PLoS ONE: Systematisk nyorientering Screening i xenograftmodeller Identificerer godkendte lægemidler med Novel Anti-Cancer Activity

Abstrakt

Godkendte lægemidler rettet mod ca. 400 forskellige virkningsmekanismer, hvoraf så få som 60 der i øjeblikket anvendes som anti-behandlinger mod kræft. I betragtning af at det i gennemsnit tager 10-15 år for en ny cancer terapeutisk skal godkendes, og den seneste succes for narkotika nyorientering for stoffer såsom thalidomid, vi hypotese, at effektive, sikre kræftbehandling kan findes ved at teste godkendte lægemidler i ny terapeutisk indstillinger. Her rapporterer vi

in vivo

afprøvning af en bred sammensatte samling i kræft xenograftmodeller. Brug af 182 forbindelser, der er målrettet 125 unikke mål mekanismer, vi identificeret 3 lægemidler, der viste reproducerbar aktivitet i kombination med kemoterapeutiske temozolomid. Lægemiddelkandidater synes effektiv til ækvivalenter dosis, der overstiger de skrevne recepter, hvilket tyder på, at der er behov for yderligere prækliniske indsats før disse stoffer kan testes for effekt i kliniske forsøg. I alt foreslår vi drug nyorientering er en forholdsvis ressourcekrævende metode, der kan identificere godkendte lægemidler med en snæver margin af anti-cancer aktivitet

Henvisning:. Roix JJ, Harrison SD, Rainbolt EA, Meshaw KR, McMurry AS, Cheung P, et al. (2014) Systematisk nyorientering Screening i xenograftmodeller Identificerer godkendte lægemidler med Novel Anti-Cancer aktivitet. PLoS ONE 9 (8): e101708. doi: 10,1371 /journal.pone.0101708

Redaktør: Felipe Prosper, Clinica Universidad de Navarra, Spanien

Modtaget: November 19, 2013; Accepteret: 10 juni 2014; Udgivet: August 5, 2014

Copyright: © 2014 Roix et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Alle undersøgelser blev sponsoreret og finansieret af Biomed Valley opdagelser, Inc. de finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. JJR, PS og SS er medarbejdere i BioMed Valley Discoveries, Incorporated, der søger at opdage og kommercielt udvikle nye lægemidler og diagnostiske for sygdom. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

På trods af enorme forskningsindsats, en ud af fire amerikanere vil dø som følge af kræft. Den søgen efter at identificere nye behandlinger for kræft har ansporet talrige, brede innovationer inden for biomedicinsk forskning, og kræftbehandling er på forkant med molekylær medicin, hvor skræddersyede diagnostik og lægemidler bruges til præcist at målrette det genetiske grundlag for kræft [1]. Alligevel eksisterer uenighed om, hvorvidt den indsats og udgifter til kræftforskning og pleje virkelig har resulteret i tilstrækkelige samfundsmæssige fordele; det er uklart, hvornår og hvordan en sejr i krigen mod kræft kan erklæres [2] – [4].

Det er blevet foreslået, at nye lægemidler for mange sygdomme, herunder kræft kan findes ved at udnytte medicin, der er der allerede er godkendt til brug. [5] Flere fortilfælde for sammensatte “nyorientering” eksisterer, og det forventes, at de forskellige farmakologi målrettet af godkendte medicin kan have ukendte, uventede anvendelighed i sygdomme end etiketten indikationer, for hvilke disse lægemidler er i øjeblikket ordineret. Da mange godkendte lægemidler har en veletableret tradition for sikker dosering i brede befolkningsgrupper, roman Andet formål indikationer kan sandsynligvis hurtigt blive afprøvet direkte i mennesker, uden behov for omfattende foreløbige sikkerhedsvurderinger.

I betragtning af denne potentielle værdi, testede vi en bred samling af godkendte lægemidler doseret i kombination med kemoterapi i muse xenograft kræftmodeller. Mens vores uvildig screening og validering strategi identificeret godkendte lægemidler med kombinationskemoterapi potentiale, ville yderligere mekanistiske og regulatoriske undersøgelser sandsynligvis være påkrævet, før disse stoffer kunne vurderes i kliniske forsøg.

Materialer og metoder

Animal xenografundersøgelser

9 uger gammel kvinde athymiske nøgne mus (CRL: NU (Ncr) –

Foxn1nu

, Charles River) fastholdt på standard lys cyklus og fodret

ad libitum

vand og NIH 31 kost blev anvendt til undersøgelserne. Tumorxenografter blev indledt ved implantation af 1 mm

3 tumor fragmenter fra kilden xenograftvæv vedligeholdes af seriel transplantation. Tumorvækst blev overvåget som den gennemsnitlige størrelse nærmede målsætningen på 80 til 120 mm

3, og dyrene blev derefter efterfølgende randomiseret til behandling kohorter. Tumorer blev målt i to dimensioner ved hjælp af skydelære, og volumen blev beregnet ved hjælp af standard formler.

Temozolomid blev administreret oralt, én gang dagligt i de første fem dage af undersøgelsen. Kombinationsbehandlinger blev administreret en gang dagligt ved hjælp af angivne rute og formulering; . Eksperimentelle lægemidler blev doseret både under og efter temozolomid administration til at identificere overfølsomhedsreaktioner fra både samtidig og opfølgende eksponering

Alle dyrehold, behandlinger og dyrlægebehandling blev udført af uddannet personlig i AAALAC-akkrediterede faciliteter; protokoller og undersøgelse adfærd var underlagt IACUC gennemgang og godkendelse på Charles River.

statistiske metoder, Screening Power Skøn

For at indfange tidsforløbet data xenografundersøgelser, vi ansat log-rank Mantel -COX overlevelse analyse, hvor overlevelse cutoff blev defineret af fremkomsten af ​​en bestemt tumor byrde på studiet. Efter analyser af pilotundersøgelser, vi konstateret, at en 500 mm

3 tumor volumen cutoff fanges på passende vis de terapeutiske virkninger af øget temozolomid dosis. Log-rank chi-square blev brugt til at beregne og indberette signifikans test; effektstørrelser er rapporteret som Mantel-Haenzel hazard ratio, hvor et beskyttende forhold afspejler evnen for den eksperimentelle behandling for at forsinke eller forhindre tumorprogression ud over 500 mm

3. Som omtalt i resultater, at vælge cut-offs større end denne tærskel ikke markant indflydelse resultater. 1000 mm

3 var noget mere variabel, med systematiske påvirker effekter på statistisk præcision inden for og på tværs af grupperne; vækst på 500 mm

3 syntes mere homogen.

For screening, typisk 10 dyr blev tildelt til at modtage 5 mg /kg temozolomid monoterapi, mens de hyppigst 5 dyr blev tildelt til kombinationsbehandling. Power beregninger angivet dette studie design var tilstrækkelig til at skelne en 2,6-fold reduktion i overlevelse hazard-rate med 80% effekt ved et signifikansniveau på 0,05 (afledt bruger formlen i: https://www.cct.cuhk.edu. hk /stat /overlevelse /Rubinstein1981.htm). Som omtalt nedenfor, den praktiske virkning af at afdække effekt størrelser af denne størrelsesorden gav observationer, hvor den eksperimentelle kombination forudsat tilføjet effekt svarende til en 2-fold stigning i dosis af temozolomid. I et andet lys, ville vores kraftoverførsel tilgang typisk give følgende: mens alle 10 dyr behandlet med temozolomid monoterapi nåede tumor byrder over 500 mm

3 inden for 15 dage, kunne betydelige skærm hits identificeres, når der ikke mere end 1 af 5 dyr kombinationen kohorten havde en tumor byrde mere end 500 mm

3 efter 30 dages behandling og opfølgning.

nyorientering Bibliotek

en kandidat liste over godkendte lægemidler blev indsamlet fra DrugBank [ ,,,0],6], den terapeutiske mål Database [7], og Merck Manual af diagnose og behandling. Efter vurdering af omkostninger og tilgængelighed, blev gram skala sammensatte lagre midler fra flere leverandører. Dosis formuleringer og ruter passende for kronisk dosering blev identificeret ved litteratursøgning. Drug mål og mekanismer blev forespurgt mod den seneste udgave af det terapeutiske mål Database. Til dato, TTD kategoriserer 364 mål som “vellykket”, der er blevet ramt af godkendte lægemidler. Vores eksperimentelle sæt blev kortlagt til 124 succesfulde mål eller ca. 35% dækning. Vores dækning estimat er konservativt, da vi ignoreret de en-til-mange relationer til lægemidler, mappet til flere mål; flere mål af noget lægemiddel var ikke tælles dobbelt, hvis mindst en af ​​et lægemiddels flere mål blev redundant rettet af et andet lægemiddel.

Temozolomid /Candesartan PK Interaktion Study

Radio-isotop-mærket temozolomid ( 4-methyl-

14C-5-oxo-2,3,4,6,8-pentazabicyclo [4,3,0] nona-2,7,9-triene- 9-carboxamid) blev syntetiseret (Moravek), således at scintillationstælling kunne vurdere følgende: intakt forbindelse; aktive metabolitter; samt kovalente addukter vides at danne efter reaktiv metabolisme af temozolomid i målvæv [8]

Dosis interaktions forsøg blev udført hos kvindelige nøgne mus med U87MG tumor fragment xenotransplantater, som beskrevet ovenfor.; dyr havde tumor byrde af ~400 mm

3 på tidspunktet for dosering. Mus blev indgivet enten vehikel eller candesartan i.p. for én dag forud kombination dosering med C14-temozolomid. På den næste dag blev en 5 mg /kg dosis af C14-temozolomid administreres oralt enten alene eller umiddelbart efter en dosis på 10 mg /kg candesartan ved i.p. administration.

På tidspunkter angivet, blev væv, der indsamles og vurderes til radio-isotop fordelingen af ​​standard scintillography metoder.

Kombination tolerabilitet studium

8-10 uger gamle, raske mandlige C57BL /6J mus blev indgivet enten temozolomid alene ved 25 mg /kg, eller sammen med kombination stoffer på de angivne ruter og dosisniveauer. Efter seks dages kombination dosering blev temozolomid administration afbrudt, mens kombinationen agenter blev administreret i yderligere 4 dage. Dyrene blev aflivet på de angivne tidspunkter, og blodprøver blev analyseret for komplet blodtælling parametre ved hjælp af standard hæmatologiske metoder.

Dose Range respons Studie Background Information

ordinationer etiketter blev brugt til at lede dosis udvælgelse til dosis-range respons studier

for risedronat (mærkenavn: Optinate [9])., blev ikke-kliniske 80-ugers carcionogenicity undersøgelser udført på mus ved 32 mg /kg /dag. Brug af organ-overfladeareal normalisering, etiketten anslår dette er den dosis ækvivalent af 6,5 gange den maksimalt anbefalede daglige dosis til mennesker (30 mg /dag), som er indiceret til brug ved Pagets sygdom. Derfor screeningen og top dosis-range finding-niveau i vores mus eksperimenter af 7,5 mg /kg /dag er kun lidt over den maksimale anbefalede humane daglige dosis (MHRD), baseret på kroppens overfladeareal normalisering. Den laveste muse testede dosis, 1,5 mg /kg /dag, er stort set svarer til den nedre humane daglige dosis (5 mg /dag), der er anbefaler i osteoporoseterapi

I candesartan (varenavn:. Atacand [10 ]), ikke-kliniske 104 carcinogenicitetsstudier i mus blev udført ved 100 mg /kg /dag. Den Atacand label vurderer, at denne dosis fremkaldte systemisk eksponering hos mus (på AUC-basis), der var ca. 7 gange disse opnås hos mennesker efter administration af MHRD, 32 mg /dag. Derfor screeningen og top dosis-range finding-niveau i vores mus eksperimenter af 10 mg /kg /dag var sandsynligvis over MHRD, på et grundlag, AUC-normaliseret eksponering, især givet vores indledende dosering ved i.p., snarere end p.o. rute. Mus eksperimenter ved 2,5 mg /kg /dag p.o. bør være stort set afspejler den lave dosis post indiceret til anvendelse hos hypertensive voksne (8 mg /dag)

For terbinafin. (mærkenavn: Lamisil [11]), 28 måneders rotte karcinogenicitet blev udført ved 69 mg /kg /dag; denne dosis angives at være 2 gange MHRD, baseret på sammenligninger AUC eksponering. Vores screening og dosis-range studier i mus brugt i.p. administration, hvilket tyder 50 mg kg /dag dosis /ad denne vej sandsynligvis et godt stykke over MHRD ækvivalent, idet drug displays beskedne biotilgængelighed på tværs af arter [12], [13]. Til støtte for dette blev 50 mg /kg doser hos mus tidligere vist at fremkalde peak systemiske koncentrationer af størrelsesordenen 1 ug /ml [14], hvilket svarer til Cmax observeret hos mennesker efter en 250 mg dosis. Vi har ikke forfølge en oral dosis-forprøve i vores musemodeller, givet de fattige reaktioner observeret følgende dosistitrering ved i.p. rute.

Resultater

Vi har designet en iscenesat forsøgsprøvning strategi for at screene, bekræfte og validere godkendte lægemidler, der kan have potentiel aktivitet som kombination kemoterapeutiske stoffer (figur 1A). Først forsøgte vi en relativt hurtig primære effekt skærmen ved hjælp lave antal dyr (typisk 10 kontrol og 5 forsøgsdyr pr kombination), afprøvning hver forbindelse ved et enkelt dosisniveau. Lovende hits fra den primære screening blev re-testet på samme model til at vurdere reproducerbarheden. Reproducerbare hits blev næste testet i to yderligere xenograftmodeller at teste, om resultaterne var generaliseres. Adskillige forbindelser blev testet i dosis-respons undersøgelser, såvel som yderligere pilotundersøgelser formål at karakterisere den mulige mekanistiske aktivitet bag hvert hit. I sidste ende blev vores test skema (figur 1A) designet til at identificere forbindelser, der demonstrerede reproducerbar, robust farmakologi værdig hurtig oversættelse til kliniske omgivelser.

A. Eksperimentel afprøvning tragt. Godkendte lægemidler blev identificeret og re-bekræftet i en screening model. Hits blev yderligere testet komplementære modeller, og kendetegnet ved pilot farmakologiske undersøgelser. B. U87-MG Screening Model Design og karakterisering. I dosis range finding eksperimenter, dosisniveauet på 5 mg /kg af temozolomid blev valgt som delvis effektive dosis, der anvendes i efterfølgende kombinationsstudier. C. Oversigt over primære screening. De hazard ratio for godkendte lægemidler i overlevelse analyse (500 mm

3 tumor byrde cutoff) afsættes af rang. To-sidet tillid estimater er vist, med betydelige hits (N = 12, tabel 1) fremhævet med rødt. D. Hit rate analyse. Eksperimentelt observerede overlevelse analyse effekt størrelser (q) er afbildet mod chi-square fordeling; Den Kolmogorov-Smirnov statistik bekræfter null, at hver stamme fra den samme underliggende fordeling.

Vi har etableret et modelsystem og sammensatte samling at overskue en bred vifte af farmakologi i en klinisk relevant indstilling. Vi fokuserede på glioblastom som en sygdom indstilling med stort udækket behandlingsbehov. Vores primære screening blev udført i U87-MG glioblastom-afledte humane cancercellelinie; xenotransplantater af denne linje blev udviklet ved anvendelse tumorfragment seriel passage metoder. Vi bekræftede denne model var lydhøre over for en standard-of-care kemoterapeutiske for glioblastom; det alkylerende stof temozolomid fremkaldte komplette tumorrespons i et flertal af dyr i en dosis på 100 mg /kg. Baseret på farmakologiske undersøgelser forudgående, vi bemærke U87-MG model synes relativt behandling-resistent: eksponeringer opnået nær komplet respons dosis (AUC

0-inf ~125 ug * t /ml, data ikke vist) sandsynligvis overskredet dem, der opnås i mennesker, når følgende standard dosering retningslinjer (AUC

0-inf -20 ug * t /ml).

Vi samlet en forskelligartet sammensatte samling for at teste de fleste af farmakologiske mekanismer målrettet med nuværende godkendte lægemidler. De cirka 1200 ordineret medicin målrette sandsynligvis ikke mere end 300 unikke farmakologiske mekanismer [15], [16] -vi estimere vores valgte bibliotek af 182 forbindelser sammenfatter ca. 35% procent af farmakologi målrettet af den menneskelige farmakopé (metoder). På et praktisk grundlag, vi påberåbt offentliggjort litteratur til at hjælpe valgte dosisniveauer og narkotika formuleringer. Afgørende, blev dosering niveauer og administrationsveje valgt for at få narkotika eksponeringer i nærheden af ​​eller over dem, der opnås ved hjælp af doser, der er maksimalt tolereres i mennesker (tabel S1 i File S1). Kort sagt, vi fulgte en “grådig” strategi, der først undersøgt overnationale farmakologiske virkninger i screening-mode, efterfulgt af hit validering ved eksponeringer nærmere situationen i daglig klinisk brug.

Flere bemærkelsesværdige fund kunne observeres under vores primære virkningsfuldhed skærmen på 182 forbindelsen angivet i U87-MG model (figur 1C, tabel S1 i File S1). Først ved hjælp af eksperimentelle metoder, der var teknisk muligt og rimeligt ressource-effektiv, kunne vi konstatere, at temozolomid og godkendte lægemidler viste kombination effekt i løbet af relativt high-throughput screening. Tolv primære hits blev identificeret som forsinkede den nødvendige tid til at opnå håndgribelig tumor byrde i behandlede dyr (tabel 1). Disse hits udstillet effekt i kombination med temozolomid bredt sammenlignelig med, hvad der kunne opnås ved at fordoble den terapeutiske dosis af temozolomid (figur 1C, Methods). Resultaterne var reproducerbare: i 10 ud af 11 forsøg, et højaktivt dosis temozolomid (100 mg /kg) var stærkt signifikant forskellig fra den moderate dosis (5 mg /kg) anvendt i kombination tests, og udviste beskeden statistisk diskrimination i de resterende forsøg (data ikke vist). Opmuntrende, de kendte kemoterapeutika docetaxel og etoposid viste virkningsfuldhed i kombination med temozolomid (tabel 1). Også, den samlede primære hitrate (6,6%), ikke synes alt for højt, hvilket kunne tyde på uegnede virkninger som følge af eksperimentel variabilitet. Samtidig, hitraten optrådte tilstrækkeligt forskellige fra nul, tyder vores tilgang kunne skelne hits uden at være for restriktiv. På balance, vores primære nyorientering skærm bekræfter en rimeligt forudsigelig forventning: samlet, behøver godkendt medicin ikke fremkalde anti-cancer effekt, mens en beskeden samling af lægemidler kan udvise nyttige farmakologi i kombination med standard kemoterapi (Figur 1D)

Vi udførte bekræftelse studier for 33 narkotika fra den primære screening, som ikke var kendt kemoterapeutika (figur S1). Otte af elleve (73%) kandidater, som udviste statistisk signifikans i den primære screening blev bekræftet i en anden test. Vi forespørges også 22 yderligere stoffer, der ikke udviste betydning i første omgang. Som forventet, færre (3 af 22, 14%) af disse midler viste virkning i sekundær screening, hvis de var negative i den primære screening, hvilket tyder en anden grad af validering for vores eksperimentelle tilgang. Som et yderligere bekræftende skridt, vi doseret otte af de primære hits i fravær af temozolomid (fig S1). Som det kan forventes, ingen af ​​disse sikre lægemidler viste primære anti-cancer effekt, hvilket igen antyder, at vores skærm afslørede nye lægemidler med potentielle antitumorvirkninger kun i baggrunden af ​​standard kemoterapi.

Vi valideret yderligere 15 bekræftede hits i to yderligere xenograftmodeller: den A375 melanom og SF295 glioblastom human cancer linjer (supplerende Metoder, figur 2). Seks medikamenter viste aktivitet i en af ​​disse ortogonale modeller ved dosering i kombination med temozolomid. Sammenfattende ser vores screening strategi for at have opdaget flere lægemidler, der udviser

bona fide

aktivitet med alkyleringsmidlet temozolomid på tværs af flere tumortyper.

A. Hit validering i yderligere modeller. Udvalgte primære screening hits blev testet i kombination med sub-effektive doser af temozolomid i en model af glioblastom og melanom xenograftmodeller. For at vurdere farmakologiske virkninger terbinafin blev doseret p.o i A375 model ved en dosis interval fem gange større end sin screening dosis indgivet ved i.p. rute. I primære skærm sammenligninger, risedronat var signifikant ved overlevelse analyse på en cut-off på 1000 mm

3, men ikke 500 mm

3. B. Hypertension lægemiddelkombinationer. Lægemidler blev doseret i kombination i U87-MG model i en dosis i den primære screening, eller som angivet i supplerende materiale. Virkninger på tumorvækst blev vurderet på dag 20 af undersøgelsen. Midler plus SEM vist (N = 10); candesartan og temozolomid 100 mg /kg signifikant af M-ANOVA på p. 0,05

Forudsat med en vis grad af tillid, vi søgte at yderligere at karakterisere vores resulterende hits. På grund af sin unbiased, empiriske natur, skal vores skærm afsløre anti-cancer virkninger forårsaget af en mangfoldighed af faktorer. Første, kombination narkotika kunne modulere iboende aktivitet af temozolomid, ved at påvirke enten sin primære aktivitet af DNA alkalation, eller ved at ændre deraf følgende DNA skader reaktioner herunder cellecyklusstop og apoptose. Ligeledes temozolomid og induceret DNA alkylering kunne i en neomorphic mode, Konverter signalering induceret af en kombination lægemiddel i hidtil ukendte vækst- celle eller celleoverlevelsessignaler. Desuden kunne enhver og alle disse scenarier være resultatet af enten celle- autonom eller ikke-celle-autonome processer: de to midler kunne fællesskab målrette en isoleret cancercelle, eller inducere autokrin eller parakrin signalering til i sidste ende forårsage reduceret tumorvækst og overlevelse. Vi udforskede nogle mulige mekanismer effekt for én kandidat stof af interesse, angiotensin-II-receptor-blokker candesartan.

Først, vi vurderet, om samtidig candesartan dosering simpelthen ændret de primære farmakokinetik temozolomid [17], [18 ]. Vi fandt candesartan ændrede ikke signifikant biofordelingen af ​​temozolomid over adskillige væv, hvilket tyder dette nyorientering kandidat ikke medierer dens virkninger blot gennem lægemiddelmetabolisme interaktioner (Tabel S2 i File S1). Derudover testede vi, om candesartan direkte øgede den cellulære toksicitet af temozolomid i dyrkede U87MG celler. En fast-ratio (1-til-2.4) kombination blev anvendt, startende ved suprapharmacologic koncentrationer på 40 uM temozolomid og 16,7 uM candesartan hhv. På tværs af disse koncentrationer, bemærkede vi begrænset

in vitro

styrken af ​​kombination candesartan og temozolomid (figur S2), og derfor vi vendte tilbage til

i-vivo

modeller til at udforske naturen af ​​denne farmakologiske interaktion.

Dernæst vi vurderet, hvordan andre lægemidler med lignende farmakologiske mekanismer ville udføre i den primære U87MG screening model. Interessant fandt vi, at flere angiotensin II receptor inhibitor drugs ( “-artans”) var også effektiv i kombination med temozolomid (figur 2b). Endvidere yderligere lægemidler såsom renininhibitoren aliskerin, samt calciumkanalblokkere (amlodipin) og ACE-hæmmere (enalapril) optrådte også marginalt effektive. Disse resultater tyder på flere interessante konklusioner: 1.) vores primære skærm resultater kan bekræftes med lægemidler, der virker via lignende virkningsmekanismer 2.) en ukendt farmakofor målrettet af flere angiotensin-II-receptor-inhibitor stilladser kan have anti-cancer farmakologi 3.)

in vivo

skærme kan afsløre komplekse biologiske aktivitet i veje, der kan hæmmes af forskellige stoffer.

Endelig vi vurderet, om kombinationen af ​​candesartan /temozolomid forårsagede toksicitet specifikt i kræft væv, eller mere generelt ændret den farmakologiske margen af ​​temozolomid. Vi observerede, at, ved høje doser, candesartan kombination faldt lymfocyt og røde blodlegemer; det er to dosisbegrænsende bivirkninger, der påvirker den godkendte brug af temozolomid i mennesker (tabel S3 i File S1). Desuden har vi bemærket, at højdosis candesartan forværret vægttab og andre svækkede konstitutionelle tegn på sundhed hos mus ved dosering i kombination (data ikke vist). Disse fund antyder to konklusioner. Først, mens den yderligere effekt tillagt ved tilsætning af candesartan kan være ønskelig, kombinationen kunne også øge bivirkninger, hvilket resulterer i en risk-benefit profil stort set uændret fra temozolomid dosering alene. For det andet, den mekanistiske farmakologi bag vores resultater er sandsynligt kompleks: candesartan kan ændre både iboende og udskilles faktorer, der forårsager nedsat levedygtighed i både en celle-autonom, og ikke-celle autonomt, mode-dette kan føre til suboptimal kræft målretning. Mens uden for rammerne af undersøgelsen rapporterer vi her, er det sandsynligt, at yderligere prækliniske undersøgelser kan vise, at vores skærm afslørede nye og ønskelige terapeutiske muligheder.

Mens mekanistisk studie af vores screening hits kan være nyttige, kunne det også være foretrukket at validere kandidater direkte gennem klinisk afprøvning. For hurtigt at oversætte vores resultater, forblev det nødvendigt at påvise effekten på narkotika eksponeringer nærmere, hvad der er opnået i hverdagen human brug. Vi brugte de ordinerende etiketter for candesartan, den svampedræbende terbinafin, og bisphosphonat risedrontate at vælge en række orale doser til test af U87MG model (metoder). Sammenlignet med vores screening indsats i maksimalt tolererede doser, effekten af ​​hver af disse lægemidler faldt til ubetydelige niveauer som hver blev testet nærmere at mærke-godkendte dosis-ækvivalenter (figur 3). Groft disse resultater indebærer, at yderligere sikkerhedsforanstaltninger undersøgelser, både alene og eventuelt i kombination med temozolomid, er nødvendige, før disse lægemiddelkandidater kunne testes hos patienter human cancer.

A. Candesartan dosisområde bekræftelse i U87-MG model. Candesartan blev bekræftet på sin screening dosis og rute; effekt mindskes efter oral indgivelse nær og under den angivne MTD-dosis ækvivalent på 14,3 mg /kg. B. Risedronat bekræftelse dosisområde. Risedronat udviste beskedne kombinerede virkninger når de doseres oralt ved 7,5 mg /kg, hvilket nær MHRDD dosisækvivalent på 5 mg /kg (sammenlign skærmen resultat med 15 mg /kg, i.p.). Dosis eksponering tendens var beskeden, og optrådte svarer ved doser lidt under 5 mg /kg. C. Terbinafin dosis bekræftelse rækkevidde. Terbinafin blev testet ved i.p. administration. Effektivitet mindskes som lægemidlet blev indgivet under den humane dosis ækvivalent på 4 mg /kg. Gruppe betyder vist; kohorte SEM ikke vist for klarhed.

Diskussion

Flere vigtige konklusioner foreslået af vores bestræbelser på at opdage lægemiddelkandidater nyorientering kandidater i kræft. Først på trods af deres kompleksitet, de

in vivo

undersøgelser, vi gennemførte kan identificere mange nye lægemiddelkandidater ved bredt baseret opdagelse screening på tværs af mange titusinder, hvis ikke hundredvis, af forbindelser. Den hits udviser farmakologi, der vises konsekvent og reproducerbar tværs af flere modelsystemer, og kan foreslå struktur-aktivitet og pathway relationer, der tidligere var ukendte og uventede.

Vores princip motivation i at udføre direkte in vivo, i modsætning til primær celle kombination screening, var at afdække drug aktiviteter i komplekse, flercellede sammenhænge, ​​der er vanskelige at modellere hjælp in vitro systemer. Opmuntrende, bemærker vi, at for nylig, har yderligere grupper stort set bekræftet vores resultater med hensyn til samspillet mellem angiotensin hæmning og kemoterapi. Forfatterne foreslår en kompleks tilstand-of-action, der involverer vaskulogenese i komplekse tumor stroma væv [19]. Et igangværende kliniske forsøg (NCT01821729) kan yderligere bekræfte det terapeutiske potentiale af den komplekse farmakologi opdaget i vores skærme.

På trods af disse fordele ved in vivo-skærme, vi også bemærke flere vigtige begrænsninger. Vigtigst er det antaget, at nyorientering skærme identificere lægemidler, der kan hurtigt testet og fundet effektive i kliniske forsøg. Til dato, har vores indsats kun gav kandidater, som ville kræve omfattende præklinisk og klinisk sikkerhedsundersøgelser før effekten kunne afprøves i patienter. Selvom det kan synes at være den sandsynlige konsekvens fra vores “grådige” primære skærme, der er testet næsten maksimal-tolererede doser, fremhæve vi en omvendt risiko: det forekommer sandsynligt vores primære skærm hit rate ville være faldet til trivielle eller i nærheden af ​​nul niveauer, havde vi vurderet lavere doser i første omgang.

taget i sammenhæng, foreslår vi, at in vivo nyorientering skærme i baggrunden af ​​kræftbehandling kan relativt ressourcekrævende ineffektive. Som baggrund, denne undersøgelse afspejler arbejdet i flere teammedlemmer, der har bidraget betydelig indsats over ca. 18 måneder. Taget fra et perspektiv af enten engagerede fonde eller kollektiv indsats, projektet forbrugte ressourcer i høj grad svarer til dem, der kræves for at overgangen et enkelt, nyt lægemiddel fra præklinisk og klinisk sikkerhedsundersøgelser i effektstudier i kræftpatienter. Vi har opdaget roman farmakologi med potentielle anvendelse til behandling af cancer, men også erkende, at afbalancere indsatsen og værdien af ​​nyorientering skærme versus andre prioriteter forskning kan vise sig vanskeligt på tværs af bredere kræftforskning samfund.

Støtte oplysninger

figur S1.

Monoterapi effekt af kandidat hits i U87-MG xenografter. Forbindelser blev administreret i samme dosis og vej anvendes under den primære screening. Tumor målinger blev vurderet på dag 16. Gruppe midler vises; fejl er SEM, N = 8-10

doi:. 10,1371 /journal.pone.0101708.s001

(PPTX)

Figur S2. Salg Beskedne kombinationseffekter af temozolomid og candesartan i U87MG celler in vitro. U87MG celler blev dyrket i standardbetingelser (DMEM med 10% FBS), og eksponeret i 72 timer med forbindelser i forskellige koncentrationer. Den højeste koncentration af temozolomid ansat var 300 uM, mindst en log over gennemsnittet terapeutiske koncentrationer observeret under kliniske administration. Candesartan blev testet ved koncentrationsområder så høj som 16,7 uM, igen langt ud over for terapeutiske medikamenter engagementer. Forbindelser blev kombineret ved et fast forhold dosis på 2,4 til 1 (fx 40 uM temozolomid til 16,7 uM candesartan). Cisplatin var ansat som cytotoksisk kontrol sammensatte, ved koncentrationer starter ved 100 uM. Cellelevedygtighed blev vurderet ved anvendelse af kolorimetriske metoder (MTS assays). Temozolomid viste mindre levedygtighed effekter i U87MG op til 300 uM in vitro. Tilføjelsen af ​​candesartan op til 16,7 uM ikke potent forstærker behandling med op til 40 uM temozolomid, sammenlignet med cisplatin, som inducerede fremtrædende hæmning af cellernes levedygtighed

doi:. 10,1371 /journal.pone.0101708.s002

( PPTX)

File S1. Salg Borde S1-S3. Tabel S1. Phenix Cancer Bibliotek. Forudsat som Excel-fil i online supplerende materiale. Tabel S2. Confirmation Studier i U87MG xenograft model. Mus med U87-MG blev doseret med temozolomid i kombination med de anførte midler. Overlevelse analyse blev udført som beskrevet; målinger er fastsat til sammenligning. Tabel S3. Hæmatopoietiske ændringer af candesartan i kombination med temozolomid. C57BLJ6 mus blev doseret med temozolomid, med eller uden candesartan i doser og ruter angivet. Blodprøver blev indsamlet til komplet blodtælling hæmatologi analyse. Uændrede parametre vises ikke; cellepopulationer viser væsentlige ændringer (kursiv) på flere dosisgrupper er vist nedenfor. * P 0,05 med ANOVA, Dunnetts post-hoc test. De viste værdier er gruppe middelværdien (SEM), N = 10.

doi: 10,1371 /journal.pone.0101708.s003

(DOCX)

anerkendelser

Forfatterne takker følgende for konstruktive diskussioner og værdsat rådgivning:. Dr. David Tung, Dr. Dean Welsch, Dr. Gary DeCrescenzo og Dr. Reza Halse