PLoS ONE: telomer Afkortning sensibiliserer Cancer Cells til udvalgte cytostatika: In vitro og in vivo undersøgelser og Formodede Mekanismer

Abstrakt

Baggrund

telomer /telomerase-system er for nylig blevet anerkendt som et attraktivt mål for anticancer-terapi. Telomerase hæmning resultater i tumorregression og øget følsomhed over for forskellige cytotoksiske lægemidler. Men det har ikke været fuldt etableret endnu, om mediator af disse effekter er telomerase hæmning

per se

eller telomer afkortning som følge af hæmning af telomerase-aktivitet. Derudover har de egenskaber og mekanismer sensibilisering til cytostatika forårsaget af telomerase hæmning ikke blevet belyst på en systematisk måde.

Metodologi /vigtigste resultater

I denne undersøgelse vi karakteriseret den relative betydning af telomerase hæmning versus telomer afkortning i kræftceller. Sensibilisering af kræftceller til cytostatika blev opnået ved telomer afkortning i en længde afhængig måde og ikke ved telomerase hæmning

per se

. I vores system denne sensibilisering var relateret til virkningsmekanismen af ​​det cytotoksiske lægemiddel. Desuden telomer afkortning påvirkede også andre kræft celle funktioner såsom migration. Telomere afkortning induceret DNA-skader, hvis reparationen blev forringet, efter administration af cisplatin mens doxorubicin eller vincristin ikke påvirkede DNA-reparation. Disse resultater blev bekræftet også i

in vivo

musemodel. Den formodede forklaring ligger til grund for fænotype fremkaldt af telomer afkortning kan være relateret til ændringer i ekspression af forskellige microRNA’er udløst af telomer afkortning.

Konklusioner /Betydning

Til vores bedste viden er dette den første undersøgelse karakteriserer den relative betydning af telomerase hæmning og telomer afkortning på flere aspekter af cancer celle fænotype, især i forbindelse med følsomhed over for cytotoksiske lægemidler og dets formodede mekanismer. De microRNA ændringer i kræftceller upon telomer afkortning er nye oplysninger. Disse resultater kan fremme udviklingen af ​​telomer tilgange i behandlingen af ​​kræft

Henvisning:. Uziel O, Beery E, Dronichev V, Samocha K, Gryaznov S, Weiss L, et al. (2010) telomer Afkortning sensibiliserer Cancer Cells til udvalgte cytostatika:

In vitro

In vivo

Studier og Formodede mekanismer. PLoS ONE 5 (2): e9132. doi: 10,1371 /journal.pone.0009132

Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: September 30, 2009; Accepteret: December 6, 2009; Publiceret: 9 Februar 2010

Copyright: © 2010 Uziel et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af forskningsbevillinger fra Rabin Medical center Research Authority og en forskningsbevilling fra Sackler School of Medicine, Tel- Aviv University, Israel. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Humane telomerer er sammensat af enkeltstrengede TTAGGG gentagelser og tilsvarende duplekser af denne hexanukleotid placeret ved begge ender af den lineære kromosom. Sammen med deres specifikke shelterin proteinkompleks de giver stabilitet til hele genomet, ved maskering kromosom ender, behandles ved DNA reparationsmekanismer som dobbelt strengbrud [1]. Telomerer trinvist erodere i de fleste somatiske celler efter hver runde af DNA-replikation, indtil de når kritiske kort længde som vinder initierer en standsning af cellevækst betegnes cellulær aldring [2]. Kræftceller bruger enzymet telomerase at omgå telomer afkortning, og dermed opnå uendelig replikativ potentiale. Telomerase er et unikt revers transkriptase ribonukleoproteinkompleks som opretholder en konstant tilstand af telomer længde ved at syntetisere TTAGGG gentagelser ved enderne af kromosomer. Det er meget aktiv i mere end 90% af alle maligniteter, og derfor betragtes som et kendetegn for cancer [3]. Telomerase udtrykkes ikke i de fleste normale somatiske celler, men bevarer moderat aktivitet i proliferative stamceller og i højere grad hos mandlige kimbaneceller. På grund af denne specificitet og væsentlighed til den ubegrænsede levetid af kræftceller, er telomerase betragtes som en gyldig og attraktiv anticancer mål [4].

Faktisk har talrige undersøgelser vist, at telomerase hæmning resulterer i apoptose af cancerceller, svind af tumorer i eksperimentelle dyremodeller og forøget følsomhed af tumorceller til forskellige anticancer modaliteter [5]. Det er dog ikke klart, om disse “gavnlige biologisk ønskelige” virkninger er en følge af telomer afkortning eller telomerase hæmning

per se

. Desuden er det ikke fastlagt endnu, hvis forøgelsen af ​​følsomhed over for cytostatika ved telomerase hæmning /telomer afkortning er afhængig af den mekanisme eller klasse af det kemoterapeutiske middel.

Det meste af datapunkt til afkortning af telomerer under en kritisk grænse som det vigtigste mål opnås ved telomerase inhibering [6], [7], støtter opfattelsen, hvorved opnås betydelige telomer afkortning vil resultere i anti cancer kliniske virkninger. Men flere undersøgelser implicerer yderligere “somme” aktiviteter af telomerase, som er uafhængige af regulering telomer længde. For eksempel har telomerase vist sig at have anti-apoptotiske egenskaber [8], [9]. Desuden sit engagement i DNA skade responset [10] eller DNA beskyttelse ved “capping” [11] blev bestemt som godt. Telomerase blev også impliceret i genekspression kontrol uanset telomer længde og i bidrag til væksten af ​​forskellige typer af godartede [12] – [14]. Og maligne [15], [16] -celler

Formålet med dette undersøgelse var at klarlægge betydningen af ​​telomerase hæmning

per

se versus effekten af ​​telomer afkortning i cancerceller og vurdere effekten af ​​disse forstyrrelser af følsomheden af ​​cellerne til forskellige cytotoksiske lægemidler med forskellige virkningsmekanismer. Desuden har vi sigter mod skildrer de mekanismer, hvormed celler med forkortet telomer længde udstille forskellen følsomhed over for disse lægemidler.

Vi har fundet, at telomerase hæmning

per se

ændrer ikke følsomheden af ​​flere maligne cellelinier til nogen af ​​de testede lægemidler. Langsigtet telomerase inhibering som resulterede i telomer forkortning sensibiliserede cellerne til cisplatin, et DNA-addukter dannende middel og ikke til doxorubicin, en dobbelt strengbrud producerende middel eller vincristin, som virkningsmåde er ikke gennem direkte DNA-skader. Disse resultater blev bekræftet i en dyremodel under anvendelse af nøgne mus med xenografter af pancreas carcinomceller som blev udsat for telomeraseinhibitor og cytotoksiske lægemidler. Celler med kortere telomerer erhvervet DNA skader fænotype, hvis reparation blev forringet, efter kun cisplatin og udtrykte miRNA, der er forbundet med vækst anholdelsen af ​​kræftceller. Disse celler præsenterede også langsommere migration i forhold til deres vildtype (WT) modstykker. Vi foreslår, at telomer afkortning i kræftceller er forbundet med ændringer i miRNA udtryk og fører til forringet DNA-reparation efter udsættelse for cisplatin specifikt.

Materialer og metoder

cellelinier

SK-N-MC (Ewing sarkom) cellelinien blev venligst stillet til rådighed af Dr. Gad Lavie (Sheba Medical center, Ramat-Gan, Israel). MCF-7 (brystcarcinoma) og K562 (kronisk myeloid leukæmi) celler blev opretholdt i RPMI 1640 suppleret med 10-15% varmeinaktiveret føtalt kalveserum (FCS), glutamin (2 mM), penicillin og streptomycin (Beit Haemek, Israel ). Proliferationsassays, apoptose analyser og telomeraseaktivitet assays blev udført på alle cellelinier. SK-N-MC linje blev udvalgt til yderligere detaljeret analyse af forskellige mekanismer relateret til virkningen af ​​telomerase-inhibering på følsomhed over for cisplatin. De kontrol celler blev holdt i kultur uden telomeraseinhibitor, GRN163, parallelt med telomerase hæmmede celler.

Telomerase Hæmning

Celler blev udsat to gange om ugen til telomeraseinhibitor GRN163, rettet skabelonen region af RNA-underenheden af ​​telomerase (hTR). Kontrolsekvenserne celler blev holdt i kultur uden telomeraseinhibitor parallelt med den inhiberede celler. For

in vivo

hæmning af telomerase blev mus injiceret med GRN163L, en palmitoyl (C16) lipid-vedhæftet N3′-P5 ‘phosphoramidat version af GRN163. Begge forbindelser blev venligst stillet til rådighed af Geron Corporation (Menlo Park, CA, USA)

Drug Treatment og

In Vitro

Eksperimentel protokol

Alle cellelinjer blev udsat for følgende lægemidler i tre dage forud for proliferation, cellecyklus og apoptose analyser: cisplatin, et DNA-addukter, der danner lægemiddel, doxorubicin, et dobbeltstrenget rev middel og vincristin, som interfererer med dannelsen af ​​spindel mikrotubuli, stopper således adskillelsen af ​​de duplikerede kromosomer og forhindrer celledeling. Koncentration af lægemidlerne er afbildet i resultatafsnittet

For at vurdere effekten af ​​telomerase hæmning versus telomer afkortning af følsomheden af ​​cellerne til de cytotoksiske lægemidler, vi udtænkt fire eksperimentelle betingelser:. 1. Telomerase blev hæmmet i tre cellelinier for tre dage skaber celler uden telomeraseaktivitet og med intakte (WT) telomerer. 2. Langsigtet hæmning (fra tre til 16 måneder), hvilket skaber celler uden telomerase-aktivitet og forkortede telomerer. 3. Tilbagekaldelse af telomeraseinhibitor i celler med forkortede telomerer, skaber celler med korte telomerer og rekonstitueret telomerase-aktivitet. 4. Som kontrol brugte vi intakte vildtype celler. blev bestemt telomer længde og IC50 af de tre cytotoksiske lægemidler efter 3 og 16 måneder i alle tre cellelinjer.

proliferationsassav

klæbende celler (1 x 10

4 celler ml

-1 SK-N-MC og MCF-7) blev podet i fire eksemplarer i 24-brønds plader. Forskellige lægemidler blev tilsat ved følgende koncentrationer spænder: vincristin: 0-100 ng /ml, doxorubicin: 0-1000 ng /ml og cisplatin: 0-10 pg /ml. Efter 3 dage blev proliferation bestemt med sulforhodamin B-assay [17]. Spredningen af ​​de ikke-adhærente K562-celler blev bestemt ved WST-1 assay, som følger omdannelsen af ​​tetrazoliumsaltet i formazanfarvestof af mitochondriale enzymer i henhold til producentens instruktioner (Roche, Tyskland) og som beskrevet tidligere [17].

TRAP Assay

Celler (5 x 10

4 /ml) blev udpladet i 24-brønds plader og inkuberet i nærvær af GRN163 i 1-3 dage. Hver behandling blev udført i dubletter. Efterfølgende måling af telomeraseaktivitet blev udført ved PCR-baserede TRAP-assay under anvendelse af TRAP

EZE telomerase detektionskit (Intergene, NY, USA), ifølge producentens anvisninger og som tidligere beskrevet [17]. Kort fortalt blev cellerne lyseret med iskold CHAPS lysebuffer) i 30 minutter ved 4 ° C og blev efterfølgende centrifugeret ved 13.000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blev derefter opsamlet, og proteinkoncentrationen blev bestemt ved hjælp af Bradford-assayet (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). Proteinekstrakter (0,2 ug) blev analyseret for TRAP analyse. Hver reaktion blev udført i en reaktionsblanding 50 pi indeholdende 10 × TRAP buffer, dNTP-blanding, TS primer, TRAP primer mix og Taq-polymerase. Reaktioner blev udført ved 30 ° C i 30 minutter og blev derefter udsat for PCR-amplifikation i 30 cykler ved 94 ° C, 58 ° C og 72 ° C i 30 s hver, og blev separeret ved elektroforese på 12,5% polyacrylamidgeler (Acryl /bis 19:01 opløsning). Geler blev farvet med SYBER Green nukleinsyre gel farvning (Amresco, Ohio, USA). Kvantificeringer blev udført under anvendelse af Mængde-on software til Bio-Rad s Billedanalyse systemer (Bio-Rad Laboratories, Israel). Telomeraseaktivitet blev beregnet ifølge følgende formel: TPG = [(X-X

0) /C]: [(R-r

0) /Cr * 100], hvor TPG er det totale produkt genereret, X betegner hver prøve, C repræsenterer 36 bp intern PCR-kontrol, r er TSR8 kvantificering kontrol.

TRF længde

Terminal restriktionsfragment (TRF) længde, svarende til telomer længde, blev målt af en ikke-radioaktiv Southern blot-teknik. DNA-prøver blev ekstraheret fra cellerne ved den Genomisk DNA oprensningskit (Gentra, Minneapolis, MN, USA) ifølge producentens instruktioner, fordøjet i 16 timer ved

HinfIII

Rsal

og udsorterede på 0 · 8% agarose geler. Efter overførsel til positivt ladet nylonmembran blev prøver hybridiseret med digoxigenin-mærket probe (TTAGGG)

4 (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) i 16-18 timer. Membranerne blev derefter udsat for kemiluminescens-følsomme film, og den gennemsnitlige TRF længder blev beregnet af Versa Doc Imaging System, hjælp Mængde One-software (Bio-Rad Laboratories).

Analyser af miR Signature

RNA-isolering.

RNA blev isoleret ved anvendelse af den kommercielle EZ-RNA II kit (Biological Industries, Beit Haemek, Israel) ifølge producentens anvisninger. Generelt blev celler efter relevante behandlinger lyseret i lyseringspuffer af kittet og opbevaret ved -70 ° C før RNA-ekstraktion som blev gjort til alle celler på en gang, før hybridisering med de miRNA arrays.

MicroRNA microarray.

Brugerdefineret microRNA mikroarrays er blevet beskrevet tidligere [18]. Kort fortalt blev ~900 DNA Oligonukleotidprober repræsenterer microRNA (Sanger database version 10 og yderligere microRNA’er forudsagt og valideret af Rosetta Genomics) spottet i tre eksemplarer på coatede microarray dias (Nexterion® Slide E. Schott, Mainz, Tyskland). Hver RNA-prøve (15 ug af total RNA) blev mærket ved ligering af et RNA-linker, p-rCru-Cy /Dye (Dharmacon Lafayette, CO: Cy3 eller Cy5) til 3′-enden. Objektglas blev inkuberet med det mærkede RNA i 12-16 timer ved 42 ° C og derefter vasket to gange. Arrays blev scannet ved beslutning af 10. um og billeder blev analyseret ved hjælp SpotReader software (Niles Scientific Portola Valley, Californien). To typer af positive kontroller blev indbefattet i den eksperimentelle design: (i) syntetiske små RNA’er blev tilsat til hver RNA-prøve før mærkning for at verificere mærkningseffekt og (ii) prober for rigelige små RNA’er blev spottet til at validere RNA kvalitet. Microarray spots blev kombineret og signaler normaliseret som tidligere beskrevet [18]

Dataanalyse

De data, der indgår to prøver:.. SK-N-MC celler med intakte telomerer og SK-N-MC celler med forkortede telomerer. I alt 170 microRNA prober havde et signal, der passerede den minimale tærskel på 300 i mindst én af prøverne. For hvert af disse microRNA-molekyler vi beregnet signalet gange ændring mellem prøverne med korte telomerer og prøven med intakte telomerer.

Cell Cycle og apoptose Analyser

Celler (0,7-1 × 10

4 ml

-1) blev dyrket i 3 dage. Flydende og adhærente celler blev kombineret, vasket med PBS og kerner fremstillet ud fra 5 × 10

5 til 1 x 10

6 celler til flowcytometrisk analyse ved anvendelse af et detergent-trypsin metode efterfulgt af farvning med propidiumiodid [19]. DNA-indhold blev analyseret ved FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) under anvendelse ModFitLT cellecyklusanalyse software (Verity Software House Inc., Topsham, ME, USA). Apoptose blev vurderet ved FACS-analyse, hvorved celler i pre-G1 fase af cellecyklussen blev defineret som apoptotiske.

Påvisning af γH2AX Foci

Celler blev udpladet på dækslides og udsat for lægemidler til 24h, fikseret og behandlet som tidligere beskrevet [20]. Kort fortalt blev cellerne fikseret med 4% paraformaldehide, vasket tre gange med PBS, og permeabiliseret med 5% Triton X i 10 minutter. Efter tre gange vask med PBS blev cellerne blokeret med 10% normalt donkey serum og 1% BSA, vasket igen med PBS og inkuberes med γH2AX antistofopløsning (1:350, Upstate Biotechnology, NY, USA) i 16 timer ved 4 ° C. Det andet antistof CY2 konjugeret anti mus (Jackson Immuno Research Laboratories, PA, USA) blev tilsat efter tre vasket med PBS. Cover slides blev farvet med DAPI og monteringsløsning. γH2AX foci blev visualiseret under fluorescensmikroskop (Applied Spectral Imaging, Migdal Haemek, Israel). 50 kerner blev talt for hver prøve.

The Comet Assay

DNA skader niveauer i celler med forskellige telomer længder og skader opstået efter udsættelse for lægemidler blev vurderet af kometen assay, som beskrevet [21 ]. Dette assay følger skrøbelighed niveau af DNA’et ved at vurdere DNA-fragmenter migration (produkter af enkelte og /eller dobbelte strengbrud) fra nucleus kerne til dannelse komet form, når de udsættes for elektroforetisk felt. Efter farvning med ethidiumbromid, kan omfanget af komet overvåges og kvantificeres. Dybest set, blev cellesuspensionen blandet med 0,65% lavtsmeltende agarose og spredes på en stjerne-frost objektglas, præ-belagt med 0,65% normalt smeltende agarose. Et tredje lag, der indeholder 0,65% lavtsmeltende agarose blev anbragt oven og cellerne blev derefter lyseret ved nedsænkning af objektglassene natten over i en frisk fremstillet lyseopløsning (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X-100 , 10% DMSO, pH 10,0) ved 4 ° C. Efter lyse blev objektglassene vasket tre gange i koldt vand og anbragt i en horisontal gelelektroforese apparat indeholdende frisk fremstillet elektroforese buffer (1 mM EDTA, 300 mM NaOH, pH = 13,0) i 20 minutter for at tillade DNA afvikling. Elektroforese blev derefter udført ved 20 V og ved en startstrøm på 300 mA i 20 minutter ved 4 ° C. Derefter blev objektglassene neutraliseret med tre vaske med 0,4 M Tris, pH = 7,5, dehydrerede med ethanol og tørret. Objektglassene blev farvet med 20 ug /ml ethidiumbromid-opløsning og ses under et fluorescerende belysning under anvendelse 530-550 nm excitation filter og 590 nm spærrefilter (U-MNG terning, Olympus, Tyskland). Alle trin blev udført i mørke for at forhindre yderligere DNA beskadigelse. Til bedømmelse komet parametre blev objektglassene undersøgt parallelt ved hjælp Viscomet billedanalysesoftware. I alt 150 tilfældigt udvalgte celler fra tredobbelte objektglas blev undersøgt for hver prøve (50 celler pr slide). Billedanalyse blev udført ved × 200 forstørrelse. Cellen billeder blev projiceret på en høj opløsning Heper-HAD ™ (Sony, Japan) CCD-kamera (8 bit [Applitec, Israel, LIS-700]) og analyseret med Viscomet billedanalyse software ved hjælp af MV Delta frame grabber (Matrix Vision , Tyskland). DNA-skader blev målt ved anvendelse af følgende parametre: komet omfang (afstanden fra den forreste hoved kant til den bageste kant af halen), procentdel hale-DNA (procentdel af DNA i halen), og hale omfang øjeblik (hale længde X procentdel hale-DNA ). Slides blev kodet og en enkelt investigator analyseret alle dias for at minimere scoring variation

Migration Analyser

Migration af cellerne blev evalueret ved to analyser:. Sårhelingen analysen og en modificeret Boyden kammer assay (Transwell assay).

sårhelende assay blev udført ifølge ref [22]. Celler blev podet ved en tæthed på 0,2 x 10

6 celler /brønd i seks-brønds dyrkningsplader og lades danne et konfluent monolag. Laget af celler blev derefter skrabet med en P200 pipette tip at skabe et sår på ~ 1 mm bredde. Billeder af sårene blev taget til fange ved

t

= 0 og 24 timer ved × 40 forstørrelse og sårområdet blev bestemt ved anvendelse af Scion Image for Windows alpha 4.0.3.2 software. Evnen af ​​cellerne for at lukke såret, dvs. deres motilitet, blev evalueret ved at bestemme helbredte område. Procentdel af helede område blev beregnet på følgende måde: (sår område ved

t

= 0-sårområdet ved

t

= 22) /sår område på

t

= 0) × 100. Pladerne blev mærket for at sikre ensartet foto-dokumentation.

Modified Boyden kammer blev udført som tidligere [23] beskrevne. Celler blev podet i triplikater på polycarbonatfiltre med 8 um porer anbragt på det øvre rum af 24-brønds transwell kamre (Costar, Cambridge, Mass, USA). Bundfladen af ​​Transwell kamre blev overtrukket med fibronectin (5 pg /filter). Dyrkningsmedium blev tilsat til det nedre rum. Cellerne fik lov til at migrere i 18 timer ved 37 ° C, og filtrene blev derefter fikseret med methanol og farvet med Giemsa farve. Cellerne på den øvre overflade af filteret blev fjernet med en vatpind. Endelig blev celler, der er migreret til bunden af ​​filteret fotograferet og talt under et mikroskop.

Dyr

athymiske kvinde eller mand BALB /c

nu /nu

mus, 5-6 uger gamle, blev erhvervet fra Harlan Ltd. (Jerusalem, Israel). Musene blev opstaldet under specifikke patogenfrie forhold i top filtrerede bure og fodret med en almindelig kost. Alle procedurer blev udført ved hjælp af faciliteter og protokoller godkendt af Animal Care og brug Udvalg for Hadassah-Hebrew University School of Medicine.

Menneskelig xenotransplantat murin model

CRL 1867 celler (human pancreas karcinom) blev høstet ved trypsinisering sammenflydende kulturer, vasket og resuspenderet ved 1,0 x 10

8 celler /ml i vækstmedium. Mus blev inokuleret med CRL 1687 celler i 100 ul medium under den dorsale hud ene dag efter bestråling af hele kroppen ved 400 cGy, leveret af en lineær accelerator (Varian Climac 6 ×) ved en kilde til hud afstand på 80 cm, og en dosis på 170 cGy /min. Mus blev behandlet med 30 mg /kg i.p. GRN 163L 3 gange om ugen i flere uger, begyndende en dag efter tumor injektion. Kontrolgruppen blev injiceret med PBS (0,2 ml i.p.). Tumorvækst blev overvåget hver 6-8 dage ved caliper målinger af to vinkelrette diametre af xenotransplantater (D

1, den større diameter og D

2, den mindre diameter). Tumor volumen blev målt ved hjælp af formlen: Tr /6 (D

1 × D

2), og udtrykt som gennemsnitlig tumor volumen ± SE (i mm

3). Ved 41-55 dage efter celleinjektion, på tidspunktet for aflivning blev tumorer udskåret fri for bindevæv, vægtet og halvdelen af ​​dem blev frosset i flydende nitrogen. Den anden halvdel blev anvendt til telomerlængde bestemmelse og patologiske parametre.

Histologi

Ved slutningen af ​​eksperimenterne blev mus aflivet, og tumoren, bugspytkirtel, og lungevæv blev fjernet. Væv blev fikseret i 10% formalin, indlejret i paraffin, farvet med hematoxylin og eosin, og evalueret ved lysmikroskopi.

Resultater

In vitro

Studies

telomerase hæmning med GRN163 forkorter telomerer.

Administration af GRN163 resulterede i 70-90% hæmning af telomerase (fig. 1a). Denne inhibering varede op til 72 timer og gentagne målinger med de 16 måneder af forsøget verificerede kontinuerlig inhibering af telomerase på dette område (ikke vist). I alle cellelinier telomerer blev afkortet i et område på 20-30% og 40% efter 3 og 16 måneder, henholdsvis (fig. 1 b).

a. SK-N-MC, MCF-7 og K562 blev udsat for 5um af GRN163. Telomeraseaktivitet blev vurderet af TRAP-assay efter 24 timer. C- kontrol ubehandlede celler, m- mismatch-specifik krypteret oligo, I-telomeraseinhibitor GRN163. R8- standard TRAP kontrol, N- negativ kontrol uden celleekstrakter, IC- intern PCR-kontrol. Omfanget af telomerase inhibering betegnes i procenter nedenfor banerne. b. SK-N-MC-celler kontinuerligt udsættes for 5 uM af GRN163. Telomerlængde blev målt ved Southern blot. C- kontrol ubehandlede celler, Ia- telomer længde celler udsat for telomeraseinhibitor i tre måneder, Ib- telomer længde celler udsat for telomeraseinhibitor i 16 måneder, M- molekylstørrelse markør. Mean telomerlængde betegnes under hver bane, og procenten af ​​telomer afkortning vises også. c. Grafisk præsentation af omfanget af telomer afkortning efter udsættelse af SK-N-MC-celler til GRN163 i 1 år målt ved Southern blot.

telomer afkortning men ingen telomerase hæmning

per se

sensibiliserer celler specifikt til cisplatin.

Som vist i fig. 2 og tabel 1 telomer afkortning øget følsomhed af de tre cellelinier til cisplatin i en længde afhængig måde. Telomerase hæmning

sig selv

havde nogen selvstændig effekt på celler følsomhed over for cisplatin. IC

50 af cisplatin faldt fra 0.13μg /ml til 0.07μg /ml efter 16 måneder. Telomer afkortning påvirkede ikke signifikant cellernes følsomhed over for doxorubicin og vincristin. Tabel 1 opsummerer disse resultater og fig. 2 viser i detaljer de ændringer i følsomhed SK-N-MC-celler til cisplatin. Eftersom alle cellelinjer opførte sig på lignende måde i denne henseende, udvalgte vi SK-N-MC-celler som en model for yderligere karakterisering af mekanismerne bag telomer forkortning induceret sensibilisering af cancerceller for kemoterapi og forskellig sensitivitet til cisplatin.

a. Proliferation af celler med forkortede telomerer udsat for cisplatin. SK-N-MC-celler kontinuerligt udsættes for GRN163. Følsomheden af ​​cellerne til cisplatin blev anslået efter tre og 16 måneder efter telomerase-inhibering. Tal angiver IC

50 af lægemidlet i disse tidspunkter (efter 22% og 40% reduktion i telomerlængde). P-værdi betegner forskellen mellem WT og korte tel-16 måneder. b. Cellestatus cyklus af SK-N-MC-celler med forkortede telomerer udsat for 0.13μg /ml cisplatin. SK-N-MC-celler med forkortede telomerer blev udsat for cisplatin og cellecyklus status blev bedømt ved FACS. + Eller – refererer til udsættelse for cisplatin. C. apoptotiske indeks for SK-N-MC-celler med forkortede telomerer udsat for cisplatin. De samme celler blev analyseret ved FACS for deres apoptotiske indeks, som repræsenteret ved deres preG1 status. Tallene angiver LD

50 af cisplatin i celler med intakte eller forkortede telomerer.

telomer afkortning påvirker ikke status cellecyklus efter udsættelse for cytotoksiske lægemidler.

telomer afkortning påvirkede ikke cellecyklus status af cellerne (barer A og C i fig. 2b). Eksponering af cellerne til cisplatin resulterede i fald i G0 /G1 og forøgelse af G2 /M-faser af cellecyklus. Disse ændringer blev ikke påvirket af afkortning af telomerer (fig. 2b). Også telomer afkortning gjorde øge den apoptotiske rate af cellerne på grund af kemoterapi (fig. 2c).

telomer forkortning langsommere migration af cancerceller.

Da

in vitro

migration af kræftceller betragtes som en gyldig repræsentation af deres metastatiske potentiale, vi evaluerede effekten af ​​telomer afkortning om denne funktion også. Migrationen blev vurderet ved transwell membran (Boyden kammer) (fig. 3a, b) og sårhelingen (fig. 3c, d) assays. Som vist i fig. 3, på transwell membranassay cellerne med forkortede telomerer migrerede signifikant langsommere end kontrolcellerne. Den sårhelende assay viste også tendens til langsommere migration, men resultaterne ikke nåede statistisk signifikans.

Migrationen af ​​celler med forkortede telomerer blev vurderet ved transwell og sårhelende assays. en. Transwell membran assay. Celler med intakte eller forkortede telomerer fik lov til at migrere gennem en membran i 16 timer, Gimza farves og tælles. Et repræsentativt billede vises. b. Grafisk demonstration af de gennemsnitlige celletal af fire uafhængige forsøg. c. Den sårhelende assay. Celler med forkortede telomerer blev udpladet på petriskåle, og kulturen blev “ridset” og følges i 24 timer. Gennemsnitlige målinger af celle frie huller blev gjort. Et repræsentativt eksempel er vist. d. Grafisk demonstration af de gennemsnitlige celletal af fire uafhængige forsøg.

De efterfølgende undersøgelser blev udført for at belyse de potentielle mekanismer bag de fænotypiske forandringer som følge af telomer afkortning.

telomer afkortning er forbundet med øget DNA-beskadigelse og nedsat DNA-reparation evne som evalueret af komet assay. Cisplatin svækker yderligere DNA-reparation i celler med forkortede telomerer.

Telomerer afkortning kan øge DNA-skader reaktion på grund af tab af sin beskyttende funktion. Til bedømmelse af niveauet af DNA-skader i celler med kortere telomerer, anvendte vi den comet assay. Som vist i fig. 4a, b telomer afkortning var forbundet med DNA-skader i cellerne. Tail udstrækning øjeblik parameter (reflekterende hale længde X procent hale-DNA, mens hale længde er afstanden i um fra hovedcentret til enden af ​​halen) blev 30% højere i cellerne med kortere telomerer. Vurdering af alle andre komet analyseparametre afslørede lignende resultater, og den samlede komet intensiteten steg i omkring 16% i disse celler.

a. Princippet om kometen assay. Celler kerner blev udsat for elektroforese og farvet med ethidiumbromid. Broken DNA migrerer ud af kerner og danner kometen. Tre grader af DNA-skader er vist: kontrol kerner med intakt DNA (der repræsenterer DNA-skader i celler med intakte telomerer, # 1), mellemliggende tilstand i celler med delvist brudt DNA (som repræsenterer celler med mild telomer afkortning, # 2) og celler med forkortede telomerer huser beskadiget brudt DNA (som repræsenterer celler med forkortede telomerer, # 3). b. Kvantificering af omfanget af DNA-skade status af celler med forkortede telomerer, udføres ved screening 50 billeder per prøve i firdobler. På parameter i venstre Tail omfang øjeblik, på højre samlede komet intensiteter. c. Kvantificering af omfanget af cellernes evne til at reparere DNA-skader påført ved doxorubicin (højre panel) eller cisplatin (venstre panel) 2 og 4 timer efter lægemiddelinduceret skade. Assayet blev udført ved screening af 50 billeder per prøve i firdobler. DNA beskadigelse status blev bestemt ved at beregne halen omfang øjeblik.

For at forstå, hvorfor celler med kortere telomerer er mere følsomme over for cisplatin end for doxorubicin, blev cellerne eksponeret for disse stoffer i en time efterfulgt af ændre medium til medium uden lægemiddel. DNA damage niveauer blev evalueret 2 og 4 timer efter eksponering lægemiddel under anvendelse af comet assay. Som vist i fig. 4c, begge lægemidler inducerede DNA-skader, men cellerne med forkortede telomerer undladt at reparere DNA-skader forårsaget af cisplatin, medens doxorubicin induceret skade blev repareret på lignende måde ved celler med både intakte og forkortede telomerer.

telomer afkortning er forbundet med dannelsen af ​​telomer skader induceret foci (TIF), hvis reparation er svækket i celler med forkortede telomerer. Cisplatin svækker yderligere clearance af TIF efter telomer afkortning.

DNA skade responset på telomerer manifesterer sig ved fremkomsten af ​​TIF indeholder γH2AX. en. b. c. Fig.