PLoS ONE: Regulering af Epithelial Forgrening Morfogenese og kræft cellevækst i prostata ved Wnt Signaling

abstrakt

Selvom Wnt signalering har vist sig at være vigtigt for embryonisk morfogenese og kræft patogenesen af ​​adskillige væv, dets rolle i prostata udvikling og tumorigenese er ikke godt forstået. Her viser vi, at Wnt signalering reguleret prostataepitelcellelinie forgrening morfogenese og luminal epitelcelledifferentiering i udviklingen rotte prostata organkulturer. Specifikt Wnt signalering reguleret proliferation af prostata epitelceller progenitorceller. Vurdering af ekspressionsniveauerne af en Wnt pathway transkriptionel målgen, Axin2, viste, at Wnt pathway blev aktiveret i udviklingslandene prostata, men blev nedreguleret i den voksne. Kastration resulterede i en opregulering af Axin2 henviser androgenerstatningsterapi resulterede i en nedregulering af Axin2. Sådanne dynamiske ændringer af Wnt aktivitet blev også bekræftet i et BAT-gal transgene mus linje, hvor β-galactosidase reporter udtrykkes under kontrol af β-catenin /T-celle faktor-responsive elementer. Endvidere evalueres vi rolle Wnt signalering i prostata tumorigenese. Axin2 ekspression blev fundet opreguleret i de fleste human prostatacancer-cellelinier undersøgt. Endvidere tilsætning af et Wnt pathway inhibitor, Dickkopf 1 (DKK1), i dyrkningsmediet inhiberede signifikant prostatakræft cellevækst og migration. Disse resultater tyder på, at Wnt signalering regulerer prostata epitelial ductal forgrening morfogenese ved at påvirke celledeling, og fremhæver en rolle for Wnt pathway aktivering i prostatacancer progression

Henvisning:. Wang BE, Wang XD, Ernst JA, Polakis P, Gao WQ (2008) Regulering af Epithelial forgrening Morfogenese og kræft cellevækst i prostata ved Wnt Signaling. PLoS ONE 3 (5): e2186. doi: 10,1371 /journal.pone.0002186

Redaktør: Hernan Lopez-Schier, Centre de Regulacio Genomica, Spanien

Modtaget: Januar 17, 2008; Accepteret: April 7, 2008; Udgivet: May 14, 2008

Copyright: © 2008 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Wnt signalvejen er afgørende i en række forskellige biologisk proces herunder neural mønsterdannelse, plane polaritet, stamcellefaktor vedligeholdelse og celledifferentiering [1]. Dette er blevet påvist i en række systemer, via genetiske og biokemiske metoder. Wnt signalering initieres af ekstracellulære proteiner, dvs. Wnts, gennem binding til deres respektive frizzlede familie af receptorer. Signalet bliver herefter transduceret til p-catenin via en kaskade af signaltransducerende molekyler i cytoplasmaet. β-catenin løber derpå ind i kernen, danner et kompleks med TCF og transaktiverer downstream målgener, der regulerer eller deltage i forskellige processer. Kompleksiteten af ​​signalering opstår delvist fra de mange komponenter i denne vej, herunder for eksempel 19 humane Wnt ligander, 1 Wnt inhibitorisk faktor (WIF), 5 udskilte frizzlede relaterede proteiner (SFRPs), der kan sekvestrere Wnt-ligander i at binde til deres beslægtede receptorer , 2 lavdensitetslipoprotein receptor-relaterede proteiner (LRP5 /6) og 4 Dickkopf (Dkk) proteiner, der modulerer aktiviteten af ​​frizzled receptorer [1], [2].

i den kanoniske Wnt-vejen, stabilisering og translocalization af β-catenin til kernen er et kritisk trin af Wnt signalering aktivering. I fravær af Wnt ligandbinding, er β-catenin målrettet mod nedbrydning via dens vekselvirkninger med adenomatøs polypose coli (APC) protein og Wnt signalering minimalt aktiveret. Når APC er muteret, β-catenin akkumuleres i kernen og Wnt-signalering er konstitutivt aktiv [1]. Wnt signalering nedstrøms program er dårligt forstået, og en meget nyttig nedstrøms gen er specifikt for denne pathway er Axin 2, som ved transkription og translation, virker som en negativ feedback regulator af Wnt siginaling pathway, ved at hjælpe direkte β-catenin for nedbrydning i proteasomet [3], [4]. Stabilisering af β-catenin-protein og elevation af Axin2 transkript betragtes som indikatorer for Wnt-aktivering [4].

dysregulering af Wnt-signalering er også forbundet med cancer patogenesen af ​​forskellige væv [5], [6]. Genetiske ændringer i APC-gener forårsager disposition for kolorektal cancer (Groden, Cell 1991) og tumor suppressor funktion af APC /onkogen effekt af Wnt-vejen er tydeligt vist i APCmin transgene mus, hvor adskillige adenomer dannes i tarmen [7]. Rolle Wnt vej i prostata tumorigenese har for nylig modtaget en øget opmærksomhed, men er stadig ikke godt forstået. Nylige undersøgelser rapporteret, at visse Wnt ligander, såsom Wnt1 udtrykkes i prostatacancercellelinjer og synes at være forhøjet i nogle humane prostata tumorvæv [8]. Specifikke Wnt pathway hæmmere såsom WIF1 synes at være nedreguleret i en betydelig procentdel af prøver prostatacancer [9]. Prostata-specifikt deletion af genet APC i mus resulterer i dannelsen af ​​adenocarcinom [10]. Derudover har samspillet mellem β-catenin og androgen receptor (AR) blevet vist at forbedre AR-medieret transkription [11], som spiller en kritisk rolle under prostatacancer progression. Belyse hvordan Wnt signalering regulerer prostata udvikling og tumorigenese ville fremme udviklingen af ​​nye terapeutiske midler til behandling af prostatacancer.

I et forsøg på at forstå den rolle Wnt signalering i prostata epitelial udvikling, vi udførte orgel kulturer af udvikle prostata fremstillet ud fra tidlige postnatale rotter for at bestemme virkningerne af modulation af Wnt signalvejen på prostataepitelcellelinie forgrening morfogenese. Vi fandt, at Wnt signalering reguleret prostata epitelcelledifferentiering gennem påvirke proliferation af prostata epiteliale progenitorceller. Desuden afslørede TaqMan RT-PCR-analyse, at flere almindeligt studerede prostatacancercellelinjer og xenotransplantater udviste aktivering af Wnt-vejen. Desuden Dickkopf1 (DKK1), en Wnt pathway inhibitor [12] – [14], signifikant hæmmet prostatakræft cellevækst og migration. Disse resultater tilsammen antyder at aktivering af Wnt-vejen spiller en afgørende rolle under prostata udvikling, og genvækst og at inhibere Wnt-vejen kunne være af terapeutisk værdi i behandling af prostatacancer progression.

Resultater

Wnt signalering regulerer prostata epitelial forgrening morfogenese

prostata epitelial forgrening morfogenese i gnaver sker hovedsageligt efter fødslen af ​​ekspansion og yderligere forgrening af de epiteliale primodia [15], [16]. Denne proces kan blive gentaget en bekvem organkultur systemet [17], [18]. For at undersøge om Wnt signalering spiller en rolle i prostataepitelcellelinie forgrening morfogenese behandlede vi organ- kulturer af postnatal dag 2 (P2) rotte ventrale prostata med en Wnt-ligand, Wnt3a, eller en potent Wnt signalering inhibitor, DKK1 [12]. Som vist i fig. 1, prostata i kontrolkulturer udviste omfattende forgrening med ikke kun primære og sekundære kanaler, men også tertiære, fine grene efter 7 dage i kultur (fig. 1a). Imidlertid vævet i kulturer behandlet med Wnt3a ved en koncentration på 50 nM de viste afrundede, forstørrede duktale tips (pilen i fig. 1 B) og et reduceret antal tertiære, fine grene. Prostates behandlet med DKK1 ved 400 nm, prostata optrådte mindre i størrelse og havde færre epiteliale grene. i modsætning til Wnt3a-behandlede prostata, DKK1 behandlet imidlertid prostata manglede forstørrede duktale tips (fig. 1C). Kvantificering af disse kulturer ved måling diametrene af de dyrkede prostata og duktale tips og tælle forgreningspunkter i disse kulturer viste statistiske forskelle mellem kontrolkulturerne og kulturer behandlet med Wnt3a i alle 3 aspekter (fig. 1D-F). Disse resultater tyder på, at både aktivering og hæmning af Wnt signalering negativ indvirkning prostata epitelial forgrening morfogenese, og understrege vigtigheden af ​​netop reguleret Wnt signalering for en hensigtsmæssig udvikling af prostata.

Hele mount ventrale prostata blev fremstillet ud fra P2 rotter og holdes i 7 dage i serumfrit medium i fravær (A) eller nærvær af 50 nM Wnt3a (B) eller 400 nM DKK1 (C). Lignende mønstre blev konsekvent set i 3 gentagne eksperimenter af 5-6 prostata organer per gruppe i hvert enkelt eksperiment. Bemærk, at tilsætning af enten Wnt3a eller DKK1 til kulturen resulterede en ændring i epitel forgrening morfogenese. Kvantificering af kulturerne ved at måle diameteren af ​​de dyrkede prostata (D) og duktale tips (E) ved hjælp Axiovision software og forgreningspunkter (F) blev foretaget ved at analysere 4 tilfældigt udvalgte kulturer per gruppe. Data er udtrykt som middelværdi + SEM (t-test, sammenlignet med kontrolkulturer). Bar, 400 um.

Wnt signalering påvirkninger celledeling og differentiering i udviklingslandene prostata epitel

Prostata epitel består hovedsagelig af basal og luminale celler sammen med en mindre population af neuroendokrine celler [19]. Den basale celler udtrykker P63 [20], cytokeratin 14 (CK14) og CK5 og menes at indeholde stamcelle population [21]. Den luminale celler udtrykker Ck8 eller CK18 og har normalt post-mitotiske og terminalt differentierede celler. Hos gnavere næsten alle epitelceller er progenitorceller og breder indtil P5 når nogle af progenitorer undergår terminal mitose og differentiere til luminale celler, der kun udtrykker Ck8 eller CK18 [19]. For at bestemme om modulation af Wnt signalering påvirker differentieringen af ​​progenitorer i luminale celler, udførte vi immunhistokemi på snit af prostata organ- kulturer under anvendelse basal og luminale cellemarkører, P63 og Ck8 hhv. Som vist i fig. 2, mere P63 positive celler sås i duktalt region Wnt3a-behandlede kulturer (fig. 2B) end kontrolkulturerne (fig. 2A). I modsætning hertil færre P63 positive celler var til stede i DKK1-behandlede kulturer (fig. 2C). De celler, der blev mærket ved DAPI nuklear farvning i epitelet, men negative for P63, repræsenterer de differentierede luminale celler, hvilket er bekræftet ved Ck8 immunfarvning (data ikke vist). Celletællinger fra tilfældigt udvalgte kulturer af de 3 grupper viste, at procentdelen af ​​basale celler over den samlede epitel cellepopulation inden for en given individuel duktal enhed var betydeligt højere i de Wnt3a-behandlede kulturer i forhold til kontrolkulturer (fig. 2D). I modsætning til Wnt3a handling, forholdene mellem basale celler mod totalt epitelceller var signifikant lavere i DKK1-behandlede kulturer end i kontrolkulturer (fig. 2C). Immunfarvning under anvendelse af et Ck8 antistof viste et komplementært mønster: Wnt3a resulterede i en reduktion i antallet af luminale celler henviser DKK1 ført til en større antal luminale celler (data ikke vist). Ændringen i basal vs samlede epitelceller ikke henføres til celledød som TUNEL mærkning kun påvist minimal, baggrund signaler med ingen forskel mellem de tre grupper af kulturer (data ikke vist).

Sektionerne væv blev modfarvet med DAPI (blå). Mens P63 positive celler (lilla) repræsenterer basale celler, hvor stamceller bor, de blå celler (pile), der er negative for P63 i epitel er differentierede luminale celler. (D) Kvantificering af P63-positive celler på hele epitelceller. Data blev indsamlet fra tilfældigt udvalgte 22-27 duktale enheder fra dele af organkulturer per gruppe og er udtrykt som middelværdi + SEM (t-test). Bemærk, at mens Wnt3a førte til en betydelig stigning i antallet af basale celler, DKK1 resulterede i en reduktion i basale celler. Bar, 50 um til AC.

Da Wnt3a og DKK1 behandlinger førte til en forbedret og nedsat antal P63 positive celler, henholdsvis som hovedsageligt består af stamfædre på dette tidlige udviklingsfase, vi søgte at afgøre, om Wnt3a og DKK1 ville påvirke proliferation af progenitorceller i disse prostata organ- kulturer under anvendelse brom-deoxyuridin (BrdU) og Ki67 immunohistokemi. Som vist i figur 3, efter en 3- dages behandling blev mere prolifererende celler observeret i kulturer behandlet med Wnt3a (fig. 3C, D), og færre prolifererende celler i kulturer behandlet med DKK1 (fig. 3E, F), sammenlignet til kontrolkulturerne (fig. 3A, B). Celletællinger udføres fra tilfældigt udvalgte felter indikerede, at der var en 1,63-fold stigning i antallet af Ki67-positive celler i Wnt3a-behandlede prostata organer sammenlignet med kontrolkulturer (fig. 3G). I modsætning hertil var der et betydeligt fald i antallet af Ki67-positive celler i DKK1-behandlede prostata organer (Fig. 3G). I overensstemmelse med BrdU inkorporering assays vores Ki67 immunhistokemi i de 7-dages kulturer viste også lignende celledeling-styrke og hæmmende effekter ved Wnt3a og DKK1 henholdsvis (fig. 3H). For at forstå, hvordan celleproliferation reguleres af Wnt signalering under prostata udvikling undersøgte vi ekspressionsmønstre for adskillige cyclin-gener i et separat microarray undersøgelse for at udvikle muse prostata. Vi fandt, at cyclin B2 udtryk var signifikant højere på P4 end P19 og 10 uger gamle mus (ca. 4 og 8 gange, henholdsvis), og at sammenslutningen af ​​cyclin B2 med tidlige udvikling var meget stærkere end de andre cycliner (data ikke vist). At bekræfte, om det forhøjede proliferation, baseret på Ki67-farvning, set i organkultur kan være delvist medieret af cyclin B2, udførte vi TaqMan RT-PCR-analyse af disse kulturer. Som vist i fig. 3I, ekspressionen af ​​cyclin B2 var ca. 118,8 gange højere og ca. 4,5 gange lavere i organet kulturer behandlet med Wnt3a og DKK1 hhv. Tilsammen tyder disse resultater på, at Wnt signalering regulerer terminal differentiering af basale celler i luminale celler ved at styre proliferation og /eller vedligeholdelse af epitel stamceller.

(AF) Vist er anti-BrdU antistof (B, D, F) og DAPI (A, C, E) dobbeltmærkning af P3 rotte ventral prostata organkulturer opretholdt i 3 dage i fravær (A, B) eller nærvær af 50 nM Wnt3a (C, D) eller 400 nM af DKK1 (E, F). (G). Kvantificering af BrdU-positive celler i et givet synsfelt på 434 um × 322 um. (H) Kvantificering af Ki67-positive celler i P2 prostata kulturerne holdes i 7 dage, som var normaliseret til kontrolkulturerne. Celletal (for G og H) blev udført fra tilfældigt udvalgte synsfelter af 5 organkulturer per gruppe og data blev udtrykt som gennemsnit + SEM (t-test). Bemærk, at mens Wnt3a signifikant forøget progenitor celleproliferation, DKK1 inhiberede progenitor celleproliferation. (JEG). Expression niveau skift af cyklin B2 i P2 rotte prostata organkulturer .. Data blev indsamlet fra 4 organkulturer opretholdt i 2 dage pr gruppe og er udtrykt som middelværdi + SEM (t-test). Bemærk, at ekspressionen af ​​cyklin B2 blev opreguleret ved Wnt3a, men nedreguleret af DKK1. Bar, 100 um for AF.

Dynamiske ændringer i Wnt signalering aktivering under prostata udvikling, efter kastration og følgende androgen erstatning

For at give yderligere understøttende dokumentation til rollen som Wnt signalering i opretholdelse af prostata epiteliale progenitorer, udførte vi kvantitativ RT-PCR under anvendelse Axin2 som indikator for aktivering af Wnt signalering med prostatavæv fremstillet på forskellige tidspunkter i udviklingen. Vi fandt, at Axin2 niveauet var højest på P2, men faldt over tid som prostata modnet (fig. 4A). Disse data antyder, at Wnt signalering er mere aktiv i de tidlige stadier af udviklingslandene prostata overensstemmelse med en højere progenitorcellepopulation end i fuldt udviklede prostata, hvor størstedelen af ​​de epiteliale celler er terminalt differentierede luminale celler.

(A ) En gradvis nedregulering af Axin2 fra nyfødte til adulthood.nbsp, (B) Axin2 blev opreguleret efter kastration, men vendte tilbage til normale lave niveauer efter androgen erstatning. Data blev indsamlet fra 4-6 prøver pr gruppe og er udtrykt som middelværdi + SEM (t-test, sammenlignet med normale voksne prostata). Forkortelse: N, normal prostata; C3, 3 dage efter kastration, C17; 17 dage efter kastration; C14 + T. 14 dage efter kastration + 3 dage af testosteron behandling.

Tidligere undersøgelser har vist, at den del af den basale celle rum over det samlede epitelceller i prostata epitel ændret efter kastrering og hormonal erstatningsterapi [22 ]. Kastreringsinduceret androgenfjernelse vides at depletere ca. 90% af den epitel indholdet [23] og resulterer i berigelse af basal /progenitorcellepopulationen. Androgenerstatningsterapi fører igen til proliferation af progenitorceller og deres differentiering til luminale celler, hvilket resulterer i prostata genvækst tilbage til sin normale størrelse [24]. Vi udførte kvantitativ real-time RT-PCR for at sammenligne ekspressionsniveauerne af Axin2 i prostata høstet fra normale mus, mus efter 3 dage og 17 dage efter kastrering og mus efter 3 dages testosteronerstatning følgende kastration. Som vist i fig. 4B, Axin2 niveauer var 1,5 gange og 1,7 gange højere hos prostata 3 og 17 dage efter kastrering, henholdsvis, men faldt 3 dage efter testosteronerstatning. Disse data fra både udviklingslande og fornybare prostata viser, at Wnt signalering er positivt korreleret til basal celle nummer og omvendt korreleret med differentiering af progenitorer i luminale celler i prostata.

Vi næste undersøgt en BAT-gal transgene mus linje, hvor β-galactosidase reporter udtrykkes under kontrol af β-catenin /Tcell faktor-responsive elementer [25]. Denne mus linie har vist sig at være

bona fide

in vivo indikatorer for Wnt /β-catenin signalering, hvilket tillader visualisering af den generelle status for Wnt-aktivering i celler i et givet væv. Undersøgelse af vævssnit fremstillet ud fra prostata på forskellige stadier, herunder P5 (udviklingslande prostata, fig. 5A-C), voksne (modne prostata, fig. 5D-F)), post-kastration (fig. 5G-I) og efter androgenerstatningsterapi (fig. 5J-L), viste, at antallet af β-galactosidase-positive celler var meget højere i udviklingslandene prostata, end voksne prostata (28,7 ± 6,9 /kanaler, n = 10 vs. 1,92 ± 0,4 /kanaler, n = 13 , fig. 5M). Kastration førte til en forhøjet antal β-galactosidase-positive celler (5,2 ± 0,7 /kanaler, n = 13), men androgenerstatningsterapi resulterede i et lavere antal, der var ækvivalent til det normale niveau hos voksne prostata (2,3 ± 0,5 /kanaler, n = 15, fig. 5M). Desuden Vi fandt, at Wnt aktivitet udelukkende blev set i epitelceller, hovedsagelig i basal celle rum, hvor stamceller bor. Desuden dobbelt mærkning af disse vævssnit med anti-P63 antistof, et basalcelle markering, og anti-β-galactosidase-antistof viste, at i den voksne, at langt størstedelen af ​​β-galactosidase-positive celler blev co-mærket med anti- P63 antistof (pile i fig. 5A-L og N), skønt i postnatale prostata, der var mærkbar antal β-galactosidase-positive celler i luminal cellelag, hvilket kan skyldes en mulighed for forsinket nedbrydning af β-galactosidaseaktivitet i de uhelbredeligt mitotiske celler, exciterede cellecyklus at differentiere til luminale celler. Derfor er disse resultater ikke kun bekræfte de dynamiske ændringer i Wnt aktivitet under prostata udvikling og genvækst opnået ved TaqMan RT-PCR-analyse af Axin2 udtryk, men også yde supplerende støtte til sammenslutning af Wnt signalering med prostata basale celler, hvor stamceller generelt menes at bor.

Dobbelt immunfarvning af prostatavæv sektioner med anti-β-galactosidase (grøn i A, D, G, J) og anti-P63 (rød, i B, E, H, K) antistoffer, fremstillet fra mus af P5 (AC), voksne (DF), 14 dage efter kastrationen (GI) og 14 dage efter androgen udskiftning (JL). Snittene blev modfarvning med DAPI (blå). Mens pile angiver celler, som samtidigt udtrykker P63 og β-galactosidase, pilespids (fig. 1A-C) viser en celle, der er p-gal-positive, men P63 negativ i udviklingslandene prostata. Bemærk, at β-galactosidase-udtrykkende celler er placeret udelukkende i epitelet, og hovedsagelig i den basale celle rum i den voksne prostata, selv om en mærkbar nummer ses i den luminale cellelag i udviklingen prostata. Bar, 50 um. (M) Kvantificering af β-gal-positive celler pr epitel duktalt enhed, som bestemmes i vævssnit baseret på DAPI modfarvning og tilstedeværelsen af ​​en epitelial lumen. (N) Cell tællinger af β-Gal positive celler end totale basale celler (P63 positive celler). Data blev indsamlet fra 14-20 tilfældigt udvalgte duktale enheder i afsnittene fra 4-5 prostata per gruppe og er udtrykt som middelværdi + SEM (t-test, sammenlignet med normale voksne prostata).

Hæmning af Wnt signalering fører til undertrykkelse af celledeling og migrering af prostatacancerceller

Aberrant Wnt signalering er blevet observeret i mange tumorer [5], [6]. For at bestemme om Wnt signalering spiller en rolle i prostata tumorigenese og tumorprogression, vi vurderede Wnt signalering status i human prostatacancer-cellelinier og 2 humane prostata tumorxenografter ved måling ekspressionsniveauer af Axin2. Som vist i fig. 6, kvantitativ RT-PCR-analyse afslørede, at Axin2 blev udtrykt ved højere niveauer i PC3, DU145 og LNCaP-cellelinjer og human prostatatumorxenograftmodel prøver (LuCaP35 og LuCaP77) [26], end normale eller ikke-tumorigene humane prostata epitelceller såsom Prec og BPH1 celler [27]. Derfor er Wnt signalering opreguleret i prostatacancerceller sammenlignet med normale prostata-epitelceller.

TaqMan RT-PCR-analyse af Axin2 ekspression i forskellige humane prostata epitelceller og cancerceller. Data blev indsamlet fra trillinger og er udtrykt som middelværdi + SEM (t-test). Bemærk at Axin2 ekspression er meget højere i prostata cancercellelinier (LNCaP, DU145, PC3) og human prostata tumorxenotransplantater (LuCaP35, LuCaP77) sammenlignet med primære prostata epitelceller (Prec) eller ikke-tumorigenenic immortaliserede prostata epitelceller (BPH1) .

Vi næste vurderet, hvorvidt Wnt3a eller DKK1 behandling vil påvirke væksten af ​​PC3 celler. Ved at måle celleproliferation ved hjælp af

3H-thymidininkorporering, fandt vi, at behandling af kulturerne med Wnt3a resulterede i en signifikant stigning i celleproliferation (fig. 7A). I modsætning hertil DKK1 behandling reducerede celleproliferation på en dosis-afhængig måde (Fig. 7A). Lignende resultater blev også observeret i LNCaP-celler (data ikke vist).

For at undersøge, om Wnt signalering påvirker også prostatakræft celle migration eller celle motilitet, vi udførte celle migrationseksperimenter med PC3 celler. Som vist i fig. 7B, tilsætning af Wnt3a i dyrkningsmediet førte til en forøget antal af migrerede celler, hvorimod DKK1 inhiberede cellemigration, sammenlignet med kontrollen kultur. I modsætning hertil behandling af BPH1 celler, hvori ekspression Axin2 var lav eller ikke påviselig (fig. 6) med DKK1, ingen inhiberende virkninger på cellemigration blev set (data ikke vist). På den anden side, enten trypanblåt-farvning eller FACS-sortering under anvendelse af annexin 5 immunfarvning afslørede ikke forøget celledød i DKK1-behandlede kulturer (data ikke vist). Disse resultater antyder, Wnt signalering bidrager til øget cellemotilitet, som igen kan fremme invasionsevne og /eller metastase af prostatacancerceller.

(A) tritieret thymidin inkorporering i PC3 kulturer i fravær eller nærvær af Wnt3a eller DKK1. Mens høj koncentration af Wnt3a (10 nM) øget PC3 celleproliferation, DKK1 inhiberede PC3 proliferation på en dosis-afhængig måde. (B) Regulering af PC3 cellemigration af Wnt signalering. Data blev indsamlet fra 6-8 kulturer per gruppe og er udtrykt som middelværdi + SEM (t-test). Bemærk, at Wnt3a øget antallet af migrerede celler, hvorimod DKK1 hæmmede celle migration.

Diskussion

Rolle Wnt signalering under prostata udvikling

I denne undersøgelse, vi undersøgte rolle Wnt signalvejen i prostata først fra en udviklingsmæssig biologi perspektiv og derefter som en udvidelse, i et nært beslægtet patogene proces, dvs. tumorigenese.

ex vivo

postnatal prostatavæv kultur eksperimenter ikke kun tillader bekvem overvågning af virkningerne af vækstfaktorer eller hæmmende agenter på tidlig prostata udvikling, men også muliggør udførelse af forsøg, selv når udbuddet af reagenser er forholdsvis begrænset. Dette system er tidligere blevet anvendt til at belyse den rolle, androgene hormoner, vævs komponenter og forskellige nye veje i prostata forgrening morfogenese og tidlig udvikling [17], [18], [28] – [30]

Vi har direkte undersøgt rollen som Wnt signalering under prostata udvikling ved hjælp af både Wnt signalering stimulerende og hæmmende faktorer, Wnt3a og DDK1 hhv. Tilsætning af Wnt ligand, Wnt3a, resulterer i forøget celleproliferation og en reduktion af luminal epitelcelledifferentiering, hvorimod behandling med Wnt pathway inhibitor, DKK1, forbedret celledifferentiering og reduceret celleproliferation. Modulering af celleproliferation af Wnt-signalering kan tilskrives til dels til ændrede niveauer af cyclin B2, som cyclin molekyler tidligere er rapporteret at spille en rolle i prostata celleproliferation [31], [32]. Disse data sammen tyder på, at kravet til Wnt signalering i prostata forgrening morfogenese stramt og fint reguleres som både øget og nedsat Wnt aktivitet kunne påvirke prostata forgrening morfogenese i ex vivo kulturer. Desuden vores analyse af messenger RNA-niveauer af Axin2 og β-galactosidase-ekspression i BAT-gal transgene mus som indikatorer for Wnt pathway aktivitet i postnatale prostata antyder også, at Wnt vej er mere aktiv i udviklingen af ​​prostata end modne prostata.

Foreningen af ​​Wnt signal- og prostata basale celler, hvor stamceller er generelt menes at opholde

Vores resultater fra organkulturer udviklingslandenes prostata er i overensstemmelse med den rolle, Wnt signalering i vedligeholdelse af stamceller i andre væv, såsom tarmen [33], brystkirtel [34] og hæmatopoietiske system [35]. Desuden korrelation af basale celler, hvor stamceller er generelt menes at opholde sig med aktivering af Wnt-vejen er også observeret under prostata genvækst efter kastration og hormonal udskiftning. Epiteliale stamceller i prostata er uafhængige af androgen for overlevelse. Følgelig har tidligere undersøgelser vist, at efter kastration, er prostata epitelial progenitorcellepopulationen forstærkede eller beriget [30], [36], [37] på grund af apoptose af androgen-afhængige, terminalt differentieret luminal epitelcelle population. Omvendt, når androgen udskiftes prostata udløses til at re-vokse til sin oprindelige størrelse tilskrives forøget proliferation af progenitorceller og deres efterfølgende differentiering til nye luminale celler. Brug af Axin2 som en molekylær indikator, fandt vi, at Wnt er opreguleret efter kastration men nedreguleres efter androgenerstatningsterapi svarende pænt med indholdet af progenitorceller i prostata. Tilsvarende dynamisk mønster af Wnt aktivitet blev set i BAT-gal transgene mus. Undertrykkelse af Wnt signalvejen efter hormonal udskiftning, som angivet ved nedregulering af Axin2 mRNA eller reduceret antal β-galactosidase-positive celler kan skyldes en interaktion mellem β-catenin og AR-vejen. β-catenin er blevet vist i stand til at interagere med AR og fungerer som en co-aktivator af AR [38]. Det er muligt, at følgende ligandbinding, den aktive form af AR, ud over sin normale funktion som en transkriptionsfaktor for prostata udvikling, også binder og sekvestrerer nukleare β-catenin, hvilket fører til en reduktion i puljen af ​​β-catenin rådighed for β-catenin-TCF trans-aktivering [38]. Som følge af reduceret Wnt signalering, ville prostata progenitorceller derefter induceres til at differentiere til luminale celler. Tilsammen disse resultater giver understøttende dokumentation til rollen som Wnt signalering i progenitorceller vedligeholdelse i prostata epitel.

Konsekvenserne af Wnt-signalering i prostata vækst kræftcelle

Stigende tyder på, at den Wnt pathway kan også bidrage til prostatakræft progression [39]. Adskillige Wnt ligand herunder Wnt1 og Wnt2 er opreguleret i humane prostata tumor prøver [40], [41]. sFRP3 kan undertrykke prostata tumorcellevækst og invasion [42]. Dkk3 er for nylig blevet vist at være nedreguleret i humane prostata tumorprøver, og DKK1 behandling kan hæmme prostata tumorcellevækst [43]. Mere for nylig, er det rapporteret, at adenocarcinomer dannes i en prostata-specifikt APC deletion musemodel [10]. Vores undersøgelse indikerer, at Axin2 er forhøjet i flere human prostatacancer-cellelinier og xenograft humane prostatatumorer i forhold til normal human Prec og ikke-tumorigene immortaliserede humane prostata epitelceller, hvilket giver yderligere støtte til en onkogen rolle for Wnt pathway aktivering i prostata tumorigenese. Desuden er vores konstatering af, at DKK1 behandling signifikant hæmmer prostatakræft cellevækst og migration styrker dette begreb. På grund af iboende vanskeligheder forbundet med produktion og oprensning af en stor mængde DKK1 kræves for in vivo xenograft eksperimenter, har in vivo prostatakræft xenograft eksperiment ikke udført, men er berettiget i fremtiden at bekræfte hæmmende effekt på DKK1 på prostata tumorvækst og progression.

En cancer stamceller model er for nylig blevet foreslået for mange kræftformer. I tilfælde af prostatacancer, cancer stamceller er dem, der menes at være uafhængige af androgen for overlevelse. Da Wnt signalering er vigtig for celleproliferation og differentiering under normal udvikling og er forbundet med de basale celler, hvor progenitorceller er generelt menes at opholde under fornyet vækst efter kastrering og androgenerstatningsterapi, ville det være interessant at bestemme, om Wnt-vejen er også forbundet med prostatacancer stamceller som kan spille en afgørende rolle i androgen modstand og sent stadium prostatakræft progression.