PLoS ONE: kliniske betydning af EML4-ALK Fusion Gene og associeringsaftalen med EGFR og KRAS genmutationer i 208 kinesiske patienter med ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

EML4-ALK fusion gen er for nylig blevet identificeret i en lille delmængde af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) patienter, der reagerer positivt på ALK-inhibitorer. Egenskaberne ved EML4-ALK fusionsgen i kinesiske patienter med NSCLC er dårligt forstået. Her rapporterer vi om forekomsten af ​​EML4-ALK, EGFR status og KRAS mutationer i 208 kinesiske patienter med NSCLC. EGFR mutationer blev fundet i 24,5% (51/208) af patienterne. I konkordans med tidligere rapporter, blev disse mutationer identificeret ved høje frekvenser hos kvinder (47,5% vs. 15,0% hos mænd;

P

0,05); aldrig-rygere (42,3% vs. 13,9% i rygere;

P

0,05), og adenocarcinom patienter (44,2% vs 8,0% i ikke-adenocarcinom patienter;

P

0,05) . Der var kun 2,88% (6/208) patienter med KRAS mutationer i vores studiegruppe. Vi identificerede 7 patienter, der nærede den EML4-ALK fusion gen (3,37%, 7/208), herunder 4 tilfælde med variant 3 (57,1%), 2 med variant 1, og 1 med variant 2. Alle positive tilfælde svarede til kvindelige patienter (11,5%, 7/61). Seks af de positive tilfælde var ikke-rygere (7,69%, 6/78). Forekomsten af ​​EML4-ALK translokation i kvindelige, røgfrie adenocarcinom patienter var så høj som 15,2% (5/33). Der blev ikke påvist EGFR /KRAS-mutationer blandt EML4-ALK-positive patienter. Patologisk analyse viste ingen forskel mellem fast signet-ring celle mønster (4/7) og mucinøs cribriform mønster (3/7) i ALK-positive patienter. Immunfarvning viste intra- heterogenitet ALK omlægning i de primære carcinomer og 50% (3/6) af metastatiske tumorer med ALK-negativ farvning. Meta-analyse viste, at EML4-ALK translokation forekom i 4,84% (125/2580) af ikke-valgte patienter med NSCLC, og var også fremherskende i røgfri patienter med adenocarcinom. Tilsammen EML4-ALK translokationer var sjældne i hele NSCLC patientpopulation, men var hyppige i NSCLC undergruppe af kvindelig, ikke-ryger, adenocarcinom patienter. Der var intra- heterogenitet ALK omlægning i de primære carcinomer og metastatiske steder

Henvisning:. Li Y, Li Y, Yang T, Wei S, Wang J, Wang M, et al. (2013) kliniske betydning af EML4-ALK Fusion Gene og associeringsaftalen med EGFR og KRAS genmutationer i 208 kinesiske patienter med ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 8 (1): e52093. doi: 10,1371 /journal.pone.0052093

Redaktør: Giuseppe Viglietto, University Magna Graecia, Italien

Modtaget: April 10, 2012; Accepteret: November 14, 2012; Udgivet: januar 14, 2013 |

Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning er støttet delvist af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81172233), videnskab og teknologi Support Key Program for Tianjin (09ZCZDSF04000, 09ZCZDSF03800), Tianjin Natural Science Foundation (12JCZDJC24400), projektet med Undervisningsministeriet for New Century Fremragende Talents (NCET-10-0956), og Wujieping Foundation (320.6720.10007, 320.6740.10008, 3.206.720,10008). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er en førende årsag til cancer-relaterede dødsfald, hvor det er forbundet med en 5-års verdensomspændende overlevelse på mindre end 15% [1], [2]. Ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) tegner sig for ca. 80% af lungecancere [3]. Cisplatin kemoterapi har produceret en betydelig overlevelse i bedste understøttende behandling hos patienter med fremskreden NSCLC; imidlertid er resultater for NSCLC-patienter stadig anses for utilfredsstillende [3], [4]. Traditionel kemoterapi og strålebehandling er forbundet med betydelige bivirkninger hos alle patienter med NSCLC, på grund af deres mangel på specificitet. Udvikling og anvendelse af lægemidler, der er målrettet specifikke molekyler udtrykt på lunge kræftceller har høstet øget opmærksomhed, og bemærkelsesværdige succeser er blevet rapporteret i flere NSCLC patientgrupper studiegrupper [5], [6], [7], såsom en undergruppe af patienter med NSCLC tester positiv for aktiverende mutationer i den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) genet. Disse cancertyper udviser følsomhed over for EGFR tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er), såsom gefitinib eller erlotinib, støtte brugen af ​​disse lægemidler til effektiv behandling af NSCLC [5], [8]. Blandt patienter, der bærer EGFR aktiverende mutation, der tidligere har ubehandlet, fremskreden sygdom, er gefitinib blevet påvist at være overlegen over for cytotoksisk kemoterapi [4], [9], [10]. Anvendeligheden af ​​EGFR TKI’er hos disse patienter understreger vigtigheden af ​​at identificere genotypespecifikke patientundergrupper at styre selektionen af ​​målrettede behandlinger.

For nylig et fusionsprotein mellem den N-terminale del af pighuder mikrotubulus-associeret protein -lignende 4 (EML4) protein og den intracellulære signalering del af anaplastisk lymfom kinase (ALK) tyrosinkinasereceptor er blevet identificeret i en lille delmængde af NSCLC-patienter [11]. Patienter huser EML4-ALK-fusionsprotein demonstrerer unikke kliniske patologiske og fysiologiske egenskaber [12], [13]. Adskillige rapporter har identificeret denne fusionsprotein overvejende unge kvindelige ikke-rygere med adenocarcinom [11], [14], mens andre rapporter har beskrevet denne fusion protein i forskellige populationer [15], [16]. Det lille samlede antal positive tilfælde identificeret pr Undersøgelsen kan forklare disse forskelle. Egenskaberne ved EML4-ALK i lungekræft mangler at blive belyst, især i kinesiske patienter med NSCLC. Er forekomsten af ​​EML4-ALK-mutationer, ligesom EGFR mutation, er knyttet til en bestemt etnicitet?

De EGFR /KRAS mutationer og den EML4-ALK translokation kaldes driver mutationer, fordi de er ansvarlige for både indledningen og vedligeholdelse af lungekræft. Adenokarcinomer udviser distinkte genomiske ændringer, der kan klassificeres i klinisk relevante molekylære delmængder ifølge KRAS, EGFR, og EML4-ALK-status. Specifikke mutationer i disse gener fremkalde differentierede tumor følsomheder til målrettede terapeutiske midler. For eksempel tumorer, der bærer dominante somatiske mutationer i EGFR exoner er typisk følsomme over for EGFR-TKI’er. Tumorer indeholdende somatiske mutationer i KRAS, der koder for et GTPase nedstrøms for EGFR, udvise større resistens over for disse medikamenter. Derfor er det nødvendigt at forstå sammenhængene mellem EML4-ALK og EGFR /KRAS-mutationer hos patienter med lungecancer.

Her rapporterer vi om de kliniske og patologiske store karakteristika ved denne fusion i 208 kinesiske NSCLC patienter og vi korrelere det med tilstedeværelsen af ​​EGFR og KRAS-mutationer i de samme patienter. Vi præsenterer også en meta-analyse af EML4-ALK fusion gen.

Resultater

Kliniske karakteristika af EML4-ALK fusion gen i kinesisk NSCLC patienter

I 2007 Martelli et al. evaluerede patienter, der udtrykte EML4-ALK udskrifter, anvendelse af fluorescens

in situ

hybridisering, og fandt, at kun ca. 1,8% af cellerne husede den EML4-ALK-genet fusion [17]. Disse forskere var ude af stand til at detektere EML4-ALK protein ved immunhistokemi, Western blotting, eller immunpræcipitation. RT-PCR er den mest følsomme og mest populære påvisningsmetoden øjeblikket. Vi udførte nested RT-PCR til amplifikation af fusion region af translokation. Vi vurderede følsomheden af ​​vores nested RT-PCR-protokol ved at forstærke serielt fortyndet cDNA fra H2228 celler. Den nestede RT-PCR opdaget EML4-ALK fusionsgenet ved en lavere grænse på 7,8 × 10

-4 ng input cDNA (figur 1A).

Nested RT-PCR blev udført under anvendelse af seriefortyndet cDNA fra H2228-celler. Så lidt som 7,8 × 10

-4 ng cDNA kan anvendes til konsekvent detektering af varianten 3 fusion transkript med denne protokol (øvre panel). Repræsentative gelelektroforese resultater for nested RT-PCR (nedre panel). Bane markør: 200 bp stige; positiv kontrol: H2228; negativ kontrol: A549. Andre baner svarer til prøver udstille EML4-ALK translokation, mærket med sagsnummer.

Der var 208 NSCLC patienter i vores undersøgelse, og deres kliniske og patologiske egenskaber er detaljeret i tabel 1. Resultaterne af indlejrede RT-PCR-amplifikationer af EML4-ALK fusionsgen er vist i figur 1B. Vi identificerede 7 patienter, som nærede den EML4-ALK fusionsgenet (3,37%, 7/208), hvilket blev bekræftet ved DNA-sekventering (figur 2). Af disse 7 patienter, 2 tilfælde vises EML4-ALK variant 1 (28,6%, 2/7), 1 tilfælde udstillet variant 2 (14,3%, 1/7) og 4 tilfælde udført variant 3 (57,1%, 4/7) . Derfor kan variant 3 være den fremherskende variant blandt kinesiske NSCLC patienter med mere end halvdelen af ​​de EML4-ALK translokationer udviser fusioner mellem exon 6 af EML4 og exon 20 af ALK.

(A) variant 1, (B ) variant 2, (C) variant 3.

De kliniske karakteristika for disse 7 patienter er beskrevet i tabel 2. Seks sager involverede adenocarcinom og ét tilfælde involveret adenosquamøst karcinom. Tests for andre typer af karcinom var negative (0/106). Som vist i tabel 3, forekomsten af ​​den EML4-ALK fusionsgen var 6,32% (6/95) hos adenocarcinom tilfælde og 14,2% (1/7) blandt adenosquamøst carcinom tilfælde. Alle positive tilfælde svarede til kvindelige patienter, hvilket resulterer i en positiv blandt kvinder i 11,5% (7/61;

s

= 0,000). Seks af de positive tilfælde var ikke-rygere (7,69%, 6/78). Frekvensen af ​​EML4-ALK translokation blandt kvindelige adenocarcinom patienter røgfrie var 15,2% (5/33). Den mediane alder af EML4-ALK-positive tilfælde (55 ± 10,38) var meget lavere end for EML4-ALK-negative patienter (61,78 ± 8,71;

s

= 0,045). Ingen signifikante associationer blev påvist mellem genet fusion og scene eller metastatisk status.

Histologisk analyse af EML4-ALK-positive lungekræft

Som vist i figur 3, alle 7 af ALK-positive tumorer mindst nærede en adenocarcinom komponent. Kun ét tilfælde (sag 4) havde omdrejningspunkt skællede differentiering (der tegner sig for 20% af tumor volumen). Den adenocarcinom komponent viste en varieret histomorphology, og den dominerende mønster vækst var papillær (eller mikropapillære) i en sag (sag 1), acinære i 3 tilfælde (sag 2, 6 og 7), og solid i 3 tilfælde (sag 3, 4 og 5). Men de fleste tilfælde (5/7) faktisk havde en blandet adenocarcinom komponent herunder papillær eller mikropapillær, signet-ring celler, og mukøse celler. På baggrund af de tidligere rapporterede patologiske mønster for ALK-positive karcinomer [18], 57,14% (4/7, sagerne 1, 3, 4 og 5) i ALK-positive tilfælde viste det faste signet-ring celle mønster og 42,86% (3/7 sagerne 2, 6 og 7) i sager viste mucinøs cribriform mønster. En psammoma krop blev også identificeret i sag 6, hvilket var en blandet adenocarcinom med signet-ring celler, mukøse celler og mikropapillære komponent. Interessant, fandt vi et rent noninvasiv mucinøs BAC (bronchioloalveolar karcinom) i sag 7, hvor bæger celler viste en lepidic vækstmønster. Væv fra metastatiske lymfeknuder var tilgængelige i seks af de ALK-positive tilfælde. Papillær eller mikropapillær, signet-ring celler med ekstracellulære slim, og cribriform struktur blev identificeret i 2 (sagerne 1 og 2), 1 (sag 6), og 3 (sagerne 3, 4 og 5) tilfælde hhv. Fem sager viste det faste signet-ring celle mønster, og en sag (sag 6) viste mucinøs cribriform mønster.

De primære tumorer i sagerne 1, 3, 4 og 5 viste den faste signet-ring celle mønster sammensat af solid vækst med papillær (eller mikropapillære) eller en signet-ring celle komponent, og andre primære steder af sagerne 2, 6 og 7 viste mucinøs cribriform mønster bestående af rigelige ekstracellulære slim og cribriform strukturer. I lymfeknude metastaser sites, blev fast signet-ring celle mønster identificeret i sagerne 1-5, og mucinøs cribriform mønster blev kun set i sag 6.

Desuden en 3-lags klassificeringssystem af lunge adenokarcinomer baseret på histologiske mønster blev rapporteret af Sica et al [19], herunder Grade i: et mønster med lav kvalitet (BAC), Grade II:. mønster med mellemliggende bedømmelse (acinære og papillær); og grad III: mønster med høj bedømmelse (fast og mikropapillære). Ved hjælp af denne grading system, kun Case 7 tilhørte Grade I, og alle de andre tilhørte Grade III, da de fleste af dem blev blandet adenokarcinomer med lymfeknude metastaser.

Dernæst udførte vi ALK immunhistokemi farvning (ALK-IHC ) af primære og metastatiske tumorer af alle ALK-positive tilfælde. Som vist i figur 4, ALK-IHC var positiv i alle primære tumorer, og ALK-protein-ekspression blev placeret i cytoplasmaet. Desuden blev ALK-positiv farvning ikke set i hver primær tumorcelle. Det var meget tydeligt i sag 4 med adenosquamøst carcinom, hvor ALK immunfarvning opstod i adenocarcinom komponent, men ikke i pladecarcinom komponent. Dette resultat er angivet et fænomen af ​​intratumor heterogenitet ALK omlægning i den primære tumor sites. Desuden var der kun 3 sager (sagerne 2, 5 og 6) med ALK-positiv farvning i metastatiske tumorer. De øvrige 50% af de metastatiske tumorer var helt ALK-negativ farvning, herunder sagerne 1, 3 og 4. Case 4, selvom metastatiske tumorer omfattede det meste af adenocarcinom komponent, stadig ALK immunfarvning var helt negativ.

ALK-positive immunfarvning blev vist i primære tumorer i alle 7 ALK-omarrangeret lungekræftpatienter med diffus farvning i cytoplasmaet. ALK-positiv farvning var ikke synlige i hver primær tumor celle, især i Case 4, som er en adenosquamøst carcinom med ALK positiv farvning kun i adenocarcinom del, ikke i pladecarcinom komponent (angivet i rød tekst: Adeno og Squamøs). For de lymfeknude metastaser sites, Etuier 2, 5 og 6 viste ALK-positiv farvning og Sager 1, 3 og 4 viste ALK-negativ farvning.

Endelig ALK immunfluorescensfarvning (ALK-IF) blev også ansat i ALK-IHC af de primære og metastatiske tumorer i alle ALK-positive tilfælde, hvilket yderligere bekræftede de ALK-IHC fund. Som vist i figur 5, ALK-IF var også positiv i alle primære tumorer, med ALK-protein lokaliseres i cytoplasmaet. Lignende resultater blev opnået med ALK-IHC, hvor 50% af de metastatiske steder viste fuldstændig ALK-negativ farvning i sagerne 1, 3 og 4. Vi udførte også RT-PCR for EML4-ALK-genet med cDNA fra alle metastatiske tumorer og opnået de samme resultater, det vil sige negativ ekspression af EML4-ALK-genet i sagerne 1, 3 og 4 (data ikke vist). Alle disse data bekræftede intra- heterogenitet ALK omlægning i de primære lungecarcinomer.

ALK-positive immunfarvning blev vist i den primære tumor i alle 7 patienter ALK-omarrangeret lungecancer. For lymfeknude metastaser sites sagerne 2, 5 og 6 viste ALK-positiv farvning og Sager 1, 3 og 4 viste ALK-negativ farvning. Disse resultater svarede til dem for ALK immunohistokemi. ALK: grøn; Ki-67: rød; DAPI:. Blå

EGFR og KRAS-mutationer og kliniske karakteristika for patienter

Af de 208 undersøgte patienter, vi identificeret 51 tilfælde af EGFR-mutationer i exon 18, 19, 20, eller 21 (24,5%, 51/208; tabel S1). Mutationer i exon 18 af EGFR blev identificeret i 3 tilfælde; et exon 19 deletion blev identificeret i 21 tilfælde, og blev påvist mutationer i exon 20 og 21 mutationer i 6 og 26 tilfælde hhv. Fem tilfælde udviste dobbelte mutationer i disse EGFR exoner. Blandt exonerne 18-21, forekom EGFR mutationer, overvejende exonerne 19 og 21 (90,19%, 46/51). I konkordans med tidligere rapporter, EGFR mutation sats adenocarcinom patienter (44,2%, 42/95) var meget højere end i ikke-adenocarcinom patienter (8,0%, 9/113,

P

= 0,000). Hertil kommer, at EGFR mutation var signifikant lavere hos mandlige patienter (15,0%, 22/147) end hos kvindelige patienter (47,5%, 29/61;

P

= 0,000). Blandt ikke-rygere, EGFR mutation sats var 42,3% (33/78), meget højere end blandt rygere (13,9%, 18/130;

P

= 0,000). Ingen foreninger blev identificeret mellem EGFR genmutationer og alder, klinisk fase, tumorstørrelse eller metastase status af patienterne (tabel 3).

Blandt 208 patienter, 6 sager gennemført KRAS-mutationer (2,88%, 6/208 ). Ingen foreninger blev påvist mellem KRAS mutationer og alder, klinisk fase, køn, patologi, rygning status, tumor størrelse, eller metastaser status af patienterne (Tabel 3). Der blev ikke påvist EGFR /KRAS-mutationer blandt EML4-ALK-positive patienter i vores undersøgelse.

Survival analyse

I marts 2011, 181 patienter havde fuldstændige prognose data, herunder 49 dødsfald og 132 sager af overlevelse. Median opfølgning for hele serien var 591 dage (interval fra 0 dage til 1329 dage). Vi gennemførte en overlevelse analyse af disse 181 patienter med hensyn til tilstedeværelsen af ​​EML4-ALK fusionsgener og EGFR /KRAS-mutationer. Vi identificerede 45 patienter med EGFR-mutationer, for hvem median overlevelsestid var 19,3 måneder (578 dage; 124-1281). Af de 136 patienter med normal EGFR, den mediane overlevelse var 19,8 måneder (594.5 dage; 0-1329). Forskellen i median overlevelse gange mellem disse grupper var ikke statistisk signifikant (

P

= 0,467). Vi identificerede 4 patienter med KRAS-mutationer, for hvem mediane overlevelse var 16,3 måneder (489 dage; 233-818). Af de 177 patienter med normal KRAS, den mediane overlevelse var 19,7 måneder (592 dage; 0-1329). Blandt de 181 sager, 7 patienter bar EML4-ALK-fusionsgenet translokation. Den mediane follow-up for disse patienter var 16,8 måneder (504 dage; 360-661), hvilket ikke var signifikant forskellig i forhold til EML4-ALK negative gruppe med 33,4 måneder (594.5 dage; 0-1329) (

P

= 0,655).

Meta-analyse af kliniske karakteristika forbundet med EML4-ALK translokation

Som vist i tabel 4, systematisk analyse af litteraturen afslørede 14 publikationer analysere frekvens og kliniske karakteristika forbundet med EML4-ALK translokation, herunder 2580 NSCLC-patienter. Af disse 125 patienter (4,84%, 125/2580) nærede den EML4-ALK omlejring. Metaanalysen viste, at EML4-ALK translokation var fremherskende hos kvindelige patienter med adenocarcinom. Elleve studier (1825 tilfælde) undersøgte en sammenhæng mellem rygning status og EML4-ALK translokation. Vi har registreret en betydelig skævhed mellem rygere og ikke-rygere grupper (

P

= 0,49), så data blev analyseret ved hjælp af en tilfældig effekt model. En signifikant forskel blev påvist i EML4-ALK positivitet status mellem rygere og ikke-rygere (OR [95% CI] = 0,26 [0,16, 0,43], Z = 5,26;

P 0,05

) (figur 6A) . Disse resultater viste, at rygning status var signifikant associeret med EML4-ALK translokation. Ni rapporter (1413 tilfælde) vurderede EML4-ALK translokation i adenocarcinom og ikke-adenocarcinom grupper. Vi har registreret nogen væsentlig skævhed mellem de to grupper (

P

= 0,50), så en fast effekter model blev brugt. Vores resultater antyder, at EML4-ALK translokation frekvens afveg i adenocarcinom gruppe sammenlignet med den ikke-adenocarcinom gruppe (OR [95% CI] = 2,07 [1,11, 3,84], Z = 2.30

P 0,05

) (figur 6B). Elleve studier (1777 tilfælde) evalueret EML4-ALK translokation i mandlige og kvindelige grupper. Vi fandt ingen signifikant skævhed mellem de to grupper (

P

= 0,95) og analyseret de data ved hjælp af en fast effekt model. Vores resultater indikerede, at der var ingen signifikant forskel mellem de mandlige og kvindelige grupper. (OR (95% CI) = 0,64 [0.40,1.04] Z = 1,80,

P Salg 0,05). (Figur 6C)

(A) Meta-analyse ved hjælp af en tilfældige effekter model viste, at rygning status var signifikant korreleret med EML4-ALK translokation; (B) meta-analyse af data ved hjælp af en fast effekt model viste, at adenocarcinom (AD) signifikant korreleret med EML4-ALK translokation. Den translokation var signifikant hyppigere i AD-gruppen end i den ikke-AD-gruppe; (C) Meta-analyse ved hjælp af en fast effekt model foreslog, at køn ikke var signifikant korreleret med EML4-ALK translokation frekvens.

Diskussion

Lungekræft er en ødelæggende sygdom forbundet med en 5-års overlevelse på ca. 10-15%. Selvom der er udviklet nye kemoterapeutiske lægemidler i de sidste to årtier, er der stadig et stort behov for mere effektive behandlinger. Molekylært målrettede behandlinger fremlægge en ny strategi, der for nylig påvist betydningen af ​​patienter sub-klassificering efter tumor-specifikke biologiske karakteristika.

EGFR og KRAS er to relevante molekyler i NSCLC, og EGFR er målrettet efter EGFR-TKI’er. Disse lægemidler viser stort potentiale i behandlingen af ​​patienter med fremskreden NSCLC. Talrige rapporter har bekræftet, at effekten af ​​EGFR-TKI’er korrelerer med EGFR exon mutationer [5], [8], og at forekomsten af ​​EGFR-mutationer er højere blandt asiater, ikke-rygere, hunner, og patienter med adenocarcinom. Soda et al. (2007) foreslog en ekstra potentielt relevant onkogen begivenhed i lungecancer: fusion af EML4 genet (region svarende til den N-terminale segment) med ALK-genet (region svarende til det intracellulære signalering portion) til at oprette en EML4-ALK fusionsgenet . Den EML4-ALK translokation repræsenterer en ny undergruppe af NSCLC patienter, der reagerer positivt på ALK-inhibitorer [11], [20].

Vores arbejde bekræfter forekomsten (24,5%) af EGFR-mutationer i en umarkeret kinesiske befolkning af patienter med NSCLC. Blandt exons 18-21, opstår EGFR mutationer overvejende (90,19%) i exon 19 og 21. I konkordans med tidligere rapporter, disse mutationer er identificeret ved høje frekvenser i hunner, aldrig-rygere, folk af asiatisk etnicitet, og adenocarcinom patienter. Interessant, hyppigheden (6/208, 2,88%) af KRAS mutationer i vores studiegruppe var meget lav sammenlignet med vestlige lande (12-25%) [21].

Vores arbejde bekræfter også den lave forekomst ( 7/208, 3,37%) af EML4-ALK translokation blandt uselekterede NSCLC patienter, som er i overensstemmelse med meta-analyse af kliniske karakteristika forbundet med EML4-ALK translokation i den publicerede litteratur (4,84%). Dette resultat indikerer, at forekomsten af ​​EML4-ALK-mutationer i den kinesiske befolkning svarer til den tidligere offentliggjorte for befolkningen i andre etniske grupper. Den EML4-ALK translokation kan ikke være knyttet til en bestemt etnicitet, i modsætning til EGFR mutationer i asiater. Desuden analyse af EML4-ALK mutation varianter afslørede, at variant 3 kan være den fremherskende variant blandt kinesiske NSCLC patienter med mere end halvdelen af ​​de EML4-ALK translokationer udviser fusioner mellem exon 6 i EML4 og exon 20 af ALK. Disse resultater antyder endvidere, at forekomsten af ​​EML4-ALK-mutationen ikke kan variere efter etnisk men at en bestemt variant kan være fremherskende i en bestemt etnisk gruppe.

Vores resultater indikerer endvidere, at EML4-ALK translokation forekommer overvejende i hunner, aldrig-rygere, og adenocarcinom patienter. Disse resultater var forskellige fra den meta-analyse af køn, hvori der var ingen signifikant forskel mellem de mandlige og kvindelige grupper. I vores undersøgelse, alle 7 ALK-positive tilfælde var kvinder, og grunden kan skyldes den meget højere rygning sats hos mænd end hos kvinder i Kina. Yderligere analyser viste, at forekomsten af ​​EML4-ALK translokation i kvindelig, ikke-ryger, adenocarcinom patienter er så høj som 15,2%. Disse egenskaber er af stor betydning, fordi kvindelige, ikke-ryger, adenocarcinom patienter typisk er udvalgt til at drage fordel af EGFR-TKI behandling, hvilket indikerer, at en EML4-ALK translokation skærm bør gå forud for TKI-behandling. EGFR /KRAS mutationer og den EML4-ALK translokation kaldes driver mutationer, fordi de er ansvarlige for både initiering og vedligeholdelse af lungekræft. Patienter, der huser den EML4-ALK translokation er normalt ikke reagerer på EGFR-TKI behandling, men kan være følsomme over for ALK-inhibitorer [11], [20].

I vores undersøgelse, sammenligning af EML4-ALK fusion status med tilstedeværelse af EGFR og KRAS mutationer i de samme cancer prøver afslørede, at EML4-ALK-fusioner forekom i fravær af EGFR eller KRAS-mutationer. Selvom tidligere rapporter har indikeret, at ALK fusion kan opstå samtidig med EGFR-mutationer (1/305) og KRAS-mutationer (1/120), kan disse være sjældne hændelser [7], [22]. Yderligere analyse er angivet i de 32 tilfælde af ikke-ryger, kvinde, adenocarcinom patienter, at hyppigheden af ​​EGFR exon mutationer og EML4-ALK translokation var 62,5 %% (20/32) og 15,63% (5/32), henholdsvis, som dækker alle 78,13% (25/32) af disse patienter. Desuden Sasaki et al. for nylig rapporteret, at 6% (3/50) af behandlingsnaive NSCLC patienter med ALK omlægning havde samtidige EGFR aktiverende mutationer, og at ALK omlægning var inaktive i disse patienter på grund af EGFR-mutation [23]. Da de fleste patienter med EML4-ALK fusioner ikke udviser EGFR mutationer, er en specifik molekylær delmængde af adenokarcinomer karakteriseret ved EML4-ALK fusion [14]. I dag er nogle specifikke molekylære lægemidler til EML4-ALK-fusion anvendes til behandling af NSCLC patienter med EML4-ALK translokation. , Foreslås derfor en trinvis fremgangsmåde til at teste for genmutationer i lunge adenocarcinom: først for KRAS, sekund for EGFR, og derefter EML4-ALK translokation. Hvis en tumor er positiv for en KRAS mutation, er yderligere molekylære test kræves, og behandling anbefalinger vil fokusere på kemoterapi, fordi tumorer huser somatiske mutationer i KRAS, som koder for en GTPase neden for EGFR, vise større modstandsdygtighed over for disse målrettede lægemidler. Hvis tumor er negativ, vil det blive testet for EGFR mutationer og EML4-ALK translokation. Et positivt resultat for enten EGFR mutation eller EML4-ALK translokation vil udløse en målrettet behandling:. En EGFR TKI eller ALK-hæmmer

For den patologiske analyse, cribriform struktur, tilstedeværelse af mukøse celler, ekstracellulære slim, og mangel af betydelig nukleare pleomorphism, kunne alle ses i EML4-ALK omarrangeret kræft, som var magen til resultaterne i en tidligere rapport [18]. “Fast signet-ring celle mønster” og “mucinøs cribriform mønster” er to genkendelige cytoarchitecures stede i det mindste fokalt i størstedelen af ​​ALK-positive tumorer [18]. Med hensyn til disse to mønstre, vi ikke se en betydelig forskel mellem fast signet-ring celle mønster og mucinøs cribriform mønster i alle ALK positive tilfælde i vores undersøgelse (4/7 vs 3/7 henholdsvis). Interessant vores ALK Immunofarvning resultater viste, at ikke alle tumorceller var ALK-positiv farvning på de primære steder, især i adenosquamøst carcinom, i modsætning til andre undersøgelser, der rapporterer, at de pladecarcinom komponent pletter positive [18], [24]. Endnu mere overraskende konstaterede vi, at 50% af de metastatiske tumorer var fuldstændig negativ for ALK immunfarvning (IHC og IF). Dette fænomen blev også fundet i andre studier med EGFR-mutationer, som viste 38,0% af tumorer (30 af 79) med en intratumor heterogenitet

EGFR

mutationer og 62,0% (49 af 79) er homogen, enten med

EGFR

mutation eller ingen mutation [25]. Vores immunfarvning også bekræftet intratumor heterogenitet ALK omlægning i primære tumorer, og til vores viden, dette er den første rapport om ALK omlægning i lungekræft ved metastatiske steder versus primære steder, som viste molekylære forskelle. Disse resultater indikerer, at genekspression i den metastatiske tumor er ikke helt svarer til den i den primære tumor. For de patienter, der blev behandlet med de molekylære target narkotika, disse resultater også påpege, at den nye molekylære opdagelse er meget nødvendigt for disse patienter med nye metastatiske steder, især for NSCLC patienter med EML4-ALK translokationer.

Sammenfattende vi bekræfter, at EGFR exon mutationer er hyppige hos patienter med NSCLC, især blandt kvinder, ikke-rygere, og adenocarcinom patienter. EML4-ALK translokationer er sjældne i hele NSCLC patientpopulation, men er hyppige i NSCLC patient undergruppe af kvindelig, ikke-ryger, adenocarcinom patienter. Tilstedeværelsen af ​​en EML4-ALK translokation med samtidig EGFR /KRAS-mutationer er meget sjældent blandt patienter med lungecancer. Vores resultater viser, at påvisning af EML4-ALK translokation i undergrupper af patienter med NSCLC er afgørende for anvendelsen af ​​målrettet terapi.

Materialer og metoder

Patienter og prøver

Prøver blev opnået fra 208 NSCLC patienter, som gennemgik kirurgisk resektion af primær lungekræft ved Institut for lungekræft kirurgi, Tianjin Medical University General Hospital til diagnose og behandling under 2006-2010. Skriftligt informeret samtykke blev opnået, og undersøgelsen blev godkendt af Institutional etiske komité i Tianjin Medical University General Hospital. Inklusionskriterierne var: (1) kirurgisk behandling uden forudgående kemoterapi eller behandling med EGFR-TKI’er; (2) klar diagnose af NSCLC; og (3) tilgængeligheden af ​​væv til biomarkør undersøgelser. Kliniske og patologiske egenskaber ved de inkluderede patienter er anført i tabel 1. Lungekræft mellemstation for hver patient blev udført ifølge den AJCC Cancer Staging Manual, 7. udgave. Patienterne i denne undersøgelse blev uforholdsmæssigt klassificeret i fase III, fordi denne fase af lungecancer er associeret med kirurgisk behandling. Overlevelse tid blev beregnet ud fra den dag, resektion indtil den 6. april, blev 2011. resektion lungevæv straks nedsænket i flydende nitrogen.

H2228, human lunge adenocarcinom cellelinje med EML4-ALK fusion gen, var fra den amerikanske Tissue Culture Collection (ATCC), og blev opretholdt i DMEM indeholdende 10% føtalt bovint serum (GIBCO) ved 37 ° C med 5% CO

2.

RNA-isolering og revers transkription

frosne væv (50-100 mg) blev formalet til et pulver i flydende nitrogen og blev suspenderet i 1 ml TRIzol-reagens (Invitrogen, USA) for total RNA-ekstraktion, ifølge fabrikantens protokol. Total RNA blev kvantificeret ved anvendelse af et spektrofotometer (Beckman-Coulter, USA), og dets kvalitet blev vurderet ved agarosegelelektroforese. Totalt RNA (2 ug) blev revers-transkriberet (RT) ved hjælp af M-MLV revers transkriptase (Promega, USA), med mindre modifikationer til producentens protokol.