PLoS ONE: cholesterolhomeostase i to almindeligt anvendte human prostatacancer cellelinjer, LNCaP og PC-3

Abstrakt

Baggrund

For nylig har der været fornyet interesse for sammenhængen mellem kolesterol og prostatakræft. Det er tidligere blevet rapporteret, at

in vitro

, prostatacancerceller mangler sterol-medieret feedback-regulering af den større transkriptionsfaktor i cholesterol homeostase, sterol-regulatorisk element bindende protein 2 (SREBP-2). Dette kunne forklare akkumuleringen af ​​cholesterol observeret i kliniske prostatakræft. Derfor har foruroliget feedback regulering til øget sterol niveauer bliver en gennemtrængende koncept i indstillingen prostatakræft. Her har vi til formål at udforske dette nærmere.

Metodologi /vigtigste resultater

Efter at ændre den cellulære kolesterol status i LNCaP og PC-3 prostatacancerceller undersøgte vi SREBP-2 behandling, downstream virkninger på promotoraktivitet og ekspression af SREBP-2 målgener, og funktionel aktivitet (low-density lipoprotein optagelse, cholesterolsyntese). Dermed observerede vi, at LNCaP og PC-3-celler var følsom over for forhøjede sterol niveauer. I modsætning hertil sænke kolesteroltallet via statin behandling genereret en større respons i LNCaP celler end PC-3 celler. Dette fremhævede en vigtig forskel mellem disse cellelinjer: basal SREBP-2 aktivitet viste sig at være højere i PC-3 celler, reducerer følsomheden til nedsat kolesteroltal

Konklusion /Betydning

Således. prostata kræftceller er følsomme over for skiftende sterol niveauer

in vitro

, men omfanget af denne forordning varierer mellem prostatakræft cellelinjer. Disse resultater kaste nyt lys over reguleringen af ​​kolesterol metabolisme i to almindeligt anvendte prostatakræft cellelinjer, og understreger vigtigheden af ​​at etablere hvorvidt cholesterolhomeostase forstyrres i prostatakræft

in vivo

.

Henvisning: Krycer JR, Kristiana i, Brun AJ (2009) cholesterolhomeostase i to almindeligt anvendte human prostatacancer cellelinjer, LNCaP og PC-3. PLoS ONE 4 (12): e8496. doi: 10,1371 /journal.pone.0008496

Redaktør: Immo A. Hansen, New Mexico State University, USA

Modtaget: 26 oktober, 2009; Accepteret: December 3, 2009; Udgivet: December 30, 2009

Copyright: © 2009 Krycer et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. AJB forskning understøttes af en bevilling fra prostatakræft Foundation of Australia (PR36, https://www.prostate.org.au). JRK er modtageren af ​​Petre Foundation legat (https://www.petrefoundation.org.au). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

undersøgelsen af ​​cholesterolhomeostase i en prostatakræft indstilling (PCA) begyndte i 1942, da Swyer offentliggjorde

situ

fundet et højt kolesterol i benign prostatahyperplasi i forhold til normalt væv [1] . For nylig er der blevet fornyet interesse i sammenhængen mellem cholesterol og PCa [2] – [4]. For eksempel er det blevet foreslået, at en dybdegående forståelse af kolesterol regulering i PCa progression kan føre til udvikling af nye lægemiddelkandidater [5]. I tråd med dette har flere epidemiologiske studier har vist en sammenhæng mellem brugen af ​​statiner (kolesterolsænkende medicin) og nedsat risiko for avancerede PCa (gennemgået i [2] – [4]).

Kolesterol har en vigtig indflydelse på membranintegritet, signalering, og metabolisme, og der er således et behov for at regulere dets niveau inden for [2] celle. En væsentlig homeostatisk mekanisme forekommer ved det transkriptionelle niveau, via master transkriptionsfaktor: sterol-regulatorisk element bindende protein 2 (SREBP-2). Reguleringen af ​​dette transskription faktor er blevet gennemgået af Brown og Goldstein [6]. Kort beskrevet SREBP-2 syntetiseres som et forstadie, bundet til det endoplasmatiske reticulum (ER). Når kolesterolniveau er lave, er SREBP-2 transporteres fra ER til Golgi-apparatet, hvor det behandles for at frigive det N-terminale domæne. Denne modne form af SREBP-2 migrerer til kernen, hvor det opregulerer cholesterogenic gener, såsom de kodende for low-density lipoprotein receptor (LDLR) og 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzym A reduktase (HMGCR). Dette fremmer optagelsen og syntesen af ​​kolesterol indtil kolesterolniveau er tilstrækkelige, hvorefter SREBP-2 tilbageholdes i ER, forhindrer dets aktivering og dermed nedregulering målgenekspression. Denne sterol-afhængige feedback-mekanisme regulerer også SREBP-1a /c isoformer. Generelt SREBP-1c fortrinsvis opregulerer fede-syre-relaterede gener, SREBP-2 -mål kolesterol-relaterede gener og SREBP-1a kan aktivere både [7], [8].

Det er blevet foreslået, at at denne feedback regulering af SREBP-2 mangler i PCa, gennem den observation, at behandling med steroler reduceres SREBP-2 målgenekspression, samt low-density lipoprotein (LDL) -optagelse, i normale celler, men ikke i PC-3 og DU145 PCA celler

in vitro

[9]. Forstyrrelser i sterol-medieret feedback ville forklare ophobning af kolesterol i PCA prøver [10], [11], og er blevet en bredt accepteret begreb i indstillingen PCa (revideret i [3], [4]). Denne dysregulering indebærer, at PCA celler og måske kræftceller i almindelighed (f.eks [9], [12] – [15]), er et særligt tilfælde i, at de ikke er i overensstemmelse med det aktuelt holdt paradigme cellulære cholesterolhomeostase [16]. En akkumulering af cholesterol i cellen ville for eksempel stivne mitokondriemembranen, reducere oxidativ phosphorylering – dette fremmer glycolyse selv i nærvær af oxygen (Warburg effekten [17]), en metabolisk fænotype ofte hos cancerceller og af stor interesse i kræftforskningen [18].

Formålet med vores undersøgelse var at undersøge kolesterol regulering i større dybde i to almindeligt anvendte PCA cellelinjer, PC-3 og LNCaP, ved hjælp af en række betingelser og tilgange. Vi søgte at bekræfte tidligere resultater af SREBP-2 aktivitet kan være upåvirket af steroler [9], og afgøre, om dette dysregulering påvirker responset af PCA-celler til sænkede sterol niveauer. Fra vores resultater, giver vi et nyt perspektiv på cholesterolhomeostase i disse PCA cellelinjer, som har konsekvenser for både laboratorieforsøg og PCa terapi.

Resultater

sterol-medieret regulering af SREBP-2 målgener eksisterer i prostatacancerceller

for at undersøge sterol regulering af SREBP-2 i første omgang, vi analyserede mRNA ekspressionen af ​​to SREBP-2 målgener (

LDLR

,

HMGCR

) ved manipulering af kolesterol status PC-3 og LNCaP-celler. Eksperimenter blev udført under lipoprotein-deficiente tilstande (med lipoprotein-deficient føtalt kalveserum [FCLPDS]) for at forstærke effekten af ​​behandling af celler med 25-hydroxycholesterol (25-HC), et oxygeneret kolesterolderivatet (oxysterol), og LDL. LDL leverer cholesterol via LDLR, der udgør en fysiologisk alternativ til forøgelse af intracellulære sterol niveauer.

Hvis regulering af SREBP-2 er til stede, tilsætning af steroler, gennem enten 25-HC eller LDL behandling, ville reducere SREBP- 2 forarbejdning og SREBP-2 målgenekspression. På den anden side, statin compactin (også kendt som mevastatin) inhiberer HMGCR, som katalyserer et hastighedsbegrænsende trin i cholesterol-syntese, og således bør øge SREBP-2-aktivitet. De ikke-cancercelle-linjer, prostata epitelceller (Prec) og fibroblaster (FB), tjente som kontrol, hvilket viser begge former for feedback-regulering (fig. 1A). Lignende sterol-medieret regulering blev også observeret i PCA cellelinier (fig. 1A), i modsætning til tidligere resultater [9].

Celler blev behandlet med statin compactin (CPN, 5 uM), oxysterol 25 -HC (1 ug /ml), eller LDL (50 ug /ml) i 24 timer. Cellular RNA blev høstet og mRNA ekspressionen af ​​de

LDLR

HMGCR

gener blev analyseret ved QRT-PCR. MRNA-niveauer blev foretaget i forhold til køretøjet tilstand som beskrevet i Materialer og Metoder. Data er middelværdien + SEM fra 3 separate forsøg for hver cellelinje. Hvert forsøg blev udført med tredobbelte brønde pr tilstand. (A) Oplysningerne præsenteres særskilt for hver celle-line. *

s

0,05, **

s

0,01, to stikprøver

t

-test versus tilstand. (B) Data fra (A) er blevet overlejret for hvert gen, repræsenteret som middelværdi ± SEM for hver datapunkt. PCA cellelinjer er repræsenteret af ubrudte linjer, mens de ikke-PCA cellelinjer er repræsenteret af brudte linjer.

I PC-3 celler, øget cellulær sterol status med 25-HC eller LDL væsentligt reduceret lipogenisk genekspression, i sammenligning med tilstand (fig. 1A). Ligheden mellem køretøj og og compactin-behandlede PC-3-celler er usandsynligt på grund af resistens til compactin, da vi fandt, at compactin inhiberer cholesterolsyntese i PC-3-celler ved metabolisk mærkning (data ikke vist). I modsætning hertil compactin steget betydeligt lipogenisk genekspression i LNCaP-celler og sterol-behandlede LNCaP-celler havde lignende ekspressionsmønstre til vehikelbehandlede celler (Fig. 1A). Overlejring de relative mRNA udtryk data fra hver celle-linie (fig. 1 B) viste, at PCA-celler (fuldt optrukne linier) havde en reduceret respons på compactinsyre forhold til Prec celler, og blev mindre påvirket af LDL end både ikke-PCA cellelinjer . Desto mindre er disse PCA cellelinjer var begge følsomme over for ændringer i kolesterol status.

sterol-medieret regulering er specifik for SREBP-2

Eftersom ekspressionen af ​​to SREBP-2 målgener (

LDLR

,

HMGCR

) reagerede på samme måde som skiftende kolesterol status (fig. 1), søgte vi mere direkte beviser for, at denne virkning blev medieret af SREBP-2 transskription faktor.

Da modne SREBP-2 binder til sterol-regulatoriske element (SRE) inden for et målgen s promotorregion, udviklede vi et SRE-specifik luciferase assay, benytter det LDLp-588luc plasmid [19], som koder for ildflueluciferase under transkriptionel regulering af

LDLR

promotor. Anvendelse af site-directed mutagenese, vi forstyrrede SRE inden promotorområdet at generere en negativ kontrol plasmid, LDLp-mutSRE. Vi fandt, at vildtype-promotor (LDLp-588luc) udviste de forudsagte ændringer i luciferaseaktivitet (stigende med compactin behandling, faldende med 25-HC eller LDL behandling), mens mutant promotor (LDLp-mutSRE) produceret ubetydelige ændringer (Fig . S1). Mutanten promotor luciferaseaktiviteten blev subtraheret fra den for vildtype-promotoren for hver behandling betingelse for at opnå SRE-specifik aktivitet. Denne luciferaseanalyse afslørede, at feedback-regulering forekom i PCA celler som reaktion på ændrede kolesterolniveauer (Fig. 2A).

(A) Celler blev transficeret som beskrevet i Materialer og Metoder. Behandlingen omfattede statin compactin (CPN, 5 uM), oxysterol 25-HC (1 ug /ml), eller LDL (50 ug /ml) i 24 timer. SRE-specifik luciferaseaktivitet blev bestemt som beskrevet under materialer og metoder, og normaliseret til køretøjet tilstand. Vildtype og mutant promotor- værdier er vist i fig. S1. Data er middelværdien + SEM fra 3 separate forsøg for hver cellelinje. Hvert forsøg blev udført med tredobbelte brønde pr tilstand. *

s

0,05, **

s

0,01, to stikprøver

t

-test versus tilstand. (B) Data fra (A) er blevet overlejret, repræsenteret som middelværdi ± SEM for hver datapunkt. PCA cellelinjer er repræsenteret af ubrudte linjer, mens de ikke-PCA cellelinjer er repræsenteret ved stiplede linier. (C) Celler blev behandlet med CPN (5 uM) eller 25-HC (1 ug /ml) i 24 timer. Cellelysater blev underkastet SDS-PAGE og Western blottet med IgG-1C6 anti-SREBP-2-antistof. Den C-terminale spaltningsprodukt af SREBP-2, SREBP-2 (C), er mærket med en pil – vi antager, at bandet nedenfor er et ikke-specifikt bånd. Sondering for α-tubulin tjente som en intern loading kontrol. Den viste blot er repræsentative for mindst 2 separate eksperimenter for hver cellelinje.

I LNCaP-celler, SRE-specifik aktivitet (fig. 2A) syntes mere følsomme end SREBP-2 målgenekspression ( fig. 1) til sterol behandling. Følgelig overlejre data for hver cellelinje (fig. 2B) viste, at hver cellelinje blev påvirket på samme måde af sterol behandling. I modsætning hertil compactin behandling en gang vist, at PC-3 og LNCaP celler afviger i omfanget af deres homeostatiske reaktioner: SRE-specifik aktivitet blev stærkt forøget i LNCaP celler i forhold til de ikke-PCA cellelinier (stiplede linjer), i modsætning til PC-3-celler (fig. 2B). Interessant nok i Prec celler, reaktionen på compactin (fig. 2A) blev gjort stump i sammenligning med SREBP-2 målgenekspression (fig. 1A). Dette antyder, at andre transkriptionsfaktorer kan ændre virkningen af ​​SREBP-2 på målgenekspression, begrunder anvendelsen af ​​SRE-specifikke luciferase assay.

Men SREBP-1a isoform også binder til de samme SRE’er som SREBP-2 med stærk affinitet [7], potentielt confounding disse resultater. Derfor testede vi, om denne virkning var SREBP-2-specifik ved Western blotting. Da IgG-1C6 anti-SREBP-2-antistof binder til C-terminalen [20], registreres den C-terminale spaltningsprodukt, hvilket giver en indikation af SREBP-2 behandling. For eksempel ville steroler fremme fastholdelsen af ​​SREBP-2 precursor i ER [21], hvilket reducerer spaltet SREBP-2. Vi fandt, at 25-HC reducerede SREBP-2-spaltning i alle tre prostata cellelinier, mens compactin øget SREBP-2-spaltning i Prec og LNCaP-celler, men ikke i PC-3-celler (fig. 2C). Således er graden af ​​SREBP-2 behandling korreleret med reguleringen af ​​promotoraktivitet (fig. 2A, B) og SREBP-2 målgenekspression (fig. 1) observeret i disse PCA cellelinjer. Samlet disse data viser, at PC-3 og LNCaP celler er både følsomme over for steroler, men adskiller sig i deres svar på compactinsyre behandling.

Ændringer i SREBP-2 aktivitet oversætte til det funktionelle niveau i PCA celler

for at se, om transkriptionel regulering udøver homeostatiske virkning på kolesterol metabolisme i PCA celler, vi undersøgt virkningerne af at ændre sterol status på LDLR aktivitet og kolesterol syntese.

aktiviteten af ​​LDLR blev bestemt ved anvendelse af en LDL-optagelse assay . Efter inkubering med Dil-LDL (LDL mærket med det fluorescerende farvestof Dil), den efterfølgende fluorescens af cellerne tilvejebragt en indikation af LDL-optagelse. Da LDL internaliseres ved 37 ° C, men ikke 4 ° C [22], hvert eksperiment blev udført to gange samtidigt, med et sæt af celler inkuberet med Dil-LDL ved 37 ° C og den anden ved 4 ° C – forskellen i fluorescens mellem de to sæt billede et mål for internaliseret Dil-LDL. Dette også kontrolleret for ikke-specifik binding af Dil-LDL. Dette assay viste, at i forhold til den tilstand, 25-HC forårsagede et signifikant fald i DiI-LDL internalisering i alle celletyper (fig. 3A). I modsætning hertil compactin øget LDLR aktivitet i LNCaP celler kun, at have nogen signifikant effekt i Prec celler og forårsager et fald (omend ikke signifikant,

s

= 0,08) i PC-3-celler (fig. 3A).

Celler blev behandlet med statin compactin (CPN, 5 uM) eller oxysterol 25-HC (1 ug /ml) i 24 timer i medium C. (A) Celler blev fremstillet, behandlet og analyseret for DiI -LDL internalisering som beskrevet i Materialer og Metoder. Mængden af ​​Dii-LDL internaliseres giver en indikation af LDLR aktivitet. Data er præsenteret som middelværdi + SEM, fra mindst 3 separate eksperimenter for hver cellelinje. Hvert forsøg blev udført med tredobbelte brønde pr tilstand. (B) Efter behandling blev cellerne vasket med PBS og radiomærket med [1-

14C] eddikesyre i 2 timer. Radiomærkning blev udført i nærvær af behandlingen, med undtagelse af CPN behandling (i hvilket tilfælde CPN var til stede). Celler blev derefter høstet og lipid ekstrakter blev underkastet tyndtlagskromatografi og phosphorafbildning som beskrevet i Materialer og Metoder. De viste phosphorimages er repræsentative for mindst 3 separate forsøg for hver cellelinje. Densitometri blev udført, og data præsenteret som gennemsnit + SEM for hver cellelinje. *

s

0,05, **

s

. 0,01, to stikprøver

t

-test versus tilstand

For at bestemme cholesterolsyntese blev celler radiomærket efter behandling. Den 25-HC-behandling blev opretholdt under radiomærkning, mens compactin behandling fjernedes – da compactin ville reducere kolesterol syntese, vi i stedet forsøgte at simulere “statin rebound effekt ‘[23]. Dette fænomen er en homøostatisk reaktion på compactin: normalt, compactin øger SREBP-2 behandling (figur 2B.), At opregulere ekspressionen af ​​cholesterol syntetiske enzymer. Derfor ved compactin fjernes, på grund af de høje niveauer af tilstedeværende enzymer, vil der være en stor flux gennem pathway’en. Dette forårsager ironisk nok en akut stigning i kolesterolniveauer. Dette kan observeres i Prec og LNCaP-celler (fig. 3B). Imidlertid compactin forbehandling overraskende reduceret kolesterol syntese under radioaktiv mærkning i PC-3-celler (fig. 3B). På trods af dette, 25-HC afskaffet cholesterolsyntese i alle tre cellelinier (fig. 3B).

Taget sammen viser disse data, at regulering af både cholesterol optagelse (via LDL) og syntese er følsomme over for sterol niveauer i PCA celler.

Basal SREBP-2 aktivitet er højere i PC-3 celler end i LNCaP celler

Mens både PC-3 og LNCaP celle-linjer er sterol-responsive, SREBP-2 aktivitet i PC-3-celler forekom mindre følsomme for sænkede kolesterolniveauer (compactin behandling, fig. 1, 2). blev udført disse forsøg under lipoprotein-deficient betingelser (Medium C), mens en to gange stigning i SRE-specifik aktivitet blev observeret med compactin behandling (i forhold til behandlingen køretøjet) under fuld serum betingelser (fig. 4). Dette antyder, at i PC-3 celler, er det compactin effekt maskeret af ‘mætning “af SREBP-2 behandling i lipoprotein-mangel medier, således at yderligere kolesterol afsavn via compactin behandling ville have ringe effekt. Dette indebærer endvidere, at PC-3-celler ikke ufølsomme over for compactin

per se

, men kræver mindre sterol deprivation at maksimere SREBP-2-aktivitet i forhold til andre cellelinier, herunder LNCaP-celler.

PC-3-celler blev transficeret som beskrevet i Materialer og Metoder. Behandlingen omfattede statin compactin (CPN, 5 uM) eller oxysterol 25-HC (1 ug /ml) i 24 timer, i enten fuld-serum (medium A) eller lipoprotein-deficient serum (Medium C). SRE-specifik luciferaseaktivitet blev bestemt som beskrevet under materialer og metoder, og normaliseret til køretøjet tilstand. Dataene er middelværdien + SD, repræsentant for 2 separate eksperimenter. Hvert forsøg blev udført med tre fordybninger pr tilstand.

Denne vigtige forskel mellem LNCaP og PC-3 celler blev undersøgt yderligere. Som sag studie blev baseline regulering og aktivitet af LDLR betragtes under lipoprotein-mangel tilstande, fra forsøg, der er beskrevet i figurerne 1-3. For det første blev mRNA-ekspression data overvejet: Den ΔC

t-værdier for en tærskel på 10

-1.5 normaliserede fluorescensenheder blev sammenlignet mellem PC-3 og LNCaP celler. De C

t-værdier for husholdning gen, porphobilinogendeaminase (

PBGD

), var ens mellem de to cellelinjer (

s

≈0.73), begrunder denne sammenligning. Den gennemsnitlige

LDLR

ΔC

t-værdi var ca. 2 enheder lavere i PC-3 celler, hvilket indikerer en 4 gange højere basal

LDLR

mRNA udtryk end LNCaP celler (Fig. 5A) . Efterfølgende basal LDLR aktivitet var også signifikant højere i PC-3-celler (fig. 5B).

Data blev samlet fra forsøg hvor LNCaP og PC-3-celler fik vehikel behandling i medium C i 24 timer. (A) For hver QRT-PCR eksperiment, den ΔC

t-værdier (for tærskel = 10

-1.5 normaliserede fluorescensenheder) for

LDLR

gen, i forhold til det

PBGD

housekeeping-gen, blev overvejet. Ekspression er repræsenteret som en fold ændring (i forhold til PC-3-celler), hvorved en én-enhed stigning i ΔC

t resulterer i en to gange formindskelse i mRNA-ekspression. Data er præsenteret som middelværdi + SEM, fra mindst 4 separate forsøg for hver cellelinje. (B) Rå LDL-optagelse, målt som fluorescens normaliseret ved proteinindholdet i LDL optagelsen analysen, blev i gennemsnit mellem eksperimenter og gjort i forhold til PC-3 celler. Data er præsenteret som middelværdi + SEM, fra mindst 3 separate eksperimenter for hver cellelinje. (C) For hver SRE-specifik luciferaseanalyse, ildflue /

Renilla

luciferase nøgletal genereret fra LDLp-mutSRE plasmid blev normaliseret til den for LDLp-588luc plasmid. Data præsenteret som middelværdi + SEM, fra mindst 5 separate forsøg for hver cellelinje. Hvert forsøg i (A) – (C) blev udført med tredobbelte brønde pr tilstand. *

s

0,05, **

s

0,01, to stikprøver

t

-test versus PC-3 celler. (D) En model afbilder forskellene i cholesterolhomeostase mellem PC-3 og LNCaP-celler. Tærskelniveauet for cellulær cholesterol, hvor SREBP-2-aktivitet bliver dramatisk reduceret, kan være højere i PC-3-celler. Dette vil reducere effekten af ​​statiner, i forhold til det basale tilstand.

Sammen med fig. 2C, indebærer dette, at basal SREBP-2-aktivitet er højere i PC-3-celler. Imidlertid kan andre transkriptionsfaktorer også bidrage til ekspressionen af ​​SREBP-2 målgener. Derfor blev re-analyseret tidligere SRE-specifikke luciferase eksperimenter. For tilstand, den relative luciferaseaktivitet genereret af LDLp-mutSRE (muteret SRE i

LDLR

promotor) blev betragtet som en del af den, LDLp-588luc (vildtype

LDLR

promotor) . Den mutSRE-Fluc luciferaseaktivitet blev antaget at repræsentere ikke-SRE aktivitet, da compactin og 25-HC behandling havde lille indvirkning på LDLp-mutSRE aktivitet i alle cellelinjer (fig. S1). Den mutSRE-Fluc /LDLR-Fluc andel var højere i PC-3 celler end LNCaP-celler (fig. 5C), hvilket indebærer andre transkriptionsfaktorer kan også bidrage til forskelle i

LDLR

mRNA-ekspression observeret mellem disse celle- linjer (fig. 5A). Taget sammen antyder disse data, at basale aktivitet nedstrøms for SREBP-2 opreguleres i PC-3-celler, hvilket resulterer i en maksimal reaktion under basale betingelser.

Discussion

I denne undersøgelse har vi søgt at få indsigt i cellulære cholesterolhomeostase i indstillingen PCa. En afvigende tilbagemelding-reaktion på steroler synes at være et almindeligt fænomen i cancerceller [9], [12] – [15] og ville forklare akkumuleringen af ​​cholesterol i klinisk PCa [10], [11]. Vores resultater antyder, at sterol-regulerede forarbejdning af SREBP-2 findes i PCA-celler (fig. 2C). Følgelig sterol feedback regulering havde downstream virkninger på det SRE (fig. 2B), om ekspression af SREBP-2 målgener (fig. 1B), og på det funktionelle plan (fig. 3). Vi overvejede også svaret af disse celler til reducerede sterol niveauer, finde, at PC-3 og LNCaP celler afveg i deres grader af regulering (fig. 5).

I PC-3 celler, steroler forårsagede et signifikant fald i SREBP-2 aktivitet i strid med tidligere resultater [9]. Udover metodiske overvejelser, såsom kvantitative versus semi-kvantitative metoder mRNA bestemmelse, kan andre faktorer tegner sig for uoverensstemmelsen med deres resultater. For eksempel er det blevet vist, at colon-adenocarcinomceller påvirkedes ikke af steroler ved højere densiteter, men demonstrerede feedback regulering når udpladet ved lavere densiteter [14]. Celler på lavere tætheder er eksponentielt voksende, med højere kolesterol optagelses- og syntese satser findes i både kræft og normale celler [14], [24]. Dette kan gøre det muligt for at forene resultaterne her med dem af den tidligere undersøgelse [9], især fordi deres eksperimenter blev kørt i en længere varighed (30 og 45 h, versus 24 timer her). Vi belagte PC-3-celler ved lav densitet, for at forhindre overconfluence ved 48 h, og fundet følsomhed over for steroler op til 48 timer (fig. S2).

Tilsvarende blev fundet steroler at reducere SREBP-2-aktivitet i LNCaP-celler (fig. 2). Her var der et mindre fald i SREBP-2 målgenekspression (fig. 1), mens cholesterol optagelse og syntese blev afskaffet (fig. 3). Dette understøttes af en forudgående konstatering steroler nedreguleret ekspression af HMG-CoA-syntase, et andet SREBP-2-målet, i LNCaP-celler [25]. Derfor PCA-celler er faktisk følsomme over for øgede sterol niveauer. Dette ophæver ikke tanken om forstyrret sterol-feedback PCA celler, men snarere rejser flere spørgsmål: gøre laboratorium PCA cellelinjer ophobes kolesterol som det ses i klinisk PCa [10], [11]? Ville PCA celler være mindre følsomme over for steroler i en

in vivo

sammenhæng, såsom i xenotransplantater? Det er klart, det berettiger yderligere undersøgelse.

Vi undersøgte også den modsatte situation, hvilket reducerer kolesterol niveauer ved hjælp af statin compactin. I lighed med Prec celler, denne øgede SREBP-2-aktivitet (fig. 2), forbedret SREBP-2 målgenekspression (fig. 1), og inducerede en statin-rebound effekt i cholesterolsyntese (fig. 3B) i LNCaP-celler. Interessant havde compactin ikke påvirke LDLR aktivitet i Prec celler (Fig. 3A), mens det er blevet foreslået, at statiner reducere blodets-kolesterolniveauer ved forøgelse LDLR-ekspression (som ses her i fig. 1A) og således LDL-optagelse [26]. Dette tilsyneladende paradoks kan forklares siden PCSK9 (proprotein convertase subtilisin /Kexin typen 9), en anden SREBP-2-målet, har vist sig at fremme LDLR nedbrydning, hvilket begrænser effektiviteten af ​​statiner [27], [28]. LNCaP celler synes at omgå denne reguleringsmekanisme (fig. 3A), hvilket viser øget LDLR aktivitet på compactin behandling. Samlet viser dette, at LNCaP-celler reagerer på lave sterol niveauer.

I modsætning hertil compactin ikke forårsage en signifikant stigning i SREBP-2 målgenekspression (fig. 1) i PC-3-celler, i forhold til tilstand. Compactin blev bekræftet at inhibere cholesterolsyntese ved metabolisk mærkning. Derfor manglen på compactin effekt skyldes sandsynligvis næsten maksimal SREBP-2 behandling fra inkubation i lipoprotein-deficiente medier (fig. 4). Støtte dette, de basale niveauer af forarbejdet SREBP-2 synes at være højest i PC-3-celler (fig. 2C), og basal LDLR-ekspression og aktivitet var højere i PC-3 end LNCaP-celler (fig. 5A, B). Således PC-3-celler kræver mindre sterol deprivation for at påberåbe sig en maksimal reaktion fra SREBP-2 reaktionsvejen. Endvidere compactin behandling tendens til at reducere LDLR-aktivitet (fig. 3A) og forbehandling sænket cholesterolsyntese (fig. 3B) af grunde, der i øjeblikket uklare.

Derfor PC-3 og LNCaP-celler varierer i deres kolesterol homøostase. Radhakrishnan

et al.

[29] foreslå en “switch-lignende kontrol” af SREBP-2-aktivitet, hvorved et kraftigt fald i SREBP-2 behandling opstår, når intracellulært (ER-) kolesterolniveau nå en præcis tærskel. Vi foreslår, at dette “regulatoriske gauge” er højere i PC-3-celler (fig. 4d), der tegner sig for en) PC-3 celler med højere basal SREBP-2 end LNCaP celler, 2) statiner vises at have ringe effekt på PC 3 celler (i forhold til den basale tilstand), og 3) steroler reducerer SREBP-2 aktivitet i både PCA cellelinjer.

Denne forskel i kolesterol regulering kan henføres til andre fænotypiske forskelle mellem disse cellelinjer, såsom androgen reaktionsevne. LNCaP-celler er androgen-sensitive [30], mens PC-3-celler er relativt androgen-uafhængig [31]. Androgener er blevet vist at opregulere SCAP ekspression, der stiger SREBP-2-aktivering [32]. Da manglende feedback-regulering tidligere var observeret i androgen-uafhængige PCA cellelinjer (PC-3, DU145) [9], er det blevet fremført, at forstyrret sterol tilbagemeldinger kan være forbundet med androgen deprivation fordi SREBP-2 blev opreguleret i LNCaP implanteret

in vivo

på host kastration [33]. Men det kan ikke forenes med vores resultater, da PC-3 celler viste sig at være sterol-følsom her. Ikke desto mindre kan en faktor involveret i androgenuafhængighed favorisere PC-3 celler, potentielt hæve baseline SREBP-2 aktivitet. Alternativt kan andre transkriptionsfaktorer bidrage til SREBP-2 målgenekspression (fig. 5C), såsom oncostatin M binding til SIRE (sterol-uafhængig responselement) inden for

LDLR

promotor [34], forstærke basal kolesterol metabolisme i PC-3 celler. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at afgrænse de præcise mekanismer, hvormed cholesterolhomeostase adskiller i disse PCA cellelinier – i lyset af dette, har en nylig papir rapporterede forskelle i transskriptionsprofilen mellem LNCaP og PC-3-celler [35], om end ikke direkte relateret til cholesterolhomeostase.

derfor vores resultater støtter påstanden om, at disse to cellelinjer ikke kan behandles som synonyme eksempler på PCA cellelinjer for

in vitro

undersøgelser [35], [ ,,,0],36]. Men det er svært at relatere disse resultater til en klinisk indstilling, fordi, at vores bedste viden, har ingen undersøgelser undersøgt sterol-medieret regulering af SREBP-2 og kolesterol metabolisme i celler isoleret fra prostata prøver. Derudover har der været modstridende rapporter om ekspressionen profilen af ​​PCa i en sterol-relateret kontekst. For eksempel i Nylige undersøgelser af ændrede profil med progression til den metastatiske, hormonresistent tilstand: nogle undersøgelser fundet en stigning i ekspressionen af ​​SREBP-2 [37] og sterol biosyntetiske [38] gener, mens en anden fandt et fald [ ,,,0],39]. Sådanne konflikter kan skyldes forskelle i patientpopulationer, prøve præparater eller microarray platforme (anmeldt i [40]).

Ikke desto mindre er det blevet fremført, at LNCaP celler er mere karakteristisk for klinisk PCa end PC-3 celler [41], [42]. Derfor kan resultaterne her har kliniske forgreninger: navnlig LNCaP-celler har højere LDLR aktivitet som respons på compactinsyre behandling. Dette antyder, at behandling med et kolesterolsænkende lægemiddel (såsom et statin) kan inducere LDL-optagelse specifikt i PCA-celler. Dette indebærer, at samtidig administration af disse tumor-specifikke kemoterapeutiske stoffer, inkorporeret i LDL eller andre LDLR-bindende vesikler [43], [44], kan give en potentiel mulighed for PCa behandling.

Materialer og metoder

Materialer

Ikke-kræft humane Prec celler blev opnået fra Lonza (Mt Waverley, Vic, AU), humane forhud FB celler en gave fra Dr. Ingrid Gelissen (University of New South Wales, AU)