PLoS ONE: A Novel Proteomics-Based Clinical Diagnostics Teknologi Identificerer heterogenitet Aktiveret signalveje i Gastric Cancers

Abstrakt

Formål

Formålet med denne undersøgelse var at udnytte proteomics-baserede Collaborative enzym Enhanced Reaktiv (CEER) immunassay at undersøge protein tyrosin phosphoryleringer som diagnostiske markører i gastrisk kræft (GC’er).

Eksperimentel Design

Proteinlysater af friske frosne 434 avancerede stadie GCS blev analyseret for fosforylering af HER1, HER2, p95HER2, HER3, cMET, IGF1R og PI3K. Den vej aktiveringsmønstre blev adskilt baseret på tumoren HER2-status. Hierarkisk klyngedannelse blev anvendt til at bestemme pathway coactivations i GC’ers. Prognostiske værdi af pathway aktiveringsmønstre blev bestemt ved at korrelere sygdomsfrie overlevelsestid for de forskellige GC undergrupper med brug Kaplan-Meier overlevelsesanalyse. CEER blev også anvendt til at bestemme tilstedeværelsen af ​​tyrosin phosphoryleret signalering kaskader i cirkulerende tumorceller (CTCs) og ascites tumorceller (ATC).

Resultater Salg

Ved hjælp af en hidtil ukendte diagnostik immunoassay, CEER, vi demonstrere tilstedeværelsen af ​​p95HER2 og samtidigt aktiverede signalveje i GC tumorvæv, CTCs og ATC isoleret fra GC patienter for første gang. p95HER2 udtrykkes i ~77% af HER2 (+) GCS. Ca. 54% af GCS har en aktiveret HER1, HER2, HER3, cMET eller IGF1R og demonstrere en dårligere prognose end dem, hvor disse receptor (RTK’er) ikke er aktiveret. Hierarkisk gruppering af RTK afslører co-gruppering af phosphoryleret HER1: cMET, HER2: HER3 og IGF1R-PI3K. Coactivation af HER1 med cMET gør GCS med en kortere sygdomsfri overlevelse sammenlignet med kun cMET aktiveret GC’er.

Konklusioner

Vores undersøgelse fremhæver nytten af ​​en ny companion diagnostics teknologi, CEER, der har stærke konsekvenser for lægemiddeludvikling og terapeutisk overvågning. CEER bruges til at give en øget forståelse af aktiverede signalveje i avancerede GCS, der kan forbedre betydeligt deres kliniske behandling gennem nøjagtig patientudvælgelse for målrettede lægemidler

Henvisning:. Lee J, Kim S, Kim P, Liu X, Lee T, Kim KM, et al. (2013) En roman Proteomics-Based Clinical Diagnostics Teknologi Identificerer heterogenitet Aktiveret signalveje i Gastric kræftformer. PLoS ONE 8 (1): e54644. doi: 10,1371 /journal.pone.0054644

Redaktør: Anthony W. I. Lo, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: September 20, 2012; Accepteret: December 13, 2012; Udgivet: 25 Jan 2013

Copyright: © 2013 Lee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Mens PK, XL, TL, NH, GH, AK, AJ, GM, GL og SS er ansat af Prometheus Laboratories, dette ændrer ikke forfatternes overholdelse af alle de PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

molekylært målrettede agenter har fremskyndet inden for onkologi. Eftersom ca. halvdelen af ​​tyrosinkinase-komponent i den humane kinome er impliceret i humane cancere, er det ikke overraskende, at en stor del af de nuværende terapeutiske midler rettet mod forskellige kinaser [1], [2]. Coactivation af receptortyrosinkinaser (RTK’er) er blevet observeret i delmængder af flere cancertyper såsom glioblastoma multiforme [3], brystcancer [2], [4], [5], [6], [7], lungecancer [8 ], [9], hoved- og halscancer [7] og gastrisk kræft [4], [5], [6] og dermed implicerer dem som nødvendige for tumor progression og overlevelse. Disse observationer giver tilstrækkelig klinisk rationale til screening aktiverede RTK’er i kræftsygdomme, der kunne så guide terapeutisk målretning og potentielt give viden til rationelle kombinatoriske terapeutiske strategier. Men blot analyse af ekspressionen eller aktivering status for en enkelt RTK, som kan være det specifikke målprotein til et særligt terapeutisk er utilstrækkelig til udvælgelse af patienter som ofte gange patienter ikke responderer på terapier på trods af ekspression af målet. Flere potentielle problemer kunne være ansvarlig for en sådan mangel på terapeutisk gavn af målrettede agenter, fx 1) samtidig aktivering af parallel eller alternative veje, som omgå oprindeligt målrettet protein (er), og 2) kontinuerlig ændring i molekylære og patologiske træk af neoplastisk væv under udviklingen af ​​kræft. Derfor ville det være ideelt at have en ledsager diagnostisk værktøj, der kan anvendes på begrænsede mængder af kliniske prøver at fange den omfattende kompleksitet phosphorylerede signalsystemer net i neoplastisk væv ud over den direkte mål RTK-protein til at overvåge “udviklende” sygdom .

Målrettet phosphorylering analyse af kliniske prøver er blevet hæmmet på grund af manglen på let anvendelige kliniske assays, der er følsomme nok til at fungere på begrænsede mængder af kliniske væv. Vi har tidligere rapporteret udviklingen af ​​en hidtil ukendt nærhed-baseret immunassay, Collaborative Enzyme Enhanced Reaktiv-immunoassay (CEER, figur S1) [6], som er egnet til analyse af både det samlede udtryk og aktiveringsstatus af protein signalering kaskader. CEER kan udføres i en multiplekset måde direkte på kliniske prøver, som kan være tilgængelige i begrænsede mængder. CEER analysen anvender dannelsen af ​​en unik immuno-kompleks kræver co-lokalisering af to detektor enzymkonjugerede-antistoffer, når målproteinerne er blevet fanget på et mikroarray. Dette format gør det muligt effektiv og følsom påvisning af RTK’er samt de nedstrøms pathway proteiner ned til enkelt celle niveau (en følsomhed på omkring 100 zeptomoles). I denne undersøgelse har vi udnyttet CEER assay at studere signalvejen kompleksitet i gastriske cancere (GC).

GC’er er den førende årsag til kræft dødsfald i hele verden med en hyppighed på 18,9 /100.000 tilfælde om året, og en dødelighed sats på 14,7 /100.000 om året [10] og er den mest almindelige malignitet i Korea [11]. Metastatisk GC fortsat en terapeutisk udfordring for medicinske onkologer grund af sin dårlig prognose. Øjeblikket, trastuzumab er den eneste aktive targeted middel, der har vist sig at være effektiv til GC i et randomiseret fase III-forsøg [12]. Mens aktivering af flere RTK’er er blevet rapporteret i GC’er, deres indvirkning på GC prognosen er ukendt. Dette er vigtigt for udvikling og anvendelse af lægemidler til den kliniske behandling af GC’ers.

I denne undersøgelse har vi brugt den multiplex CEER platform til at bestemme niveauet af aktiverede RTK’er (HER1, HER2, trunkerede varianter af HER2, dvs p95HER2, HER3, cMET, PI3K, og IGF1R) i 434 friske frosne GC væv og forsøgte at kategorisere GC patienter til potentielle undergrupper baseret på deres protein-aktivering mønstre. Vi har observeret multiple signal protein aktiveringer i undergrupper af GC tumorer, der korrelerer med sygdomsfri overlevelse (DFS) hos disse patienter. Derfor er vi hypotesen, at overflødige pathway aktivering input kan føre til resterende nedstrøms signalering i GC’ers, hvilket begrænser den anti-tumor effekt af monoterapier målrettet mod enkelte RTK’er. Endelig har vi udviklet en potentielt stærk metode, som gør klinikere at overvåge baseline og udviklende ændringer i tumor RTK aktivering profiler i løbet af en behandling ved hjælp cirkulerende tumorceller (CTCs) og maligne celler isoleret fra peritoneale væske (ascites tumorceller eller ATC ). Tilsammen vores undersøgelse dokumenterer for samtidig RTK aktivering i GC humane væv udover oprettelse CEER som et effektivt klinisk redskab til at diagnosticere og overvåge RTK aktivering under GC behandling eller sygdomsprogression.

Materialer og metoder

Patient Kohorte og vævsprøve Procurement

undersøgelsen blev foretaget efter godkendelse fra Samsung Medical center Institutional Review Board (SMC IRB) for informeret samtykke frafald hjælp arkivers væv med retrospektive kliniske data. De primære tumor prøver blev alle indsamlet fra Samsung Medical Center. Alle patienter undergik gastrektomi med radikal lymfeknude dissektion med helbredende hensigt. Fra marts 2001 til februar 2005 blev 447 friske frosne væv fra 434 patienter indsamlet fra kirurgisk resektion primære gastriske tumorer og var tilgængelige for den endelige analyse. Alle friske frosne væv blev opsamlet (inden 30 minutter) ved den kirurgiske område og blev straks lynfrosset og opbevaret i flydende nitrogen indtil senere brug. Tumorprøver blev bekræftet for tilstedeværelsen af ​​ 70% tumor område ved patologen. Til analysen blev små stykker af frosne væv (10 um sektion x 3) fremstilles ved anvendelse af forud afkølet barberblad og lyseret i 100 pi lysisbuffer. De resulterende lysater blev opbevaret ved -80 ° C indtil efterfølgende analyse

Histopatologi Review og HER2-status beslutsomhed

Alle tilgængelige H . E-farvede objektglas blev centralt revideret af to patologer (ID, KKM ) ved den eksperimentelle patologi kerne af Samsung Cancer Research Institute. Alle tumorprøver var fra kirurgisk resektion primære gastriske tumorer. HER2-status blev bestemt ved IHC og FISH. IHC-analyse blev udført ved anvendelse af HercepTest ™ (Dako, Glostrup, Danmark). HER2 protein udtryk niveauer blev scoret som 0 til 3+, ifølge anbefalingerne konsensus panel på HER2 scoring for GC [13], [14]. For FISH blev PathVysion HER2 DNA-probe-kit (Abbott, Des Plaines, IL), der anvendes. ARIOL billedanalyse blev anvendt til at tælle hybridiseringssignaler (GENETIX, San Jose, USA). Alle prøver med forhold mellem HER2 /CEP17 mellem 1,8 og 2,2 blev scoret manuelt ved at tælle mere end 60 ikke-overlappende celler. Forhold på 2,2, 1,8 til 2,2, eller 1,8 blev klassificeret som positive, tvetydig eller negativ for forstærkning, henholdsvis. Kromosomalt 17 polysomy blev defineret som en CEP17 signal, som havde mere end seks eksemplarer i gennemsnit per celle. Af de 447 prøver, blev 434 prøver indgår i den endelige analyse.

Collaborative Enzyme Enhanced Reaktiv-immunoassay (CEER)

CEER slides blev trykt, inkuberes med GC lysater og behandlet som beskrevet tidligere [ ,,,0],6]. Slides blev scannet på fire fotomultiplikator (PMT) gain-indstillinger for at øge det effektive dynamikområde. Data, var egnet til en fem-parameter ligning udledt som en funktion af capture-antistof-koncentration og PMT og præsenteres i beregnede enheder (CU).

Multipleksede-microarray udskrivning.

Capture antistoffer blev trykt på nitrocellulose-coatede objektglas (ONCYTE®, Grace Bio-Labs) ved hjælp af ikke-kontakt-printere (nanoplotter, gesim). Stedet diameter på cirka 175 um. Objektglas blev holdt i en udtørret kammer ved 4 ° C. Ca. 500 pL til indfangning Ab’er blev trykt i tre eksemplarer ved seriefortynding koncentrationer på 1 mg /ml, 0,5 mg /ml og 0,25 mg /ml. Oprenset muse-IgG’er tjente som negative kontroller. Immuno-array-slide konfigurationer er vist i figur S1.

antistofkonjugering og oprensning.

målspecifikke antistoffer (mus monoklonalt mod specifikke epitoper på humane signaltransduktionsveje proteiner) og de tilsvarende detektor enzymer, glucoseoxidase (GO) eller peberrodsperoxidase (HRP), blev aktiveret med bi-funktionelle tværbindingsmiddel, succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexan-1-carboxylat (SMCC), og koblet til opnåelse antistof-enzym-konjugater. Konjugater blev oprenset ved HPLC. Antistofaktiviteterne i de rensede konjugater blev bestemt ved konkurrence ELISA og post-konjugation enzymaktiviteter blev opdaget af funktionelle assays specifikke for hver detektor enzym.

CEER analyser.

Immuno-microarray dias blev skyllet 2X med TBST (50 mM Tris /150 mM NaCl /0,1% Tween-20, pH 7,2-7,4), blokeret med 80 pi Whatman blokeringsbuffer i 1 time ved stuetemperatur, derefter vasket 2X med TBST. Seriefortyndet lysat-kontroller eller prøver i 80 pi fortyndingsbuffer (2% BSA /0,1% Triton X-100 /TBS, pH 7,2-7,4) blev tilsat til udpegede sub-arrays på objektglas og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur. Objektglas blev vasket 4X (3 min. Hver), og detektor Abs blev tilsat i 80 pi reaktionsbuffer og inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur. Efter vask lysbilleder med TBST at fjerne ubundet detektor Abs, 80 pi biotin-tyramid-opløsning (5 ug /ml i 50 mM glucose /PBS) fremstillet ud fra 400 pg /ml i ethanol-opløsning (Perkin-Elmer Life Science) blev tilsat og inkuberet for 15 minutter i mørke. GO /HRP-medieret tyramid signalforstaerkning proces blev afsluttet ved vask med TBST 4X, 3 min hver. Lokal aflejring af biotin-tyramid blev påvist ved inkubering med streptavidin (SA) -Alexa647 (Invitrogen) ved 0,5 ug /ml i 2% BSA /0,1% Triton /TBS i 40 min. Efter afsluttet inkubation blev objektglassene vasket 4X med TBST, tørret og opbevaret i mørke indtil de blev afbildet via en microarray scanner.

I CEER dataanalyse, objektglas blev scannet ved fire PMT gain indstillinger for at forøge den effektive dynamiske rækkevidde. Baggrund-korrigeret signalintensiteter blev midlet for pletter trykt i tre eksemplarer. Flere kriterier blev anvendt til at filtrere data til yderligere analyser, herunder grænser for spot fodspor, variationskoefficient for spot gentagelser, og den samlede pad baggrund. For hver assay blev en standardkurve genereret fra serielt fortyndede kontrol- cellelysater fremstillet ud fra cellelinier med velkarakteriserede signaltransduktion proteiner. Data blev tilpasset til en fem-parameter ligning udledt som en funktion af capture-antistofkoncentration og PMT. Standardkurven for hver markør var egnet som en funktion af log-signalintensiteten, målt som relativ fluorescens enhed (RFU) mod log koncentration af cellelysater og refereret til faste cellelinier. For eksempel blev standardkurve for serielt fortyndede cellelysater fremstillet ud fra BT474 anvendes til at normalisere HER2-ekspression og graden af ​​phosphorylering i hver prøve (figur S2). Derfor en prøve med en CU af HER2 udtryk har RFU værdi svarende til RFU værdi på 1 standard henvisning BT474 celle. Som reference celler har 1~2 × 10

6 HER1 eller HER2-receptorer pr celle med ca. 10% phosphorylerede receptorer, 1 CU er udtryk for 1~2 × 10

6 RTK’er eller 1~2 × 10

5 phosphorylerede RTK’er [6]. Detektionsgrænsen (LOD) værdien af ​​CU var bestemt til at være mindre end 1 CU for både udtryk og aktivering af HER2. Individuelle forudsigelser fra hver fortynding og gevinsten blev midlet i en enkelt, endelig forudsigelse.

trunkeret HER2 Enrichment

fuld længde p185-HER2 receptorer blev tømt fra tumor væv lysater med magnetisk-perle koblede antistoffer specifikke for ekstracellulært domæne (ECD) af HER2 som vist i fig S3. Resulterende p185-HER2 udtømte lysater, som indeholdt beriget trunkerede HER2 (t-HER2) receptor-proteiner, der mangler ECD, blev anvendt til efterfølgende kvantificering af t-HER2-ekspression og phosphorylering ved hjælp af de respektive CEER assays. En afskåret værdi på 500 CU blev anvendt for at score p95HER2 positivitet pr 20 ug væv analyseret. Den samlede p95HER2 assay udlæsning var i forhold til de signaler, der genereres fra de standardkurver genereret under anvendelse af en kontrol cellelysat fra BT474 brystcancercellelinie. Salg

Cellekultur og reagenser Salg

CEER assay kontrol cellelinjer , MDA-MB-468, T47D, HCC827 og BT474 celler med varierende grader af ErbB-RTK-ekspression blev opnået fra ATCC og dyrket ved 37 ° C i 5% CO

2 – for MDA-MB-468 (Dulbeccos minimale essentielle medium (DMEM) + 10% FBS), BT474 (DMEM + 10% FBS), og HCC827 og T47D (RPMI 1640 + 10% FBS, 0,2 U /ml bovint insulin). Celler blev talt og vasket med 1 × PBS før vækstfaktorstimulering. MDA-MB-468 celler blev stimuleret med 100 nM epidermal vækstfaktor (EGF) eller transformerende vækstfaktor a (TGFa), blev T47D-celler stimuleret med 20 nM heregulin β (HRGβ) eller 100 ng /ml insulin-lignende vækstfaktor-1 (IGF1) i serumfrit vækstmedium i 5 eller 15 min. Stimulerede celler blev vasket med 1 x PBS og derefter lyseret (lyseringsbuffer: 50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Trition X-100 og 2 mM Na

3VO

4) og holdt på is i 30 min, før du tager supernatanten for en efterfølgende analyse eller holdt ved -80 ° C.

CEER markør beslutsomhed og zonekort clustering

Positivitet for en given biomarkør blev defineret som større end den tredje kvartil for en individuel biomarkør i patientpopulationen i denne undersøgelse. Patienterne blev rangeret baseret på CU værdien fra CEER analysen for en given biomarkør. De patienter, der er større end den tredje kvartil cutoff blev behandlet på højeste risiko for at have forhøjede biomarkør niveauer og derfor potentielt aktiverede signalveje. Efterfølgende overlevelse analyse blev udført for at vurdere prsedikativ kvaliteten af ​​disse cutoffs.

biomarkør profil af tumorprøver var repræsenteret ved et zonekort. Hver celle blev farvelagt baseret på tiendedel rang af aktiveringen af ​​denne markør. Hver markør blev sorteret efter deciler, repræsenteret ved en tydelig skygge, med skalaen angiver farven. Både række (patienten) og søjle (markør) klyngedannelse blev vist. Den komplette kobling algoritme blev anvendt til at opnå en hierarkisk klynge (eller dendrogram) ved sekventielt gruppere de mest korrelerede observationer ved hjælp af hclust funktion i R, kaldet af heatmap.2 tilgængelig med gplots bibliotek af det statistiske miljø R: A Sprog og Miljø for Statistisk Computing (https://www.r-project.org/). Undergrupper af markører blev defineret af klyngedannelse, der tillod sammenligninger af markør profiler for patienterne.

CTC og ATC isolation

For CTC evaluering, 7,5 ml blodprøver blev trukket ind i 10-ml evakueret ethylendiamin tetraeddikesyre (EDTA) rør. Den CellSearch System (Veridex) blev anvendt til immuno-magnetisk CTC isolation ifølge protokollen beskrevet tidligere [6] ved brug af ferrofluider konjugeret til Ab mod epitel celleadhæsionsmolekyle. For ATC evalueringen blev cellulære indhold beriget fra 50 til 100 ml ascitesvæske ved centrifugering og immuno-magnetisk tumorcelle isolation blev udført på en tilsvarende måde. Flere sæt af ATC blev behandlet med cocktails af vækstfaktorer (EGF, HRG, HGF og IGF1) med eller uden lapatinib og PHA-665.752 inhibitor kombination.

Resultater og diskussioner

Patient karakteristika

Karakteristik af 434 GC patienter er angivet i tabel 1. Alle patienter fik gastrectomies med D2 lymfeknude dissektion med 242 (55,8%) patienter, der fik Subtotal gastrectomies. Ifølge AJCC 2002 iscenesættelse systemet, 86 patienter havde patologisk stadium I, 116 havde stadie II, 126 havde stadium III og 106 havde stadie IV (35 patienter med metastatisk M1) GC. På tidspunktet for analysen, 226 patienter var døde og 237 patienter havde dokumenteret gentagelse. 70 patienter havde signetring celle karcinom. Den 5-årige samlet og sygdomsfri overlevelse var 52,4% og 50,0%, hhv. Alle primære GC væv blev anskaffet på tidspunktet for kirurgi og straks lynfrosset til fremtidig molekylær analyse.

CEER assays afslører heterogenitet i HER2 udtryk og tilstedeværelse af HER2 afkortede variant, p95HER2, i HER2 ( +) gastriske cancere

Vi har tidligere rapporteret udvikling af immuno-microarray baserede CEER assays [6], [15]. Vi brugte CEER-baserede HER2 assay at undersøge HER2 status for HER2 (+) og HER2 (-) prøver i vores GC patient kohorte, der blev udskilt baseret på standard IHC HercepTest /FISH-analyse. Fordelen ved CEER assays er deres højere følsomhed og specificitet sammenlignet med IHC-baserede assays [6]. Baseret på de nuværende HER2 (+) definitioner for GC’er [13], [14], dvs. prøver med et HER2-IHC score på 3+ eller 2+ og en positiv

HER2

genamplifikation status, 50 af 434 (11,5%) prøver i vores GC patient kohorte var HER2 (+) ved IHC HercepTest /FISH-analyse (tabel S1). I modsætning hertil ifølge de ICH retningslinjer specifikke for brystkræft, kun 78% (39/50) af disse patienter var HER2 (+) (tabel S1) med angivelse af forskellene i scoring kriterier for HER2 positivitet mellem gastriske og brystcancer. Et flertal af HER2 (+) GCS (36 ud af 50 prøver (72%)) var af den intestinale undertype snarere end diffuse eller blandet type GCS efter aftale med offentliggjorte rapporter [13], [16], [17].

CEER-baserede HER2-assay demonstrerede væsentligt højere HER2-ekspressionsniveauer i IHC /FISH HER2 (+) tumorer sammenlignet med dem i HER2 (-) tumorer (med en middelværdi på 77,9 CU vs. 4,3 CU, p-værdi 8.18E-10) som vist i figur 1A. CEER-baserede HER2 data præsenteres i CU, en standard funktionel enhed baseret på cellelinie styrer med kendt HER2-ekspression [6], der muliggør en sammenligning af HER2-ekspression tværs prøver. Kun 32/50 eller 64% af IHC /FISH HER2 (+) GCS demonstrerede HER2 ekspression ved CEER og der var en betydelig grad af heterogenitet i HER2 udtryk i disse prøver, som afsløret af de kvantitative CEER udlæsninger. Heterogenitet HER2 udtryk kan forklare årsagen til kun en moderat grad af konkordans (87,5%) mellem IHC og FISH udlæsninger for HER2 i ToGA forsøget [12]. Denne uoverensstemmelse vil direkte påvirke resultatet af HER2-målrettede lægemidler såsom trastuzumab i GC’ers. Som følge af den høje følsomhed CEER assay, blev det bemærket, at -20% af IHC /FISH HER2 (-) GCS stadig udtrykte samlede HER2 omend på tydeligt lavere niveauer end HER2 (+) patientpopulation

.

(A) CU fordeling for HER2 udtryk for GC prøver på 0,25 pg lysat.

x

aksen repræsenterer IHC /FISH status, og

y

aksen repræsenterer CU værdier fra CEER analysen som bestemt ud fra et BT474 standardkurve. Adskillelse er illustreret mellem de to grupper med en median på 0 til IHC /FISH negativ population (384 af 434) sammenlignet med en median på 11 til IHC /FISH positive population (50 af 434). En mættet prøve, over grænsen for kvantificering og angivet som “Number mættet« i den tilsvarende tabel, er ikke vist. Kasser repræsenterer interkvartile område, med det 75. percentil foroven og den 25. percentil nederst. Linjen i midten af ​​boksen repræsenterer medianen. Whiskers omfatte den højeste og laveste værdi inden for 1,5 gange den interkvartile område.

P Drømmeholdet værdi 0,001 blev bestemt ved Wilcoxon-test. (B) CU fordeling for p95HER2 i en undergruppe af tumorprøverne (58 af 434) ved 20 ug lysat.

x

aksen repræsenterer IHC status, og

y

aksen repræsenterer CU værdier fra CEER assay for P95. Fuld længde HER2 blev fjernet ved immuno-depletion før assayet. Datapunkterne er farvet baseret på HER2-status ved IHC og FISH. Som vist, blev et datapunkt med en IHC 2 bestemt til at være positive ved FISH-analyse. Af de 34 prøver, bestemt til at være positive for P95 med CEER, 24 (71%) af dem var HER2 (+) ved IHC /FISH. p95HER2 udtryk kunne ikke bestemmes i en prøve, der er angivet som “Number NA« i den tilsvarende tabel.

Brug af CEER-baserede p95HER2 assay platform, blev trunkerede former af HER2 specifikt opdaget, foruden til fuld længde HER2, i GC’er for første gang. p95HER2 ekspression blev analyseret i 31/50 HER2 (+) prøver og 27/384 HER2 (-) prøver), der viste en signifikant fuld længde HER2-ekspression ved CEER (figur 1B). Forekomsten af ​​p95HER2 i HER2 (+) GCS var ~77% (i 24/31 prøver) (tabel S1). Svarende til fuld længde HER2-ekspression, at størstedelen af ​​p95HER2 ekspression (79% af p95HER2 udtrykt i HER2 (+)) blev påvist i intestinale typen GCS. p95HER2 ekspression blev også observeret i en lille procentdel af HER2 (-) GCS (37% eller 10/27 prøver), der viste fuld længde HER2-ekspression. Men den gennemsnitlige p95HER2 udtryk i HER2 (+) GC prøver var signifikant højere end hos HER2 (-) GCS (5083,6 CU i HER2 (+) vs 437,0 CU i HER2 (-), p-værdi = 1.27e-05 ). p95HER2 kan bidrage til trastuzumab ikke-lydhørhed i GC tumorer, som det gør i 70-80% af HER2 overekspression brystkræft [18]. Trastuzumab plus standard kemoterapi gjort en samlet respons på kun 47% i HER2 (+) GCS i ToGA forsøget [12] indikerer eksistensen af ​​mulige trastuzumab resistensmekanismer og vores manglende evne til at vælge trastuzumab respondenter præcist. For klinisk validere p95HER2 udtryk med trastuzumab modstand, der har været kontroversiel, især på grund af de seneste modstridende resultater fra brystkræft studier GeparQuattro [19], stringent p95HER2 assay raffinement i form af klinisk-relevante diagnostiske assay cut-off bestemmelser og anvendelighed i kliniske omgivelser er påkrævet. En validering af p95HER2 udtryk er planlagt i et fase II neoadjuverende lapatinib plus kemoterapi klinisk forsøg i GC patienter, da flere undersøgelser tyder brugen af ​​lapatinib i p95HER2 (+) kræft [20], [21].

Samlet klart vores data definere HER2 status i GC’ers og demonstrere anvendeligheden af ​​CEER-baserede HER2 diagnostik i GC patientprøver for at bestemme deres nøjagtige fuld længde og afkortet HER2 udtryk. Udviklingen af ​​sådanne diagnostik vil kraftigt påvirke præcis udvælgelse af HER2 (+) GCS, der responderer på trastuzumab og andre HER2 målretning agenter. Vi har tidligere rapporteret brugen af ​​CEER-baserede HER2 diagnostik i brystkræftpatienter [6], [15], som viste en højere sensitivitet og specificitet i forhold til IHC-baseret diagnostik.

Gastric kræftformer demonstrerer samtidig aktivering af signalveje

Vi brugte CEER analysen direkte på GC prøver at vurdere tilstedeværelsen af ​​totale og fosforylerede (aktiverede) former af adskillige signalmolekyler, der er kendt lægemiddeltargets: disse omfattede flere RTK’er (HER1, HER2, HER3, cMET, IGF1R) og PI3K. Repræsentative billeder af multipleksede CEER forløb-arrays fra otte forskellige prøver er vist i figur 2A. Disse billeder viser klart heterogenitet i aktiverede pathway signaturer, der er fremherskende i GC’ers. For eksempel er både HER1 /HER2 coactivated i prøve 1 og 6, mens kun HER2 aktiveres i prøve 2 selvom HER1, HER2 og cMET udtrykkes til høje niveauer. Prøve 5 viser aktivering af alle 5 analyserede RTK’er, herunder den nedstrøms PI3K og Shc pathways. Det følgende afsnit beskriver signalvejen heterogenitet observeret i vores GC patient kohorte som bestemt af CEER assays.

(A) Repræsentative immuno-array-billeder til sti profilering af angivne signal transduktion proteiner. Array signal intensitet spænder fra sort /mørkeblå (lav) til rød /hvid (høj /mætning). (B) Heat kort og hierarkisk gruppering af de 434 prøver baseret på CU værdier fra CEER assay for phosphorylerede markører målt ved 10 μ g lysat koncentration. Hver kolonne repræsenterer en markør, og hver række repræsenterer en patientprøve. Relative niveauer af phosphorylering er afbildet med en farveskala, hvor rød repræsenterer det højeste niveau af aktivering og grøn repræsenterer det laveste niveau. De CU værdier for hver markør (kolonne) blev sorteret efter deciler. Jitter, mellem 0 og 0,1, blev tilsat til hver biomarkør CU værdi for at skabe lige store siloer. Række og kolonne dendrogram viser resultatet af klyngedannelse beregning hierarkiske.

Tumorer fra 202 patienter (46,5%) havde ingen påviselig aktivering af de testede i vores undersøgelse RTK’er. Pathway aktiveringsmønstre for resten af ​​tumorerne, som afbildet i en pathway clustering analyse (figur 2B), varierede bredt med nogle GCS demonstrerer samtidig aktivering af flere RTK’er såsom HER2 /HER3, HER1 /2/3, HER1 /3 /cMET eller HER3 /cMET mens andre blev phosphoryleret kun på et enkelt protein. Indholdet af alle de analyserede prøver tumor var 70% baseret på deres histologisk undersøgelse. Men den pan-cytokeratin (pan-CK) udtryk var tydelige variabel tyder heterogenitet i epitel indhold GC’ers. Baseret på denne profilering, vi kategoriseret de 434 GC prøve kohorte efter deres RTK aktivering signaturer og HER2-status

HENDES akse i gastrisk kræft. (Tabel 2 Tabel S1).

mindst et receptor medlem af HER-aksen blev aktiveret i 41% af GC patienterne. HER2 phosphorylering blev påvist ikke kun i 50% af HER2 (+) GC patienter, men også i -22% af HER2 (-) kræftformer i samråd med den observerede totale HER2 ekspression tidligere beskrevet. 16/25 HER2 (+) prøver som viste aktiverede HER2 udtrykte også p95HER2. Ligeledes HER3 blev også phosphoryleret i en højere procentdel af HER2 (+) GCS (36%) sammenlignet med HER2 (-) cancere (~24%). Men phosphoryleret HER1 ikke en sådan præference og blev tilsvarende aktiveret i begge GC typer (26% i HER2 (+) og 25% i HER2 (-)). Endvidere er de fleste af HER medlems aktiveret GC tumorer (~64%) viste en samtidig aktivering af andre RTK’er, dvs. cMET eller IGF1R. Histologisk et flertal af HER2 (+), tarm typen GC’er udtrykte en aktiveret HER2 (i 22/36 eller ~61%) efterfulgt af HER3 (i 13/36 eller ~36%) med en samlet 36% af tarm typen GCS udtrykker et aktiveret HER2 pathway. Samlet, HER2-aktivering var mere koncentreret i intestinal type (55/154 eller 35,7%) sammenlignet med diffus-type cancere (43/225 eller 19,1%) af. I modsætning hertil blev aktiveret HER1 lige observeret i både intestinal-type (38/154 eller 24,7%) og diffus type (58/225 eller 25,8%) GCS. Aktiveret HER3 var også tilsvarende til stede (29,9% og 21,8%) mellem de to Laurens undertyper klassificering.

Da signalering funktionen af ​​HER kinase aksen er afhængig aktiveret receptor-dimerisering, vi kiggede på de forskellige par af HER medlem coactivations. Coactivation af HER2 med HER3 blev foretrukket i HER2 (+) kræft (13/50 eller 26%) med 7/13 HER2: HER3 aktiverede GCS uden HER1 coactivation. Ca. 54% af HER2: HER3 coactivated HER2 (+) GCS co-udtrykt p95HER2. På den anden side, HER2 (-) GCS viste ikke en præference for en bestemt HER kinase dimer par med alle tre mulige aktiverede dimer par (HER1: HER2, HER1: HER3 og HER2: HER3) udtrykt i -15% hver af HER2 (-) prøver. Triple aktivering af HER1 /2/3-receptorer blev observeret i 11,1% af GC’ers med en marginalt højere fordeling i HER2 (-) kræftformer

cMET aktiveret gastrisk kræft (tabel 3 Tabel S1).

.

Svarende til HER1 blev cMET phosphorylering tilsvarende fordelt mellem HER2 (+) (22%) og HER2 (-) (-25%) GC’er. Desuden aktiveret cMET fordeling baseret på Lauren histotype var ens mellem tarm (48/154 eller 31,2%) og diffus-type (55/225 eller 24,4%) GC’er.

Flertal af cMet aktiveret GC prøver (~ 71% eller 77/108) viste en samtidig aktivering af HER kinase receptor medlemmer. Alle prøver med en phosphoryleret cMET demonstrerede en

cMet

amplifikation (data ikke vist).