PLoS ONE: peptidisk Ukonjugeret GRP78 /BiP ligand modulerer udfoldet protein respons og inducerer prostatakræft Cell Death

Abstrakt

Den molekylære chaperone GRP78 /BiP er en vigtig regulator af protein foldning i det endoplasmatiske reticulum, og det spiller en central rolle i kræftcellen overlevelse og kemoresistens. Inhibering af dens funktion har derfor været en vigtig strategi til inhibering af tumorcellevækst i cancerterapi. Tidligere indsats for at nå dette mål har brugt peptider, der binder til GRP78 /BiP konjugeret til pro-narkotika eller celle-død-fremkaldende sekvenser. Her beskriver vi et peptid, der inducerer prostata tumorcelledød uden behov for nogen konjugerende sekvenser. Dette peptid er en sekvens afledt af cochaperone Bag-1. Vi har vist, at denne sekvens interagerer med og hæmmer refoldning aktivitet af GRP78 /BiP. Endvidere har vi vist, at det modulerer udfoldet protein reaktion i ER stress resulterer i PARP og caspase-4 spaltning. Prostata kræftceller stabilt udtrykker dette peptid viste reduceret vækst og øget apoptose i

in vivo

xenograft tumormodeller. Aminosyresubstitutioner, der ødelagde binding af Bag-1 peptid til GRP78 /BiP eller nedregulering af ekspressionen af ​​GRP78 kompromitteret den inhiberende virkning af dette peptid. Denne sekvens repræsenterer derfor en kandidat bly peptid for anti-tumor terapi

Henvisning:. Maddalo D, NEEB A, Jehle K, Schmitz K, Muhle-Goll C, Shatkina L, et al. (2012) En Peptid Ukonjugeret GRP78 /BiP ligand modulerer udfoldet protein respons og inducerer prostatakræft celledød. PLoS ONE 7 (10): e45690. doi: 10,1371 /journal.pone.0045690

Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA

Modtaget: 20. januar 2012; Accepteret: August 23, 2012; Udgivet: Oktober 1, 2012 |

Copyright: © Maddalo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Foreningen for International Cancer Research, det Forenede Kongerige; den tyske Science Foundation, Den Europæiske Union 6. rammeprogram PRIMA, og start-up midler fra Karlsruhe Institute of Technology. Danilo Maddalo var en modtager af en Marie Curie forskning stipendium CANCURE i EU 6. rammeprogram. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

glucose reguleret protein GRP78 (også kendt som BiP, immunoglobuling tung kæde bindende protein) er et medlem af varmechokprotein familie og spiller en vigtig rolle i opretholdelsen af ​​cellulær homeostase [1]. Det er nøglen regulator af det udfoldede protein respons (UPR), en vej aktiveres ved akkumulering af ufoldede peptider under stressende forhold, såsom varmechok, acidose, næringsstofudsultning og hypoxi [2].

GRP78 regulerer UPR ved at binde de transmembrane sensor proteiner perk (PKR-lignende endoplasmatisk reticulum-resident kinase), ATF6 (aktiverende transkriptionsfaktor 6) og IRE1α (inositol-krævende enzym α) (gennemgået i [3]), der fører dels til en øget transkription af molekylære chaperoner såsom GRP78 selv, GRP94 og protein-(PDI) [4], [5] og på den anden side at proteinsyntese nedlukning ved phosphorylering af alfa-underenheden af ​​det eukaryote initieringsfaktor eIF2α [6]. Som følge af disse to effekter, overvinde celler at blive overbelastet med afvigende peptider og de overlever [7]. Men langvarig eIF2α fosforylering aktiverer, transskription faktor ATF4 [8], [9] fører til øgede niveauer af det pro-apoptotiske faktor CHOP (C /EBP homologt protein) [10], [11]. Aktivering af ER-stress-medieret apoptose resulterer i spaltning af caspsase 4, en ER-stress specifik caspase, og PARP (poly (ADP) -ribosome polymerase) [12], [13].

GRP78 overudtrykkes i flere typer af tumorer, såsom prostata [14], bryst [15], [16] og tyktarm og dens udtryk ofte korrelerer med dårlig prognose [17], [18], [19]. Men GRP78 nedregulering af siRNA øger apoptose og sensibiliserer celler til kemoterapeutiske lægemidler [20], [21]. Generelt transformerede celler opregulerer GRP78 niveau [15] for at overleve de vanskelige forhold med tumormikromiljøet [22], [23], [24]. Adskillige terapeutiske midler er derfor rettet mod UPR eller mod GRP78 /BiP at bremse tumorcellevækst [25], [26], men virkelig er endnu ikke identificeret selektive hæmmere [15]. I en søgning efter yderligere hæmmere af GRP78 /BiP, der ville være af terapeutisk relevans, har vi brugt oplysninger om regulering af ER stress ved cochaperone Bag-1 [27] for at identificere en sekvens fra Bag-1, der binder sig til og hæmmer handling af GRP78 /BiP.

Bag-1 er en familie på fire polypeptider (Bag-1L, -1M, -1 og -1S-) med multifunktionelle domæner, der interagerer med og regulerer aktiviteterne i forskellige cellulære proteiner [ ,,,0],28]. Disse proteiner har divergerende N-terminale sekvenser men med fælles centralt beliggende ubiquitin-lignende domæne, der danner et link til HSC /Hsp70 til proteasomet [29] og et konserveret C-terminalt Hsp70 bindende domæne (ellers kendt som BAG-domæne), der binder til Hsp70 /Hsc70 og fungerer som et nukleotid udveksling faktor [30], [31]. Bag-1 har også vist sig at regulere endoplasmatiske reticulum (ER) stress-induceret apoptose [27] og binde GADD34, en komponent af ER stress [32], men detaljer om sin indsats er ikke kendt.

I denne meddelelse viser vi, at Bag-1 binder til GRP78 /BiP gennem et peptid overlappende sin ubiquitin-lignende domæne. Vi viser desuden, at GRP78 /BiP bindingspeptid af Bag-1 inhiberer virkningen af ​​GRP78 /BiP og forstyrrer UPR fører til induktion af apoptose. Vi har indsnævret dette peptid og identificeret en kerne motiv af syv aminosyrer, der vises afgørende for binding til GRP78 /BiP og for den negative regulering af prostata tumorcellevækst. Denne kerne sekvens kunne være udgangspunktet for fremtidige lægemidler rettet mod hæmning af GRP78 /BiP handling og af UPR.

Materialer og metoder

Cell Culture

Menneskelig godartet prostatahyperplasi cellelinie BPH-1 blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med glutamin. PC3 og DU145-celler blev også dyrket i DMEM men uden glutamin 22Rv.1, LNCaP og PNT-2-celler blev dyrket i RPMI 1640. Alle ovennævnte dyrkningsmedier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum. RWPE-1-celler blev dyrket i keratinocyt serumfrit medium. Alle dyrkningsmedier blev holdt ved 37 ° C i en atmosfære af 5% CO

2.

Antistoffer

Goat monoklonalt antistof GRP78 (N20), kanin polyklonale antistoffer mod Bag-1 (C-16), eIF2α og phospho-PERK blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland. Kanin polyklonalt anti-GRP78 (ab21685), anti-GCN2 (ab37674), anti-PERK (ab65142), anti-phospho-IRE1α (ab124945) antistoffer, kanin monoklonalt anti-phopsho-GCN2 (ab75836) antistof og muse monoklonale anti-β actin (ab8226) antistof blev indkøbt fra Abcam, Cambridge, UK. Mus antistof mod HA-tag (HA.11 klon 16B12) blev købt fra Covance, München, Tyskland. Rotte monoklonalt antistof mod HA (3F10) blev indkøbt fra Roche, Mannheim, Tyskland. Antistoffer mod IRE1α, phospho-eIF2α CHOP, PARP og ATF4 blev købt fra Cell Signaling Technology, Frankfurt am Main, Tyskland. Anti-ATF6 antistof blev købt fra IMGENEX, Hamburg, Tyskland. Caspase 4-antistof blev købt hos MBL, München.

ekspressionsvektorer og Plasmider

Ekspressionsvektoren pcDNA3.1-HA-Bag-1 kodende Bag-1 er blevet tidligere beskrevet af [ ,,,0],33]. Den konstruktion, der koder Bag-1Δ68mer (Bag-1 mangler aminosyrerne 202-269) blev oprettet ved udskiftning af SacII-XbaI fragment af Bag-1-cDNA i en pcDNA3-Bag-1-konstruktionen. Konstruktionen pcDNA3-HA Bag-1-peptid (BAG1-L 202-269), N-terminal (Bag-1L 202-241), C-terminal (Bag-1L 241-269), 19-mer (Bag-1L 202 -220), blev ΔUbi (Bag-1L 220-269) og 19-mer-mutant (Bag-1L 202-220) peptider skabt ved PCR-amplifikation med et HA-sekvens. Som en kontrol, introducerede vi HA sekvens i pcDNA3-vektoren for at generere den tomme ekspressionsvektor pcDNA3.1-HA. pcDNA3.1 Bag-1ΔC47 (Bag-1, der mangler de sidste 47 aminosyrer) blev klonet ind i Bam HI-Xho I-stederne i pcDNA3.1-HA-vektoren efter PCR-amplifikation under anvendelse af pcDNA3.1-HA Bag-1 som template. For GST-pull-down eksperimenter, pGEX4T.1-Bag-1 68mer sekvens, pGEX4T.1-N-terminale peptid, pGEX4T.1-C-terminale peptid, pGEX4T.1 Bag-1Δ Ubi, pGEX4T.1-19mer og pGEX4T.1-19mer mutanter blev skabt ved at fusionere PCR amplifikationsprodukter af de respektive Bag-1L-sekvens i ramme med GST i vektoren pGEX4T.1. GST plasmider, der koder for GST-fusionerede GRP78, GRP78-ATPase (GRP78 1-408), blev GRP78-SBD (GRP78 409-651) og Bag-1-isoformer frembragt ved PCR og klonet i pGEX4T.1 efter BamHI-Xhol-fordøjelse. Plasmidet pCMV6-GRP78 [34] blev købt fra OriGene Technologies (Darmstadt, Tyskland).

Cell transfektion, siRNA Knock-down og vestlige Blotting

Medmindre andet er angivet, stabil transfektion blev udført i 22Rv.1 eller BPH-1-celler med 10 ug plasmid-DNA under anvendelse FuGene 6 ™ (Roche Diagnostics Mannheim, Tyskland) stabilt transficerede 22Rv.1 celler blev selekteret med 0,8 mg /ml, mens BPH-1-cellekloner blev selekteret med 1,2 mg /ml G418. LNCaP, PC3, DU145, PNT-2 og RWPE-1-cellekloner blev selekteret med 1 mg /ml G418. Specifik nedregulering af GRP78 ekspression blev opnået ved transfektion siRNA-duplexer (GRP78:5′-GGAGCGCAUUGAUACUAGATT-3 ‘) to gange i 72 h under anvendelse HiPerfect ™ (Qiagen Hilden, Tyskland). siRNA mod GFP (5’-GGCUACGUCCAGGAGCGCACC-3 ‘) blev anvendt som kontrol. Western blot-analyse blev udført som tidligere beskrevet [35].

Co-immunfældning

22Rv.1 celler blev anvendt til interaktionsstudier af endogent Bag-1 og GRP78 /BiP, mens for

in vivo

interaktionen af ​​Bag-1-peptid og GRP78 /BiP, HEK-293-celler blev transficeret med et plasmid, der koder HA-mærkede Bag-1-peptid. Fireogtyve timer inden forsøget blev cellerne i begge tilfælde vaskes med phosphatpufret saltvand (PBS) og behandlet med 20 mM dithiobis (succinimidylpropionat) (DSP) i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur. Reaktionen blev standset med 20 mM Tris, og cellerne blev lyseret i 50 mM Tris-HCI pH 7,4, 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,4% NP40 og 1% protease inhibitor cocktail. Immunopræcipitation af GRP78 /BiP blev udført natten over ved 4 ° C med anti-GRP78 antistof koblet til Sepharose A-perler (Abcam, ab21685). Binding af endogen Bag-1 eller af HA-peptid blev bestemt ved Western blotting hjælp af en Bag-1 eller en HA specifikt antistof.

Protein Expression og Sample Preparation

En TEV protease-spaltelige GB1 -kondenseret Bag-1-peptid blev udtrykt i

Escherichia coli

stamme BL21 (DE3) pLys S. ensartet mærkning med

15N til NMR-spektroskopi blev opnået ved at dyrke bakterier i minimalt medium suppleret med 0,5 g /l

15NH

4 cl. Den GB1-His

6-mærkede protein blev oprenset over en Ni-NTA-søjle (Qiagen, Hilden, Tyskland), efterfølgende fordøjet med rekombinant TEV-protease og passeret over en anden Ni-NTA kolonne for at fjerne både fusionstag’en og hans

6-mærket protease. Endelig blev proteinet puffer ændret til 20 mM kaliumphosphat, 100 mM NaCl, pH 6,8. Proteinkoncentration blev estimeret ved sammenligning af intensiteten af ​​en 1D NMR-spektrum med den for et referencestof (DSS, 2,2-dimethyl-2-silapentan-5-sulfonsyre).

GST-HA-mærkede N-terminale og C-terminale peptider blev fremstillet under anvendelse af en standardprotokol. GST-delen blev fraspaltet ved fordøjelse med thrombin ifølge producentens protokol (Roche, Mannheim, Tyskland). Det resulterende præparat rå peptid blev yderligere oprenset ved omvendt fase HPLC (C18-søjle, 250 x 10 mm, Grace) med en vand /acetonitril lineær gradient. Identiteten og renheden af ​​de indsamlede fraktioner blev analyseret ved MALDI-TOF massespektrometri (Bruker Autoflex III). PH blev neutraliseret før lyofilisering. Peptidet blev opløst i 20 mM KPO

4, pH 6,8. Proteinkoncentration blev beregnet ud fra den optiske densitet ved 275 nm under anvendelse af absorbansen af ​​de tyrosiner i HA-tag.

CD spektroskopi

CD-spektrene for peptiderne blev registreret på et Jasco J- 810 spektropolarimeter (Jasco Co, Tokyo, Japan) ved 20 ° C, under anvendelse af en vand-termostateret celleholder. Koncentrationerne af Bag-1, N-terminale og C-terminale peptider var 17 pM, 12 pM, og 11 uM. CD-spektre er gennemsnit af tre scanninger på en scanning på 10 nm min

-1, 4 s responstid og 1 nm båndbredde, og de blev udglattet af den adaptive udjævning metode, der er en del af Jasco Spectra Analysis software . Bufferen bidrag blev trukket.

NMR eksperimenter

Proteinkoncentration for NMR eksperimentet var 0,5 mM. For kemiske skift kalibrering og at sammenligne de relative signalintensiteter, blev 0,2 mM DSS (2,2 dimethyl-2-silpentane-5-sulfonsyre) tilsat.

15N-HSQC spektre blev erhvervet ved 23 ° C på en Bruker Avance II 600 spektrometer (Bruker, Karlsruhe) udstyret med en bredbåndsforbindelse tredobbelt resonans sonde hoved med 4 scanninger pr tilvækst og i alt 128 trin i den indirekte dimension. Data blev behandlet med NMRPIPE [36] og analyseret ved hjælp af NMR-VIEW.

fluorescenspolariseringstest

fluorescenspolariseringstest blev udført ved hjælp af en Infinite F-200 læser (Tecan) med excitation ved 490 nm og emission ved 535 nm.

Tumor xenografundersøgelser

Alle eksperimenter dyr blev udført i henhold til europæiske og tyske lovmæssige bestemmelser. Til generering af xenograftmodeller 5 × 10

6 LNCaP-celler blev resuspenderet i en opløsning af 50% Matrigel® (BD Bioscience, Heidelberg, Tyskland) i PBS eller 5 × 10

6 22Rv.1 celler i 100 pi PBS blev subkutant injiceret i begge flanker af 6-8 uger gamle athymiske nøgne mus. Tumorstørrelse blev målt med en passer hver uge. Tumorer afledt af injektion af stabile kloner, der overudtrykker Bag-1-peptid blev analyseret over en periode på 9 uger, mens tumorer fra celler transficeret med den tomme ekspressionsvektor eller ekspression af N-terminalen, C-terminalen og AN-peptidet blev analyseret over 5 uger. Tumorstørrelse blev vurderet måling tre vinkelrette diametre efter formlen: V = (1/6) [π] (d1d2d3), hvor π er en matematisk konstant og d1, d2 og d3 repræsenterer de tre rumlige dimensioner (bredde, dybde og højde ). Mus blev aflivet ved cervikal dislokation, og tumorerne fjernes til yderligere analyse.

GST-pull-down Eksperimenter

Ekspression af GST-fusionsproteiner for GST-pull-down-forsøg udførtes i det væsentlige som beskrevet tidligere [37].

Immunhistokemi

Væv blev fikseret i 10% formalin i 16 timer ved stuetemperatur, opbevaret i ethanol (50%), paraffinindlejret, og snittet 5 um tyk med et Leica RM 2155 mikrotom. Apoptotiske celler blev detekteret via klemme deoxynukleotidyltransferase-medieret deoxyuridin-triphosphat-biotin nick endemærkning (TUNEL) assay under anvendelse af DNA-fragmentering ApopTag® peroxidase

in situ

apoptose afsløring kit (Millipore, Schwalbach, Tyskland).

Cell levedygtighed assay

CellTiter-Blue® cellernes levedygtighed (Promega) blev anvendt til bestemmelse af cellelevedygtighed. Kort fortalt 22Rv.1 celler stabilt overudtrykker Bag-1-peptid blev podet i brønds plade to 96 (4500 celler /brønd) og målingerne blev udført tre gange. Én plade blev analyseret på dag 0 og den anden plade, 2 dage senere. Tre timer efter podning blev 20 pi farvestof tilsat til hver brønd indeholdende 100 pi kulturmedium og inkuberet i 4 timer ved 37 ° C. Fluorescens blev målt ved det pladeformede læsning fluorometer Fluostar Optima (2001, BMG Labtechnology, softwareversion 1,10-0) og præsenteret som forholdet mellem værdien ved excitationsbølgelængden (560 nm) over emission bølgelængde (590 nm). Celleproliferation blev bestemt ud fra forskellen mellem fluorescensintensiteten ved det endelige tidspunkt, og værdien opnået ved dagen for udsåning af cellerne (dag 0).

In vivo

Refoldning Assay

In vivo genfoldning assay blev udført i det væsentlige ifølge fremgangsmåden beskrevet af [38] metode. HEK-293 i en 70% -confluent 10 cm skål blev transficeret med β-actin-Fire Fly luciferase-konstruktion (2 ug), pcMV6-GRP78 (3 ug), Bag-1 eller Bag-1-peptider i pcDNA3.1-HA (6 ug) og Renilla luciferase-konstruktion (0,5 ug) for lige transfektion kontrol. To dage efter transfektion blev cellerne delt i to og inkuberet i varmechok puffer (MOPS 20 mM og cycloheximid 20 ug /ml) i 30 min ved 37 ° C. Den ene halvdel af de transficerede celler var varmechok i 30 minutter ved 45 ° C og fik lov til at komme sig ved 37 ° C i 30 minutter. Den anden halvdel blev efterladt ubehandlet og anvendt som kontrol. Ved slutningen af ​​eksperimenterne blev cellerne høstet, lyseret og luciferaseaktivitet blev målt. Aktiviteten målt for den ikke-varmechok-celler blev sat til 100% af refoldet luciferase og aktivitetsmålingerne af varmechok celler blev udtrykt i forhold denne værdi.

Statistical Analysis

Medmindre andet er angivet beregninger af statistisk signifikans i dette arbejde blev udført i henhold til Students t-test.

Resultater

Bag-1 interagerer med GRP78 /BiP

Som Bag-1 er rapporteret at mægle ER-stress og til at interagere med en af ​​komponenterne i UPS [27], [32], undersøgte vi, om det også binder til GRP78 /BiP, et centralt element i ER stress vej. Vi først afgøres, om Bag-1 interagerer med GRP78 /BiP i en GST pull-down assay under anvendelse lysat fra 22Rv.1 prostata kræftceller. Western blot-analyse under anvendelse af en GRP78 /BiP specifikt antistof viste, at alle medlemmerne af Bag-1-familien af ​​proteiner interageret med GRP78 /BiP (figur 1A).

In vivo

interaktion blev også demonstreret i et co-immunopræcipitering assay, hvori Bag-1 viste sig at binde til GRP78 /BiP i 22Rv.1 celler (Figur 1B). Desuden kunne vi vise en perinukleær lokalisering af Bag-1 og GRP78 /BiP i en immunofluorescens under anvendelse 22Rv.1 celler (Figur 1C) indebærer en ER lokalisering af Bag-1. Dette resultat blev bekræftet i en anden immunofluorescens eksperiment, hvor vi kunne vise colokalisering af Bag-1 med en ER tracker (Figur S1).

For at bestemme domæne GRP78 /BiP involveret i dets binding til Bag-1, vi brugte GST-fusionskonstruktioner i de to vigtigste regioner GRP78 /BiP (ATPase og substrat-bindende domæne-SBD) (figur 1 D) i pull-down eksperimenter med HEK-293-celler, der overudtrykker Bag-1. Western blot analyse viste, at Bag-1 interagerede ikke kun med fuld længde GRP78 /BiP men også med ATPase og SBD (figur 1E). Som Bag-1 er rapporteret at binde til ATPase-bindende domæne af den molekylære chaperone Hsp70 /Hsp70 [39] og GRP78 /BiP tilhører denne familie af chaperoner [40], vores fund, at SBD af GRP78 /BiP som også er underlagt Bag-1 er temmelig spændende og identificerer en ny interaktion site af Bag-1 i den molekylære chaperone familien. Vi brugte derfor SBD af GRP78 /BiP i yderligere karakterisering af interaktionen mellem GRP78 /BiP med Bag-1.

A. Den Bag-1 familie af proteiner binder GRP78 /BiP. GST pull-down assay blev udført inkubering 5 ug af hver af GST-fusionerede Bag-1-proteiner med 400 ug 22Rv.1 cellelysat. Western blotting med et specifikt antibodiy mod GRP78 /BiP blev anvendt til at detektere binding og et anti-GST-antistof blev anvendt til at bestemme mængden af ​​bakterielt oprenset protein anvendt i assayet. B. Bag-1 og GRP78 interagere

in vivo

. GRP78 blev immunopræcipiteret med et anti-GRP78 /BiP antistof eller IgG som kontrol i 22Rv.1 celler. Western blotting med et anti-Bag-1 og anti-GRP78 antistof blev udført for at bestemme GRP78-Bag-1-interaktion. C. Bag-1 og GRP78 /BiP viser en perinukleær colokalisering. Konfokale mikroskopiske analyser blev udført i 22Rv.1 celler, der er blevet paraformaldehyd-fikseret og farvet med en pose-1-antistof til påvisning af Bag-1 (grøn kanal) og en GRP78 /BiP specifikt antistof til påvisning GRP78 /BiP (rød kanal) . Den orange farvning i fletningen af ​​de to kanaler angiver graden af ​​co-lokalisering af de to proteiner. Alle billeder (40X) blev erhvervet med Leica TCS SPE konfokalmikroskop (Leica Microsystems; Scale søjler angiver 25 pm). D. Skematisk fremstilling af domænerne i GRP78. E. Bag-1 binder sig til flere steder på GRP78. GST-pull down assay udføres inkubering 500 ug lysat af HEK-293-celler transficeret med en HA-mærkede Bag-1 og 10 ug GST-fusionerede GRP78 fuld længde og dens ATPase og substrat-bindende domæne (SBD). Western blot-analyse blev udført ved anvendelse af en HA-antistof til påvisning af Bag-1-tagget protein. Vist er en Coomassie blåt farvning af bakterielt oprensede GST proteiner til at demonstrere lige belastning af GST proteiner.

GST-pull down analyser blev udført med SBD af GRP78 /BiP og lysat af HEK293 celle udtrykker vildtype Bag-1, Bag-1ΔC47, en C-terminal deletion mutant eller Bag-1Δ68mer, en intern deletion mutant. Disse studier identificeret en intern sekvens af 68 aminosyrer som et mål for interaktionen af ​​Bag-1 med GRP78 /BiP (figur 2A og B). Sletning af denne sekvens (Bag-1Δ68mer) afskaffet interaktionen af ​​Bag-1 med GRP78 /BiP (figur 2B bane 11), mens ekspressionen af ​​68 aminosyresekvens alene viste, at det faktisk er nødvendig for at binde SBD af GRP78 /BiP ( Figur 2B bane 12). Dette fund blev yderligere bekræftet i en

in vivo

co-immunoprecipitation eksperiment, hvor en HA-mærket Bag-1 peptid udtrykt i HEK 293 celler interageret med endogen GRP78 /BiP protein (figur 2C bane 3).

A. Skematisk fremstilling af Bag-1 og de deletionsmutanter anvendt til identifikation af sekvenser, der kræves til binding af SBD af GRP78 /BiP. Afbildet i blå og rød er ubiquitin-lignende domæne og det BAG domænet henholdsvis. B. Identifikation af Bag-1-peptid-binding til GRP78 /BiP. GST-pull down assay udføres inkubering 500 ug lysater fra HEK-293-celler transficeret med de viste Bag-1-konstruktioner og 10 ug GST-GRP78 (SBD) eller GST som kontrol. Western blot-analyse med et HA-antistof til detekteres Bag-1-mutanter er vist. Coomassie blue-farvning blev udført for at demonstrere lige belastning af GST-fusionsproteiner. C. Bag-1 68 aminosyrepeptid binder

in vivo

til GRP78. HEK 293-celler blev co-transficeret med pcDNA-HA-mærkede Bag-1-peptid. De transficerede celler blev behandlet med 2 mM dithiobis (succinimidylpropionat) til at tværbinde proteinerne og cellelysaterne blev immunpræcipiteret med et anti-HA-antistof eller IgG som kontrol, efterfulgt af Western blotting med et anti-GRP78 /BiP antistof. D. Bag-1 68 aminosyrepeptid inhiberer GRP78 /BiP refoldning aktivitet.

In vivo

luciferase genfoldning blev udført i HEK-293-celler transficeret ved 70% konfluens med 2 ug β-actin-Fire Fly luciferase-konstruktion, 3 ug pcDNA3 tom vektor som kontrol eller pCMV6-GRP78 /Bip, 6 ug af det angivne pcDNA3.1-Bag-1 eller mutant konstruktioner og 0,5 ug Renilla luciferase-konstruktion til bestemmelse af transfektionseffektiviteten. De transficerede celler blev delt i to. Den ene halvdel blev efterladt ubehandlet, og den anden halvdel blev varmechok ved 45 ° C i 30 minutter. Derefter luciferaseaktivitet blev målt. Resultater er udtrykt som procent af genfoldning aktivitet i forhold til ikke-varme-chokeret celler og præsenteres som søjlediagrammer over gennemsnittet af tre uafhængige forsøg ± SEM. * P. 0,05

A. UPR modulation upon Bag-1-peptid overekspression. Puljede kloner af 22Rv.1 celler transficeret med pcDNA3.1-HA-Bag-1 68 aminosyrepeptid eller en tom ekspressionsvektor blev behandlet med 300 nM thapsigargin (TG) for de angivne tidspunkter. Cellerne blev lyseret og underkastet Western blot-analyse under anvendelse af de angivne antistoffer eller phospho-specifikke antistoffer. B. Bag-1-peptid sensibiliserer 22Rv.1 celler til ER-stress induceret apoptose. Puljede kloner af 22Rv.1 transficeret med Bag-1 peptid eller det tomme ekspressionsvektor blev behandlet med thapsigargin (TG) eller glucose-sultede (GS) i 24 timer. Cellerne blev lyseret og underkastet Western blot-analyse under anvendelse af anti-PARP og caspase 4 specifikke antistoffer. Anti-HA-antistof blev anvendt til at detektere HA-Bag-1-peptid. Anti-β-actin antistof blev anvendt til at demonstrere lige belastning af proteinprøver. C. GRP78 nedregulering øger PARP-spaltning. Puljede kloner af 22Rv.1 udtrykkende HA-mærket Bag-1-peptid eller en tom ekspressionsvektor blev transficeret med GRP78 /BiP siRNA eller kontrol GFP siRNA. Cellerne blev lyseret og Western blot blev udført med anti-PARP, anti-GRP78 og anti-HA-antistoffer. β-actin antistof blev anvendt til at bestemme niveauet af protein fyldt på gelen.

Flere undersøgelser har vist, at GRP78 /BiP samarbejder med PDI i genfoldning denaturerede proteiner

in vitro

[ ,,,0],41], [42]. For at bestemme om GRP78 /BiP også besidder evnen til at folde denaturerede proteiner

in vivo

, vi vedtaget en genfoldning assay tidligere anvendt til at bestemme chaperone aktivitet af Hsp70

in vivo

[43] I denne assay blev HEK-293-celler transficeret med et plasmid, der koder en luciferase-gen og et ekspressionsplasmid for GRP78 /BiP. Cellerne blev kortvarigt varmechok og derefter luciferaseaktiviteten af ​​de transficerede celler, der udtrykker GRP78 /BiP blev sammenlignet med den for de ikke-GRP78 /BIP udtrykkende celler. Denne undersøgelse viste, at overekspression af GRP78 /BiP signifikant forøget luciferaseaktivitet efter varmechok (figur 2D), hvilket viser evnen hos GRP78 /BiP at refolde denatureret luciferase

in vivo

. Hvis cellerne derudover blev transficeret med Bag-1 eller 68 aminosyrer Bag-1 peptid, der binder GRP78 /BiP, refoldning aktivitet af GRP78 /BiP blev reduceret til kontrolniveauet (figur 2D). Dette var ikke tilfældet, når Bag-1Δ68mer, der ikke binder GRP78 /BiP blev cotransficeret. Disse undersøgelser viser, at Bag-1 peptid interfererer med genfoldning aktivitet GRP78 /BiP. Bag-1 peptid imidlertid ikke have nogen indvirkning på den ATPase aktivitet GRP78 /BiP selvom Bag-1 forøgede denne enzymatiske aktivitet (figur S2A og S2B). Dette indikerer, at posen-1-peptid fungerer forskelligt fra den fulde længde Bag-1. Vi har derfor gået i gang med karakterisering af dette peptid som en ligand for GRP78 /BiP til fremtidig terapeutisk brug.

A. Stabile kloner af 22Rv.1 celler viser reduceret cellernes levedygtighed

in vitro

. Stabile kloner blev podet i en 96-brønds plade og celletallet i hver brønd blev estimeret ved at måle forholdet mellem bølgelængden af ​​excitation og emission 560/590 nm ved CellTiter-Blue ™ proliferationsassay. Søjlediagrammerne repræsenterer middelværdien af ​​mindst fire uafhængige forsøg ± SD (* p 0,05). B. Bestemmelse af niveauet af Bag-1 udtrykt i de 22Rv.1 kloner. Cellulære ekstrakter af 22v.1 stabile kloner blev underkastet Western blot-analyse. Et anti-HA-antistof blev anvendt til at påvise peptidet og et anti-β-actin-antistof for lige loading kontrol. C-D. Den Bag-1 peptid reducerer 22Rv.1 vækst prostata tumor celle

in vivo

. Seks uger gamle athymiske nøgne mus blev injiceret subkutant i begge flanker med 5 × 10

6 celler af hver stabil klon. Tumorstørrelse blev målt en gang om ugen under anvendelse af en skydelære og udtrykt som tumorvolumen i mm

3. Vist er (C) de tumorvolumener af kloner transficeret med tom ekspressionsvektor og (D) kloner, der udtrykker den Bag-1-peptid. Hvert punkt repræsenterer middelværdien volumen og standardafvigelse af mindst 5 til 10 tumorer. E. Xenografter af stabile kloner, der udtrykker Bag-1 peptid-show øget apoptose. Fem-um sektioner af formalinfikserede, paraffinindlejrede tumorvæv blev underkastet immunohistokemi. Kerner farves blå-lilla med hæmatoxylin mens apoptotiske celler detekteret med TUNEL-analysen er plettet brun. Repræsentative sektioner af xenografter fra hver 22Rv.1 stabil klon er erhvervet med en Axioscop mikroskop (Zeiss). V: står for tom vektor, der udtrykker klon og P:. Peptid udtrykke klon

Udnyttelse af en Bag-1 peptid at inducere apoptose og Reducer prostatakræft cellevækst

Under ER stress, udfoldet peptider ophobes i ER og GRP78 /BiP spiller en central rolle for at justere proteinfoldning kapacitet ved at aktivere tre signalveje (Perk, IRE1α, og ATF6) [44], [45]. PERK er autophosphoryleret fører til phosphorylering af alfa-underenheden af ​​eIF2 og proteinsyntese nedlukning. Phosphoryleret eIF2α selektivt øger oversættelse af transkriptionsfaktoren ATF4 der øger UPR målgenekspression såsom GRP78 /BiP [44], [45] og IRE1α også autophosphoryleret fører til aktivering af chaperone syntese via Xbp1 aktivering. ATF6 spaltes proteolytisk til at deltage i opregulering af ekspression af UPR målgener [44], [45]. Men apoptose induceres hvis homøostase ikke kan etableres [46]. Vi afgøres derfor, om binding af Bag-1 peptid til GRP78 /BiP, den nøglekomponent i ER stress, påvirker signalveje i UPR.

A. Skematisk diagram af Bag-1-peptid og dets deletionsmutanter. Ubiquitin-lignende domæne er repræsenteret i blåt og posen domæne i rødt. Tallene henviser til aminosyrepositionerne for de forskellige domæner. Aminosyreresterne er nummereret efter nummereringen for Bag-1L. B. Forudsigelse af den sekundære struktur af Bag-1-peptid, der viser en N-terminal β-hårnål fra ubiquitin-lignende domæne (blå) og et C-terminalt α-helix fra posen domæne (rød). C. normaliserede cirkulær dichroisme-spektre af posen-1-peptider. 30 pM af Bag-1-peptid blev målt i 20 mM KHPO

4 puffer, pH 6,8 (sort linie). Dens α-helix-indholdet blev vurderet til at være ca. 25% efter udfoldning af spektrene (rød linje). 12 uM af N sigt peptid (grøn linje) og 11 uM C sigt (blå linje) blev målt under de samme betingelser. D.

1 H

15N-HSQC NMR-spektret af

15N-mærket Bag-1-peptid (202-269) i 20 mm KHPO

4 buffer, pH 6,8, ved 23 ° C. Den smalle spektrale dispersion indikerer, at peptidet ikke udviser en foldet globulær struktur. H

δ og H

e sidekæde signaler af asparagin og glutamin er forbundet af tynde linier. E. Den N-terminale region af Bag-1-peptid er vigtigt for GRP78 binding. [48]. * P 0,05.