af tumorceller, blev JNK farvet relativt ubikvitært i hele vævet. Derfor kan vores nuværende resultater indikerer, at JNK-farvning afspejler en vis baggrund kroniske inflammatoriske eller stress reaktioner af maveslimhinden [51], mens NF-KB konstitutiv aktivering er forbundet med maligne potentiale af tumorcellerne [39], [40] , [41], [52]. Foruden den iboende maligne potentiale, vores resultater viste også, at NF-KB spiller en særlig rolle i 5-FU-respons. Tilsammen selvom der kræves et større klinisk forskning, kan NF-KB nuklear ekspression være en god kandidat som en 5-FU kemosensitivitet forudsigelse markering, mens JNK kan være en støttende markør, der afspejler baggrunden mucosal information.

Selv om den nuværende resultat er stadig foreløbige fra et praktisk synspunkt, kan disse resultater give mulighed for alternative regimer, der skal overvejes i sager, der indikerer en lav sandsynlighed for en 5-FU-baserede kemoterapeutiske respons. En større immunhistokemisk undersøgelse, der omfatter NF-KB /JNK vil være nødvendigt analyser for at bevise nytten i mave- og tarmkræft.

Støtte Information

Figur S1.

Flow af kemosensitivitet Marker Identification. (A) Baseret på en kemosensitivitet assay af en cancer cellelinje panel, A (aktivitet) × C (celler) = AC matrix blev oprettet. De to venstre panel viser celle vækstkurver på grundlag af lægemiddelkoncentrationen. Det midterste panel viser 50% væksthæmning (GI

50) værdier i et søjlediagram. Alle data er centreret af Peak plasmakoncentration (PPC) værdier, der er unikke for hvert lægemiddel. Højre panel repræsenterer GI

50 værdier og cellerne i en Heatmap med en hierarkisk klyngedannelse format. (B) “omvendt-fase” protein lysat microarray (til venstre) og C (celler) × P (protein) = CP matrix i en Heatmap med en hierarkisk klyngedannelse format (til højre). (C) En Heatmap med hierarkisk klyngedannelse repræsentation af AP matrix, som genereres fra AC og CP matricer. Dendrogrammet angiver afstanden baseret på korrelationskoefficienten af ​​datasættet ved siden af ​​hinanden. Derfor AP matrix viser korrelationen mellem proteinekspression og lægemiddeleffektivitet på tværs af alle cellelinier. Citeret med tilladelse fra henvisning # 2

doi:. 10,1371 /journal.pone.0043236.s001

(TIF)

Figur S2.

Sammenhæng mellem kandidat proteiner og narkotika følsomhed. Venstre: spredningsdiagram baseret på 5-FU følsomhed og NF-KB-ekspression. Korrelationskoefficienten er positiv, men er negativ (

r

= -0,304), når de gastrointestinale cellelinjer (CW2, HCT116, GSS, KATOIII, MKN45, HuG1-PI, og KE39) blev analyseret, hvilket er i overensstemmelse med valideringen resultat fra TMAs. Til højre: spredningsdiagram baseret på 5-FU følsomhed og JNK udtryk. Det er blevet godt accepteret, at screening-værktøjer, såsom microarray-baserede teknikker, kan opdage anvendelige biomarkører, men kan også isolere falske positiver.