PLoS ONE: Elite Model for Generation af induceret pluripotente Cancer Cells (IPCS)

Abstrakt

ineffektivitet generere inducerede pluripotente somatiske celler (IPS) affødt to stridende modeller, nemlig Stokastisk model og Elite model . Selvom førstnævnte er mere gunstigt at forklare de iboende ineffektivitet, kan det være fejlbarlige at ekstrapolere den samme arbejdsmodel til omprogrammering af kræftceller. Faktisk er tumorceller vides at være biologisk heterogen med hensyn til særlige egenskaber, hvorved der tilvejebringes en egnet platform til at teste, om omprogrammering proces af cancerceller er forspændt. Her rapporterer vi vores observationer, at alle tilfældigt plukket inducerede pluripotente kræftceller (IPCS) etablerede tidligere ikke besidder mutationer kendt i forældrenes befolkning. Denne uventede observation er mest parsimoniously forklares ved Elite model, hvor formodede tidlige tumor afkom blev udvalgt under induktion til pluripotens

Henvisning:. Lai J, Kong CM, Mahalingam D, Xie X, Wang X (2013) Elite Model for Generation af induceret pluripotente Cancer Cells (IPCS). PLoS ONE 8 (2): e56702. doi: 10,1371 /journal.pone.0056702

Redaktør: Rajasingh Johnson, University of Kansas Medical Center, USA

Modtaget: September 20, 2012; Accepteret: 14 januar 2013; Publiceret: 13. februar 2013 |

Copyright: © 2013 Lai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Ministeriet for Uddannelse Academic Research Fund Tier 1 tilskud, R-183-000-259-112 og R-183-000-295-112. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion Salg

induceret Pluripotente cancer Cells (IPCS)

Induktion af kræftceller til pluripotens (IPCS) er blevet opnået på forskellige kræftceller og viste lovende resultater af formildende deres [1] tumorgenicitet – [5 ]. Men da hver etablerede pluripotente cancercellevækst koloni antages at være klonal fra en enkelt parental cancercelle, og at den parentale kræftcelle befolkningen antages heterogen, vil det være af interesse gribende at forstå, om den nukleare omprogrammering proces er forspændt. Selvom Yamanaka (2009) foreslog, at generation af inducerede pluripotente stamceller (IPS) er ikke en forudindtaget proces (Stokastisk model) [6], er det faktisk fejlbarlige at ekstrapolere denne model til generering af IPCS, givet heterogenitet af kræftceller .

intratumor heterogenitet

er almindeligt blevet observeret enkelte tumorer at være morfologisk og karyotypiske heterogene [7] – [12], lejlighedsvis tilslører histopathologists i nøjagtig bestemmelse af tumor klasse for klinisk diagnose. Desuden er en klassisk subkloning eksperiment udført af Fidler, I.J. og Kripke, M.L. forudsat overbevisende dokumentation for, at heterogenitet inden for en tumor eksisterer med hensyn til metastatisk evne [13]. Desuden har den aggressive udvikling af næste generations sekventering (NGS) allerede indvarslede mulighed for enkelt kerne sekventering, som foreslog en punkteret model for tumor udvikling [14].

For at teste, om Stochastic modellen holder i omprogrammering af celler, skal en skelnes heterogen population udnyttes til at observere, om nogen delpopulation er overrepræsenteret i omprogrammerede kolonier. Faktisk er denne betingelse opfyldt af kræftceller, som præsenterer en interessant forsøgsopstilling. Hochedlinger

et al.

(2004) observerede, at omprogrammerede mus melanomceller deler en homogen karyotype konfiguration, i modsætning til dets parentale celle population, som er heterogen [15]. Ja, hvis den stokastiske model holder, bør karyotype af den omprogrammeres melanom befolkning være heterogen mellem kloner. en kritisk parameter til fuldt ud at underbygge afvisningen af ​​Stochastic modellen skal dog fastsættes: andelen af ​​forældrenes celler, der besidder den samme karyotype konfiguration som de omprogrammerede celler. Hvis denne andel er stor i den forudgående, statistisk, er der ikke meget grundlag for at afvise den stokastiske model i dette tilfælde. Men hvis andelen er tilstrækkelig lille, er det faktisk opfattes at afvise stokastiske model

Her rapporterer vi lignende bemærkninger om omprogrammering af to ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) celler -. H358 og H460 . Den tidligere blev rapporteret at være

TP53

homozygot slettet [16], sidstnævnte bærer homozygote udgår

CDKN2A

[17] og mutant

CDKN2B

(upublicerede data). Ganske overraskende observerede vi, at IPCS genereret fra disse cancerceller, dvs. iPCH358 og iPCH460, ikke længere nære nogen af ​​de kendte deletioner eller mutationer. Desuden

TP53

observeret i iPCH358 og

CDKN2A, CDKN2B

i iPCH460 blev observeret at være vildtype. Desuden blev den førnævnte kritiske parameter bestemmes og foreslår afvisningen af ​​Stochastic model; vores eksperimentelle resultater tyder på, at omprogrammering af kræftceller følger Elite model, som har valgt en særskilt subpopulation af celler fra en heterogen forældrenes kræftcelle befolkning.

Materialer og metoder

cellelinjer og kultur

Cellelinier anvendt i denne undersøgelse er human føtal lunge fibroblast IMR90 (ATCC nr. CCL-186), HeLa (ATCC nr. CCL-2), adenocarcinom NCI-H358 (ATCC nr. CRL-5807), storcellet carcinoma NCI-H460 (ATCC nr. HTB-177), samt humane embryonale stamceller H1 (WiCell nr. WA01). NCI-H460 fås fra Dr. Koeffler laboratorium blev også købt fra ATCC. Alle cellelinier blev opretholdt i befugtet inkubator holdt ved 5% CO

2 og 37 ° C dyrket i ATCC anbefalede medier suppleret med 10% FBS. Frembringelsen af ​​IPCS blev beskrevet tidligere [18]. Kort fortalt blev IPCS etableres via Yamanaka protokol med lille modifikation [19]. Lentivirus og retrovirus blev produceret ved transfektion 293T-celler og Plat-E-celler, hhv. Før inficere H358 og H460 celler, blev virus filtreret gennem et 0,45 um porestørrelse uden overfladeaktivt celluloseacetatfilter (Sartorius). IPC’er og hESC blev dyrket på bestrålede mus embryonisk fibroblast (iMEFs) badet i DMEM /F12 (Invitrogen) suppleret med 20% Knockout Serum udskiftning (Invitrogen), 1 mM L-glutamin (Invitrogen), 100 uM ikke-essentielle aminosyrer, 100 pM p mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) og 4 ng /pl basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) (Invitrogen). Før udførelse eksperimenter på IPC’er og embryonale blev celler podet på Matrigel (BD Bioscience) og holdt i mTeS®1 (StemCell Technologies).

RNA /DNA-isolering og revers transkription-PCR (RT-PCR)

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse RNeasy Mini Kit (Qiagen) og revers-transkriberet under anvendelse af revers transkriptase-enzym (Promega) samt oligo dT-primere (Promega) ifølge producentens anvisninger. Totalt DNA blev ekstraheret under anvendelse DNeasy Blood Tissue Kit (Qiagen).

microarray analyse

Microarray data for genekspression og DNA-methylering blev opnået fra GSE35913. Analyserne blev udført ved hjælp af R i lumi og methylumi miljøer [20]. Heat map blev genereret ved hjælp gplots pakke.

PCR og sekventering

TP53

,

CDKN2A

CDKN2B

blev amplificeret fra cDNA og genomisk DNA fra IMR90 (positiv kontrol), H358, H460 og 10 valgt tilfældigt iPCH358 og iPCH460 kolonier. Primere til amplificeringer kan findes i tabel S1. PCR-produkter blev adskilt ved gelelektroforese og oprenset med QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) og sekventeret under anvendelse BigDye® Terminator v3.1 cycle-sekventeringskit (Applied Biosystems). PCR-produktet for

TP53

amplikon 2 for iPCH358 Col # 3 blev klonet på pGEM®-T vektor (Promega) før sekventering.

Western Blot

Hele cellelysater af H1, HeLa, H358, H460 og 10 valgt tilfældigt iPCH358 og iPCH460 kolonier hver blev opløst ved SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran. TP53 primært antistof (Cell Signaling # 9282) blev anvendt til at probe tilstedeværelsen af ​​TP53 i H1, HeLa, H358 og alle iPCH358 kolonier. CDKN2A primært antistof (Cell Signaling # 4824) blev anvendt til at probe tilstedeværelsen af ​​CDKN2A i H1, HeLa, H460 og alle iPCH460 kolonier.

seriefortynding Assay

30 ng /pi IMR90 genomisk DNA blev serielt fortyndet 10 gange med 30 ng /pi H460 genomisk DNA. 1 pi af sammenkogt blev derefter anvendt som template til amplifikation af

CDKN2B

.

eksplantatpartikler tumorer Salg

Om 2 × 10

6 H358 og H460 celler blev resuspenderet i 30% Matrigel og injiceret subkutant i alvorlig kombineret immundeficiente (SCID) mus eller nøgne mus (tabel S2). Tumorer fik lov til at vokse i tre til fire uger. Mus blev aflivet før udskæring af tumorer. blev udført Eksperimenterne dyr under godkendte IACUC (The National University of Singapore Institutional Animal Care og brug Udvalg) protokoller 117/09.

metafasespredning

metafasespredninger af forældrenes og post-iPC var udført som beskrevet af Jeppesen [21]. Kort fortalt blev celler dyrket til 70% konfluens og blev behandlet med 0,1 ug /ml demecolcin opløsning (Sigma) i 7 timer. Celler blev derefter dissocieret med trypsin og behandlet med 75 mM KCl ved 37 ° C i 10 minutter. 5 × 10

3-celler (i 100-500 pi KCl) blev spundet ved 1000 rpm til cytocentrifuge objektglassene i 5 minutter. Objektglas blev derefter vasket med KCM (120 mM KCI, 20 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100) i 5 minutter, blokeret med 10% BSA (fortyndet i KCM) til 45 minutter. Dette efterfølges af inkubation med primære antistoffer for to timer, og derefter fluorescens-konjugeret sekundære antistoffer i en time. Efter vask af objektglassene med KCM blev spreads fikseret med 4% formaldehyd i 15 minutter. Endelig blev objektglassene vasket med destilleret vand, lufttørret og monteret med montering medium indeholdende DAPI (Vector Laboratories). Alle billeder blev taget med Olympus FluoView FV1000 mikroskop. Primære anvendte antistoffer var

CENPA

(Abcam) og

TRF2

(BD Transduction Laboratories).

tiltrædelsespartnerskaber numre

Alle sekventering data for

TP53

,

CDKN2A

CDKN2B

blev uploadet til GenBank under accessionsnumre JQ694043-51and JX391994.

Resultater

Tilstedeværelse af

TP53

observeret i iPCH358

Den vellykkede etablering af iPCH358 og iPCH460 i vores laboratorium blev rapporteret tidligere [18]. Genekspression microarray data viste, at påvisning af

TP53

udtryk i H358 lignede baggrund støjniveau for alle tre biologiske gentagelser, men opreguleret i iPCH358, som var helt uventet (figur 1A). For at udelukke microarray artefakt,

TP53

i 10 plukket tilfældigt iPCH358 kolonier blev forhørt af PCR og Western Blot. Til vores overraskelse, disse analyser er enige med de microarray data (Figur 1B). Desuden vi sekventeret den kodende region af

TP53

og fandt det at være vildtype i tre tilfældigt valgte kolonier af iPCH358 (GenBank: JQ694049-JQ694051).

(A) log- transformerede intensitet udlæsninger fra Illumina HumanHT-12 indikerer en signifikant (FDR-justeret P 0,05) opregulering af

TP53

afskrift i iPCH358 forhold til H358. Dette er uventet, eftersom H358 vides at være

TP53

– /-. (B) PCR (øverste panel) og Western Blot (nederste panel) analyser bekræfter udtryk for

TP53

i flere tilfældigt plukket kolonier af iPCH358. Den kodende region af

TP53

i Col # 1, Col # 3 og Col # 11 er vildtype (GenBank: JQ694049-JQ694051). (C) PCR (venstre panel) og Western Blot (højre panel) assays på iPCH358 kolonier af 20 passager afslørede, at passage nummer er uninformative til resultatet af disse analyser. Resultater fra eksperimenter udført på separate lejligheder eller beskåret fra det samme billede er markeret med en stiplet linie; originale billeder kan findes i Præsentation S1, som omfatter detaljeret dokumentation af passage nummer.

CDKN2A

CDKN2B

ikke muteret i iPCH460

Dette resultat motiveret os til at afgøre, om en lignende hændelse blev observeret i H460. Probe sæt (DNA methylering microarray) til promotoren af ​​

CDKN2A

(

P16

) og

CDKN2B

(

P15

) var ikke i stand til at producere pålidelig signaler for alle biologiske replikater (n = 3) af H460, som sandsynligvis skyldes mutationer på forespurgt loci. Men det samme kan ikke siges om iPCH460 (figur 2A). For at validere denne observation, primerpar designet af Shan,

et al.

(2004), som ikke vil give nogen PCR-produkter fra H460 genomisk DNA-skabelon blev anvendt [22]. Overraskende, det samme primerpar var i stand til at producere PCR-produkter fra 10 tilfældigt valgte kolonier af iPCH460 genomisk DNA-template (figur 2B). Tilsvarende primerpar designet til at forstærke den kodende region af både

CDKN2A

CDKN2B

mRNA gav ikke nogen PCR-produkter fra H460, men alle 10 iPCH460 kolonier gav PCR-produkter under de samme betingelser (Figur 2B). Desuden sekventeringsresultaterne af de kodende regioner af både

CDKN2A

CDKN2B

mRNA af tre tilfældigt udvalgt iPCH460 kolonier blev observeret at være vildtype (GenBank accession: JQ694043-JQ694048). Desuden

CDKN2A Hoteller, som er kendt for at blive slettet H460 udtrykkes og påvises ved Western Blot i iPCH460 (figur 2B). Selvom ingen PCR-produkter fra en uddybning

CDKN2B

i H460 blev observeret, er CDKN2B protein aktivt udtrykt i H460 og forblev så i iPCH460 (figur S1). Vores laboratorium opdagede, at formodede små mutationer i det omkringliggende loci af

CDKN2B

i H460 gengives etablerede PCR-metoder i stedet for hele gendeletion, at mislykkes. Dette blev bekræftet med selvstændigt indkøbte H460 celler fra Dr. Koeffler laboratorium (figur S2).

(A) Heat kort med angivelse methylering array-sonder (rækker) ikke at hybridisere til

CDKN2A

CDKN2B

initiativtagere i H460 (tomme søjler), men ikke så i iPCH460. (B) PCR (øverste panel) assay der viser den

CDKN2A

CDKN2B

kan påvises i iPCH460 mens Western Blot (nederste panel) assay viser

CDKN2A

, der er homozygot slettet i H460, kan påvises i iPCH460. (C) PCR (øverste panel) og Western Blot (nederste panel) assays på iPCH460 kolonier af 20 passager afslørede, at passage nummer er uninformative til resultatet af disse analyser. Resultater fra eksperimenter udført på separate lejligheder eller beskåret fra det samme billede er markeret med en stiplet linie; originale billeder kan findes i Præsentation S1, som omfatter detaljeret dokumentation af passage nummer.

Angivelse af slettede gener vedvarer gennem sent passager af iPC kolonier

Chin og kolleger rapporterede, at tidlige passager ( ≤ 10 passager) af iPS kolonier opførte sig anderledes end deres sene passager ( 20 passager) modparter [23]. I vores tidligere assays (Figur 1B og Figur 2B), vores prøver var overvejende ≤20 passager. Derfor er vi fortsatte med at karakterisere hvis passage nummer vil ændre udtrykket opførsel af

TP53

i iPCH358 samt

CDKN2A

CDKN2B

i iPCH460. Interessant, vi ikke observere nogen ændring i udtrykket adfærd i slutningen passage IPCS (figur 1C, 2C og præsentation S1).

En mulig confounder til vores observation hidtil er tilstedeværelsen af ​​kontaminerende normale fibroblaster i disse kræft cellelinier. Derfor, for at udelukke muligheden for, at disse resulterende IPCS blev afledt af forurenende normale fibroblaster blev metafase spread udført på post-IPC celler (spontant differentierede IPC kolonier via embryoid krop dannelse). Vi observerede, at de post-IPC celler forbliver aneuploid og dermed konkludere, at de etablerede IPC kolonier ikke stammede fra at forurene normale fibroblaster (Figur S3). Vi fastslog også, ud kontaminering celle 293T celle og Plat-E, fordi både lentivirus og retrovirus blev filtreret gennem et 0,45 pm porestørrelse-filter før inficere H358 og H460. Desuden fandt vi, at de GFP-styrevektorerne spillet nogen rolle i ekspressionen af ​​de muterede gener i både H358 og H460 (figur 1B og 2B).

Tilsammen har vi her to komplementerende hypoteser til forklare, hvorfor

TP53

null H358 celler udtrykte TP53 på omprogrammering (ligeledes,

CDKN2A

null H460 celler udtrykte CDKN2A på omprogrammering): 1) omprogrammering inducerer et gen opsving mekanisme; 2) omprogrammering, i en heterogen population, beriget en subpopulation af celler med forskellig mutationsstatus end majoritetsbefolkningen. Faktisk sidstnævnte hypotese giver den mest påholdende forklaring (se diskussionen).

Elite model af omprogrammering forudsiger vore observationer

Da H358 og H460 er heterogene med hensyn til genmutation status, spurgte vi , “Hvad er sandsynligheden for, at alle tilfældigt plukket IPCS kolonier er afledt fra den mindre subpopulation uden kendt mutation, der kendetegner majoritetsbefolkningen, hvis omprogrammering følger Stochastic model” Vi først etableret én parameter: den anslåede andel af den mindre subpopulation (for enkelhed, vil denne subpopulation blive benævnt “mutation-fri” subpopulation). For at estimere det, var IMR90 genom seriefortyndet med H460 genom og vurderet effekten til at forstærke

CDKN2B

ved PCR. Vi valgte at forstærke

CDKN2B

grund af sin forstærkning effektivitet i forhold til

CDKN2A

eller

TP53

(Figur S4). I vores analyse, vi skønnede, at den højeste andel af H460 celler uden mutant

CDKN2B

er 1:5000 (figur 3A). Med dette skøn, vi beregnet sandsynligheden for at observere alle tilfældigt plukket kolonier, der blev afledt af “mutation-fri” delpopulation. For både iPCH358 og iPCH460, at sandsynligheden for at observere alle 10 tilfældigt valgte kolonier være “mutation-fri” er 1 × 10

-37 (figur 3B). Endvidere til den mindst mulige andel resultere i en sandsynlighed på 0,05 eller mere i denne sandsynlighed model er 0,75 (

10C

10 × 0,75

10 × 0,25

0 0,05), dvs. hvis start befolkning havde ikke mindre end tre »mutation-fri ‘celler for hver fire celler. Denne andel er ikke overalt nær 0,25, hvilket er det fattigste skønnede andel fra den mindst effektive forstærkning af seriel fortynding assays (Figur S4A). Således afviser vi nulhypotesen og konkluderer, at omprogrammering af kræftceller følger Elite modellen.

(A) Seriel fortynding assay viser, at ved 10

3,7 gange fortynding,

CDKN2B

i IMR90 er detekterbar ved basale niveauer. Derfor er højst 1 i 5000 H460 celler er “mutation-fri”. (B) Sandsynligheden model til at teste nul-hypotesen: “Generation of IPCS følger den stokastiske model”. Efterfølgende input af parametrene bestemt i (A) foreslår afvisningen af ​​Stochastic model i omprogrammering af H358 og H460.

Definition af “mutation-fri” delpopulation

Mens Elite model i denne omprogrammering eksperiment hævder, at processen er forudindtaget mod “mutation-fri” delpopulation, berigelse af denne undvigende delpopulation i sin oprindelige tilstand er teknisk udfordrende. Alligevel Hochedlinger

et al.

(2004) tidligere viste, at karyotype konfiguration af omprogrammeres kræftcelle svarer til den af ​​eksplantatet tumor [15], hvilket antyder, at podning af cancercellelinie i SCID-mus er valgt en tumorigen subpopulation med cytogenetisk funktion svarende til den i den omprogrammeres kræftcelle. Desuden blev det påpeget, at Chang

et al.

(2003) observerede, at tumorcellelinjer var typisk heterogene i modsætning til deres afledte eksplantatpartikler tumorer [24]. Derfor blev fire eksplantatpartikler tumorer af H358 og H460 genereret hver (tabel S2). Men kun ét eksplantat tumor af H358 (H358-2) gav påviselig

TP53

på genomisk DNA (figur 4A). På den anden side, ingen af ​​eksplantatet tumorer af H460 gav påviselig

CDKN2A

eller

CDKN2B

(figur 4B). Derfor podning af kræft cellelinje i SCID-mus svagt emulerer selektiviteten af ​​nuklear omprogrammering.

(A) En ud af fire H358 eksplantatet tumor genereret show tilstedeværelse af

TP53

i genomet, hvilket indikerer berigelse af den undvigende ‘mutation-fri “delpopulation. blev observeret (B) Ingen af ​​H460 eksplantatpartikler tumorer, der skal beriges for »mutation-fri” subpopulation. Genomisk DNA fra SCID-mus hale blev anvendt til at kontrollere for mus DNA-kontaminering i eksplantatpartikler tumorer. Information af eksplantatpartikler tumorer kan findes i tabel S2.

Diskussion

Omprogrammering diskriminerer heterogen kræftcelle befolkning

De data, der præsenteres her, viser, at adskiller de genetiske mutation status mellem forældrenes kræftcelle befolkning og omprogrammeres modstykke. Selvom vi ikke har eksperimentelle data til at vise den homogenitet eller heterogenitet H358 og H460 kræft celle populationer direkte, for at forklare denne spændende observation, vi foreslået to komplementerende hypoteser: 1) start befolkning er homogen og dermed nukleare omprogrammering uforvarende korrigerer vis mutationer; 2) start befolkning er heterogen og nuklear omprogrammering beriger en mindre subpopulation. Den første hypotese hængsler på en antagelse, hvorved en celle er i stand til at inddrive et muteret gen. Men det er klart, at en sådan mekanisme ikke eksisterer, fordi etableringen af ​​iPS fra

p53, tert

og

INK4 /Arf

knock-out mus embryonale fibroblaster [25], [26], ikke se inddrivelse af disse gener. På den anden side er den anden hypotese antager et scenario, hvor omprogrammering diskriminerer inden den heterogene cancercellen population af varierende grader af genetisk insult. Denne antagelse ligner til observationen Hochedlinger og kolleger gjorde hvorved den heterogene karyotype af musene melanom bliver homogen efter omprogrammering [15]. Derfor er den anden hypotese begunstigede at forklare uoverensstemmelsen mellem mutationen status i cellerne før og efter omprogrammering.

Hvis startende populationer af H358 og H460 er heterogene, og der eksisterer en “mutation-fri” delpopulation , hvorfor skulle PCR eller Southern-blot [16] ikke registrere disse gener? Vi foreslår, at andelen af ​​’mutation-fri “subpopulation er for lille til at tilvejebringe tilstrækkelig skabelon til PCR-amplifikationer til dannelse af produkter tilstrækkelige til ethidiumbromid detektion. Faktisk viste vi dette i en udvanding af IMR90 genomisk DNA på mindst 5000 gange vil maskere påvisning af

CDKN2B

amplikon. Baseret på denne analyse, vi vurderet, at der er højst én ‘mutation-fri “celle for hver 5000 H358 eller H460 celler. Derfor, for at opnå IPCS taget fra denne undvigende “mutation-fri” delpopulation er meget usandsynligt, hvis omprogrammering proces er stokastisk. Derfor foreslår vi, at omprogrammering af kræftceller følger Elite model.

Tidlige tumor afkom kan afgrænse kompetenceudvikling mod omprogrammering

Siden omprogrammering proces diskriminerer en heterogen kræftcelle befolkning, vi har forsøgt at afgrænse underliggende karakteristika i cancerceller, der bestemmer kompetenceudvikling mod omprogrammering. Tidligere undersøgelser har påpeget, at omprogrammering faktorer aktiverer flere ældning og tumor-undertrykkende mekanismer (dvs.

TP53

CDKN2A

), der virker som barrierer mod omprogrammering [25] – [27]. Overraskende, trods somatiske gen- deletioner af disse barrierer i størstedelen af ​​H358 og H460-celler, ingen af ​​de tilfældigt valgte kolonier var null for disse gener. Derudover observerede vi, at tumorigent potentiale (bestemt ved SCID mus inokulering) svagt emulerer berigelse ved omprogrammering proces. På den anden side, vores data tyder på, at derivater af disse IPC’er er formodede tidlige afkom af tumoren befolkning.

Mullers Ratchet, at mutationer i organismer, der formerer sig ukønnet er irreversibel og akkumuleres over generationer [28]. Ligeledes kræftceller ‘reproducere’ via mitose og genetiske skader er irreversible og ophobes over flere celle cyklusser. Med andre ord betyder det, at derivaterne af iPCH358 og iPCH460 er celler fra de tidligere stadier af tumorigenese. Eftersom at de muterede gener pågældende (

TP53

,

CDKN2A

CDKN2B

) er vigtige for integriteten af ​​genomet, er det sandsynligt, at disse “mutation -fri ‘celler har en lavere grad af genetisk niveau fornærmelser. Paradoksalt nok, disse celler er aneuploid og vise større spredning af kromosom tæller end deres forældre celler (figur S2), troværdig der bekræfter teorien om, at aneuploidi fremmer genomisk ustabilitet [29]. Samstemmende med denne teori, Navin og kolleger ligeledes observeret, at kopiantallet amplifikation af

KRAS

, en vigtig oncogen, er unik for aneuploid tumor population [14]. Derfor foreslår vi en vejledende hypotese, at omprogrammering vælger kræftceller fra de tidligere afkom af tumorigenese, hvor genetiske niveau fornærmelser er lav, men groft aneuploid (figur 5). Faktisk genetiske integritet opretholdes ved

TP53

CDKN2A

bl.a. kan være nødvendig for at bevare den stramt reguleret pluripotens kredsløb for at sikre omprogrammering succes [30] – [32]. Bortset fra at forklare, hvorfor IPCS genereret fra H358 og H460 ikke var

TP53

null og

CDKN2A

null henholdsvis kan besvare et spændende spørgsmål fra Zhang og kolleger om, hvordan en omprogrammeret sarkom celle med flere skader genetiske niveau kunne stadig opnå pluripotens [5]. Fremtidige eksperimenter såsom Flow-FISH (flowcytometri fluorescens

in situ

hybridisering) for at sortere de “mutation-fri” delpopulation efterfulgt af enkelt kerne sekventering vil give beviser til at bekræfte eller forfalske denne hypotese. . Derudover vil yderligere undersøgelser af genomet af eksplantatet tumor H358-2 være af interesse i håndteringen denne hypotese

Fra vores data, bemærkede vi, at derivater af vores IPCS: 1) manglede nøglen genetisk mutation (er) ; 2) aneuploid; 3) mindre subpopulation. Givet disse observerede karakteristika, er det sikkert at antage, at disse derivater var tidlige afkom af tumoren befolkning (repræsenteret i grøn). Således er aneuploidi muligvis først erhvervet før kritiske mutationer til at køre yderligere fordelagtige mutationer (afgrænsede i gråt), i overensstemmelse med observationen af ​​Navin et al (2011). Kombineret med den forståelse, at pluripotens regulerende kredsløb stramt reguleret og komplekse, mindre genetiske niveau fornærmelser i celler (cirkler mangler rødt ‘X’), vil sikre integriteten af ​​kredsløbet og derfra vellykket etablering af iPC (repræsenteret i lilla), der kan differentieres til flere slægter (repræsenteret i blåt).

Afsluttende bemærkninger

i denne undersøgelse har vi udnyttet cancer cellelinjer, der er i sagens natur heterogene, så vi kan observere, som variabel ( s) fordomme mod den vellykkede generation af IPCS. Faktisk vores observationer, at »mutation-fri ‘subpopulationer blev udvalgt imod flertallet tyder på, at omprogrammering af kræftceller følger Elite modellen. Denne konklusion er ikke forfalske det tidligere forslag om, at generation af iPS følger den stokastiske model, der i kraft at normale somatiske celler og kræftceller er forskellige. Desuden er vores data fører til et ledende hypotese, at formodede tidlige afkom af tumoren population blev selekteret under omprogrammering proces. Fremtidig belysning af tilknyttede egenskaber til ‘mutation-fri “delpopulation foreslået af vores data vil være af stor nytte i yderligere forstå omprogrammering af kræftceller proces at optrævle den underliggende heterogene make-up af tumorer, som vil være afgørende i anti-cancer terapeutiske strategier.

Støtte oplysninger

figur S1.

Ekspression af CDKN2B protein i H460 og iPCH460.

CDKN2B

er muteret i H460, der gør alle PCR-analyser til at mislykkes, men ikke foruroliger sin proteinekspression

doi:. 10,1371 /journal.pone.0056702.s001

(TIF)

figur S2.

Tilstedeværelse af

CDKN2B

i H460 celler fra vores laboratorium og Dr. Koeffler laboratorium (Klab). (A) CDKN2B protein kan detekteres i H460 celler fra vores laboratorium og Klab. (B) En alternativ primerpar vi designede (tabel S1) var i stand til at forstærke

CDKN2B

i både genomisk DNA og cDNA af H460. Vi sekventeret den kodende region af dette gen, og fundet det at være vildtype (GenBank: JX391994)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0056702.s002

(TIF)

Figur S3.

metafasespredning viser, at post-IPCS (piPCs) er aneuploid. (A) Repræsentative metafasespredninger af H358, H460, piPCH358 og piPCH460. (B) tabel over tællinger af kromosomerne fra mindst otte uafhængige spreads per prøve. Blå – DAPI farvede kromosomer; grøn – TRF2; . Rød – CENPA

doi: 10,1371 /journal.pone.0056702.s003

(TIF)

Figur S4.

2 gange seriel fortynding af IMR90 genom til forstærkning af

TP53

CDKN2A

. (A) IMR90 genomisk DNA var 2-fold seriefortyndet med H358 genomisk DNA som template til amplifikation

TP53

. Vi observerede, at ved 4 ganges fortynding, PCR bånd svarende til

TP53

er marginalt synlig. Det giver os et estimat, at for hver fire H358 celler, den ene er ‘mutation-fri “. (B) På lignende måde IMR90 genomisk DNA var 2-fold seriefortyndet men i stedet med H460 genomisk DNA. Forstærkning effektiviteten af ​​

CDKN2A

blev ligeledes truet af ikke-specifikke produkter; ved 32 ganges fortynding, PCR bandet var marginalt mærkbar dermed give et estimat, at for hver 32 H460 celler, den ene er ‘mutation-fri “. Uanset hvad, vil parsing nogen af ​​disse parametre i sandsynligheden modellen i figur 3 resultere i en sandsynlighed meget mindre end 0,05

doi:. 10,1371 /journal.pone.0056702.s004

(TIF)

Præsentation S1 .

Originale billeder brugt i figur 1 og figur 2.

doi: 10,1371 /journal.pone.0056702.s005

(PDF)

tabel S1.

primersekvenserne

doi:. 10,1371 /journal.pone.0056702.s006

(XLSX)

tabel S2.

eksplantation tumordata

doi:. 10,1371 /journal.pone.0056702.s007

(XLSX)

Tak

Chiou Mee Kong er en modtager af stipendier fra Yong Loo Lin School of Medicine, NUHS, NUS, Singapore. Vi takker Dr. Patrick Tan for indsigtsfulde kommentarer samt Dr. Phillip Koeffler for hans slags gave af H460-celler.