PLoS ONE: Kritisk rolle Autophagy i behandling af Adenovirus kapsid-Incorporated Cancer antigener

Abstrakt

Adenovira er yderst immunogene og er ved at blive undersøgt som potentielle vektorer for immunterapi. Infektion med onkolytisk adenovirus efterfulgt af massiv autofagi i cancerceller. Her vil vi hypotesen, at autofagi regulerer behandlingen af ​​adenovirale proteiner for antigen præsentation. For at teste denne hypotese, vi undersøgte først præsentationen af ​​virale antigener ved inficerede celler under anvendelse af et antistof cocktail af virale capsidproteiner. Vi fandt, at virale antigener blev behandlet af JNK-medieret autophagy, og at autophagy var nødvendig for deres præsentation. I overensstemmelse med disse resultater, splenocytter isoleret fra virus-immuniserede mus blev aktiveret ved inficerede celler i et MHC II-afhængig måde. Vi derefter hypotesen, at denne mekanisme kan anvendes til at generere en effektiv cancervaccine. Til dette formål har vi konstrueret en onkolytisk virus omfatter en EGFRvlll cancer-specifik epitop i den adenovirale fiber. Infektion af kræftceller med denne fiber-modificeret adenovirus resulterede i erkendelse af inficerede kræftceller ved en særlig anti-EGFRvlll antistof. Men hæmning af autofagi drastisk reduceret evne til specifikt antistof til påvisning af cancer-relaterede epitop i inficerede celler. Vores data tyder på, at kombinationen af ​​adenovirus med autofagi induktorer kan øge behandling og præsentation af cancer-specifikke antigener indarbejdet i capsidproteiner

Henvisning:. Klein SR, Jiang H, Hossain MB, Fan X, Gumin J, Dong A, et al. (2016) Kritisk rolle Autophagy i behandling af Adenovirus kapsid-Incorporated Cancer antigener. PLoS ONE 11 (4): e0153814. doi: 10,1371 /journal.pone.0153814

Redaktør: Maria G. Castro, University of Michigan School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: Januar 25, 2016 Accepteret: April 4, 2016; Udgivet: 19 April, 2016

Copyright: © 2016 Klein et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH (P50CA127001; R01NS069964; Cancer center Support Grant P30CA016672-sekventering og Microarray Facility og Forskning Animal støtte faciliteter), den Marnie Rose Foundation, Will Power Foundation, Schissler Foundation, og den amerikanske Legion Auxiliary. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. JF, CG-M, og HJ har intellektuel ejendom på Delta-24-RGD , licens til DNAtrix, Inc. (patent indgivet US 14 /148.259; Smitteevne-forstærket betinget replikation adenovirus og anvendelser deraf). J.F. og C.G-M. er grundlæggere og konsulent DNATrix, Inc. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

onkolytiske adenovirus, såsom Δ24-RGD (Delta -24-RGD), [1, 2] er stærkt immunogene. [3] den nuværende hypotese til at forklare antitumor mekanisme hos patienter behandlet med onkolytiske adenovirus er, at den vigtigste effekt opnås gennem aftrækkeren af ​​et immunrespons antitumor. [4 ] autophagy er en anerkendt element i celler inficeret med adenovirus [5, 6], og er en vigtig del af den lyse processen. [7] Xenophagy [8] og patogen-afledt antigen behandling [9, 10] er grundlæggende funktioner af autophagy i celler inficeret med virus. Autophagy nedbryder intracellulært indhold, forarbejdning epitoper, der skal lastes på større histokompatibilitetskompleks (MHC) molekyler til præsentation på overfladen af ​​immunceller. [9-11] Den måde, hvorpå cancerceller behandle adenovirusafledte antigener er i øjeblikket ukendt.

gradueringen af ​​autofagi i pattedyrsceller er bedst beskrevet i celler, der undergår sult. [12-14] Ud over den kanoniske pathway, [12-14] c-Jun-N-terminal kinase (JNK) signaltransduktion pathway aktiveres i celler undergår autofagi. [15] Desuden JNK-aktivering er blevet observeret i celler inficeret med virus. [16] på trods af den klare rolle, som JNK spiller om regulering af medfødte og adaptive immunrespons, [17], herunder evnen at forstærke immunresponset på virale patogener ved opregulering af ekspressionen af ​​proinflammatoriske cytokiner, [18-20] den direkte funktion af JNK i patogen-afledt antigen-processering og præsentation er endnu ikke blevet defineret.

Vi har nylig rapporteret, at JNK-ekspression og aktivering ved phoshporylation er påkrævet for induktionen af ​​produktive autofagi i adenovirus-inficerede celler. [16] i denne undersøgelse fandt vi, at adenovirale strukturelle proteiner interagerer med autophagy last-receptorproteiner, der fører til dens nedbrydning i autophagolysosomes . Autophagy synes at være essentiel for præsentationen adenovirusafledte antigener, fordi inaktivering af autofagi regulator JNK eller direkte inaktivering af autofagi drastisk begrænset anerkendelse af kræft-inficerede celler ved primede immunceller og antistoffer mod capsid eller cancerspecifikke ektopiske epitoper der kodes af den adenovirus fiber.

Materiale og metoder

Cell kultur

U87 MG gliom, HeLa livmoderhalskræft, og A549 lunge cancer cellelinjer blev alle opnået fra ATCC. HeLa-celler blev dyrket i DMEM (1X), og A549-celler blev dyrket i DMEM /F-12 50:50 medium (Invitrogen). U87 MG-celler (ATCC) blev dyrket i MEM med 10% FBS og 1% essentielle aminosyrer. Vild-type og

JNK1 /2 – /-

mus embryo fibroblaster (MEF’er) blev leveret af Roger Davis (University of Massachusetts Medical School, MA). Vild-type og knock-out Atg5 MEF (

Atg5 – /-

) er en generøs gave fra Noboru Mizushima (Tokyo Medical og Dental University, Tokyo, Japan). Vild-type og knock-out P62 MEF (

P62 – /-)

var en generøs gave fra Jorge Moscat (Sanford-Burnham Medical Research Institute, La Jolla, CA). MEF’er blev dyrket i DMEM /F12 50:50 medium. Celler blev dyrket med 10% FBS ved 37 ° C i 5% CO

2 i luft.

Kemikalier og antistoffer

JNK kinase inhibitor SP600125 og bafilomycin A1 blev indkøbt fra Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA). Rapamycin blev indkøbt fra Calbiochem (San Diego, CA, USA). Rekombinant humant protein interferon gamma (IFN-γ) blev indkøbt fra ProSpec (East Brusnwick, NJ, USA). Antistoffer mod LC3, Beclin 1, og ubiquitin blev indkøbt fra cellesignalering Technologies (Beverly, MA, USA). Anti-P62 og anti-actin-antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Dallas, Texas, USA). Anti-adenoviral fiber blev opnået fra ThermoScientific (Waltham, MA, USA). EGFRvlll blev påvist med et monoklonalt antistof (L8A4) opnået som en generøs gave af Dr. Bigner (Duke University, NC, USA). Allophycocyanin (APC) -konjugeret anti-muse sekundære antistoffer og fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret sekundært antistof blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology.

Adenoviral produktion og infektion

Δ24RGD og AdWT adenovira blev produceret som tidligere beskrevet. [1] Δ24FvIII blev konstrueret ved at indsætte EGFRvlll epitop (LEEKKGNYVVT) [21] ind i HI løkke af fiber protein mellem aminosyrerne 543 og 544. [22] Første, der koder for EGFRvlll epitop blev inkorporeret i fiberen genet i vektoren pXK-F indeholdende

Xba

I-

Kpnl

fragment fra pVK503C [23] via site-directed mutagenese. Dernæst Xbal-Kpnl fragment fra den resulterende vektor pXK-FVIII blev co-transduceret med

Swa

I-lineariseret pVK500C.delta-24 i

E

.

coli

BJ5183 til homolog rekombination som beskrevet tidligere. [24] Virusset blev derefter reddet i 293-celler og opformeres i A549-celler, som tidligere beskrevet. [24] Adenovira blev tilsat til celledyrkningsmedier ved den angivne multiplicitet af infektion (MOI).

Western blot-analyse

Celler blev lyseret med RIPA-lysepuffer. Proteinkoncentrationer blev bestemt med anvendelse af en Bio-Rad proteinassay. Proteinprøver (25 ug) i 1X SDS loading buffer blev kogt og indlæses i Tris-glycin natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) geler (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Prøver blev separeret ved hjælp af elektroforese. Geler blev derefter overført til polyvinyliden fluorid membraner, der blev blokeret af anvendelse af 5% fedtfri mælk i 1X TBS-T (0,025% Tween) i 1 time ved stuetemperatur og derefter inkuberet natten over ved 4 ° C i et primært antistof ved passende fortyndinger. Membraner blev vasket tre gange med TBS-T (0,05% Tween) og derefter inkuberet ved stuetemperatur i 1 time med passende sekundære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology; 1: 4000) fremstillet i 1% fedtfri mælk i TBS-T. SuperSignal West Femto kemiluminescerende substrat (ThermoScientific) og HyBlot CL autoradiografi film (Denville Scientific Inc., South Plainfield, NJ, USA) blev anvendt til at visualisere proteinbånd.

RNA-interferens

Vildtype MEF celler blev podet i plader med 6 brønde 24 timer før lille interfererende RNA (siRNA) transfektion. INTERFERin (POLYPLUS Transfektion (Illkirch-Graffenstaden, Frankrig) blev anvendt til at indsætte de siRNA’er i celler ifølge producentens protokol. Kort fortalt blev 50 nM siRNA oligonukleotider kombineret med 10 pi transfektionsreagens og sættes til cellerne efter 15 min inkubation ved stuetemperatur. siRNA oligonukleotider til mus MHC klasse i, MHC klasse II, og ikke-kodende regioner blev købt fra Santa Cruz Biotechnology.

Co-immunoprecipitation

Cellerne blev inficeret med AdWT eller Δ24RGD for op til 48 timer. Flydende og vedhæftede celler blev opsamlet og lyseret med immunopræcipitation (IP) lyseringsbuffer (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCI [pH 7,4], 2 mM EDTA, 10% glycerol, 1% IGEPAL CA-630) . Proteinprøverne blev præ-clearet med protein a og protein G agaroseperler anti-adenovirale fiber eller anti-P62-antistoffer blev tilsat til lysaterne ved en fortynding på 1:. 100, og komplekser af proteiner blev immobiliseret med protein a og protein G (1: 1). agaroseperler Immunpræcipiterede prøver, pre-blokerede perler, og 5% input blev analyseret ved Western blotting. IP detektion sekundært antistof blev anvendt til at påvise proteiner er bundet af alle anti-kanin og anti-mus primære IgG.

Flowcytometri

Cellerne blev behandlet for de respektive tidspunkter, trypsiniseret, og opsamles i phosphatbufret saltvand (PBS) med 1% bovint serumalbumin (BSA). Celler blev behandlet, når det angives med IFN-γ (300 enheder /ml) og bafilomycin A1 (Sigma-Aldrich). Levende celler blev farvet for adenovirale antigener ved anvendelse af en kombination af muse-anti-adenovirus (blanding) belægning (1:75; Millipore, Billerica, MA, USA) og muse-anti-adenovirus fiber antistoffer (1:75; ThermoScientific) i 30 minutter ved 4 ° C. Efter at cellerne var vasket, blev de farvet med APC-konjugeret anti-muse sekundære antistoffer (1,75; Santa Cruz Biotechnology) i 30 minutter ved 4 ° C. Til påvisning af EGFRvlll epitop (LEEKKGNYVVT) blev cellerne farvet med et monoklonalt antistof (L8A4) efterfulgt af FITC-konjugeret sekundært antistof-farvning. De levende celler blev analyseret med anvendelse af en BD FACSCalibur (Becton-Dickenson, Franklin Lakes, NY, USA). Døde celler blev udelukket ved anvendelse af propidiumiodid eller ethidiumhomodimer-1-farvning før analyse. Dataene repræsenterer mindst fire uafhængige forsøg.

splenocytpopulation aktivering

Alle dyreforsøg blev udført i de veterinære faciliteter på The University of Texas MD Anderson Cancer Center i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer og vejledningen for Pasning og anvendelse af Laboratory Animal. Undersøgelsen blev godkendt af The University MD Anderson Cancer Center Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC). C57BL /6-mus (10-12 uger gamle) blev inficeret intrakranialt med to injektioner (dag 0 og 3) på 1 × 10

8 pfu /mus Δ24RGD via guide-crew systemet, som beskrevet tidligere. [1] dyrene blev aflivet med anvendelse af en CO

2 kammer; miltene blev fjernet andsmashed trug 100 mikrometer si; [25] og splenocytter blev vasket med PBS. Røde blodlegemer blev fjernet via ACK lyserende puffer (Lonza, Houston, TX, USA). Vildtype og JNK knock-out MEF’er blev podet ved 1 x 10

5 celler i en 6-brønds plade (in triplo). Cellerne blev inficeret med 100 MOI på Δ24RGD i 24 timer, trypsiniseret, og re-udpladet i en 96-brønds plade ved 5 × 10

4 celler per brønd i RPMI 1640-medier med 10% FBS og 55 pM beta-mercaptoethanol . Splenocytter (1 × 10

6 celler) blev inkuberet med MEF’er i kultur i 24 timer. For forsøg, herunder blokerende antistoffer, blev præ-inficerede MEF celler inkuberet med 2 ug af anti-muse MHC klasse II (IA /IE), anti-muse MHC klasse I (H-2Kd) (eBioscience, San Diego, CA), eller muse IgG (Santa Cruz) 2 h før co-kultur med primede splenocyter. Splenocytter blev derefter inkuberet med de præ-inficerede MEF celler og blokerende antistoffer i 24 timer. En mus IFN-γ ELISA Kit (ThermoScientific) blev anvendt til at evaluere koncentrationen af ​​IFN-γ i 50 pi medier ekstraheret fra co-kultur. ELISA blev udført i overensstemmelse med producentens anvisninger, og absorbansen blev analyseret via en Omega mikropladelæser (BMG Labtech, Ortenberg, Tyskland).

Statistisk analyse

En to-tailed Student

t

-test blev anvendt til bestemmelse af den statistiske signifikans af behandlede og inficerede prøver i forhold til kontrolprøver. P-værdier mindre end 0,05 blev accepteret som statistisk signifikant.

Resultater

JNK-medieret autofagi regulerer præsentationen af ​​adenovirus-afledte antigener

patogen-afledte antigener kan behandles i den autophagolysosomal rum via autophagy, [10], men den rolle autophagy i præsentationen af ​​adenovirale epitoper er endnu ikke fastlagt. Med brug af en cocktail af anti-adenovirale protein antistoffer, screenede vi inficerede celler for tilstedeværelse af adenovirus-afledte peptider på overfladen af ​​levende, nonpermeabilized, inficerede celler. Til disse undersøgelser, tog vi fordel af, at JNK-nul celler er mangelfuld for autofagi. [15, 16] Vi observerede, at mens hovedparten ( 77%) af

JNK wt Salg MEF’er inficeret med AdWT udtrykte adenovirale proteiner på deres overflade, som påvist ved FACS analyser (Fig 1A), det genetiske ablation af

JNK1

JNK2

isoformer resulterede i et signifikant fald i procentdelen af ​​celler testet positive for adenovirale proteiner. Fordi T-celleaktivering, fremgår af syntesen og sekretionen af ​​IFN-γ, er kendetegnende fremgangsmåde til bekræftelse af antigenpræsentation gennem interaktioner mellem epitop-indeholdende MHC-molekyler og T-celle-receptoren, [26] vi dokumenteret immun relevans af vores data ved kvantificering af sekretionen af ​​IFN-γ med splenocytter fra ikke-inficerede mus (naive) eller adenovirus-behandlede mus (primede) i co-kultur med

JNK vægt-

eller

JNK1 /2

– /- MEF’er inficeret med adenovirus. Som forventet, co-kulturer af naive splenocytter med adenovirus-inficeret

JNK vægt

, eller

JNK1 /2

– /- celler ikke fremkalde signifikant sekretion af IFN-γ. Imidlertid vildtype MEF’er inficeret med adenovirus bedt IFN-γ produktion ved samtidig dyrket med primede splenocytter (Fig 1B). I modsætning hertil kulturer af autofagi-deficient

JNK1 /2

– /- MEF’er med adenovirus-primede splenocytter indeholdt signifikant lavere udskilte IFN-γ niveauer (Fig 1B). Disse data viste, at autofagi-nedsat celler er mangelfuld til præsentation af adenovirus-afledte antigener til immunsystemet.

(a)

JNK vægt

JNK

1 /2 – /- MEF’er var mock-inficeret eller inficeret med AdWT (100 MOI) i 48 timer og inkuberet med to kombinerede sæt anti-adenovirale antistoffer (en blanding af adenovirale kappeproteiner og adenoviral fiber). De blev derefter inkuberet med APC-konjugeret sekundært antistof og analyseret ved flowcytometri. IgG isotype blev anvendt som kontrol. Propidiumiodid blev anvendt til at vurdere cellernes levedygtighed og analysere levende celler. Data viser procentdelen af ​​positive celler som gennemsnit ± SD. ***

P

0,001 (AdWT-inficeret

JNK

1/2 – /- MEF’er versus AdWT-inficeret

JNK vægt

MEF) (uparret, tosidet Student

t-test)

. (B) Splenocytter blev isoleret fra naive og Δ24RGD-inficerede C57BL /6 mus og co-dyrket med

JNK vægt

eller

JNK

1/2 – /- MEF’er, der var mock-inficeret eller inficeret med Δ24RGD adenovirus (100 MOI) i 24 timer før co-dyrkning. Efter 48 timers co-kultur blev IFN-y niveauer (pg /ml) i de konditionerede medier vurderet ved ELISA. Data repræsenterer IFN-y niveauer (pg /ml) som middelværdi ± SD fra tre uafhængige co-kulturer. **

P

0.01 (uparret, tosidet Student

t-test

). (C) U87 MG-celler blev forbehandlet med DMSO, SP600125 (25 uM), eller bafilomycin A1 (BA1, 10 nM) 30 min før infektion med Δ24RGD adenovirus (50 MOI) i 48 timer. Levende celler blev inkuberet med antistoffer rejst mod adenovirale capsidproteiner eller IgG isotype som kontrol, og analyseret ved flowcytometri. Procentdelen af ​​APC-positive celler blev kvantificeret og repræsenteret som middelværdi ± SD (

n

= 3). *

P

0,05 (procent af positive celler efter behandling med AdWT og SP600125 vs. AdWT og BA1) (uparret, tosidet Student

t-test

). (D) Betydelig stigning i præsentationen af ​​adenovirale antigener i celler inficeret med Δ24RGD når rapamycin blev tilføjet til kulturerne. U87 MG-celler blev mock-inficeret, inficeret med Δ24RGD, eller inficeret med Δ24RGD og rapamycin (100 nM /48 h) i 48 timer og derefter undersøgt for adenovirale antigener ved flowcytometri.

Yderligere støtte rolle JNK og autofagi i behandlingen af ​​adenovirus-afledte antigener, observerede vi, at behandling af autofagi-dygtige inficerede kulturer med JNK-inhibitorer (SP600125) [27] eller autofagi flux hæmmere (bafilomycin A1 [28]) signifikant nedsatte procentdelen af ​​inficerede levende celler frembyder i deres overflade adenovirusproteiner i FACS analyser (fig 1C). I overensstemmelse med disse data, viste det modsatte eksperiment, forbehandling af inficerede celler med autofagi-inducer rapamycin [29] resulterede i en stigning i procentdelen af ​​celler, der blev testet positive for adenovirale epitoper i FACS screening (Fig 1D). Kombineret, alle disse observationer kraftigt antydet, at autophagy kan spille en rolle i præsentationen af ​​patogen-afledte antigener i adenovirus-inficerede celler.

MHC klasse II er nødvendig for adenovirale antigener

Autophagy er involveret i behandlingen af ​​peptider til præsentation hovedsageligt via MHC klasse II-molekyler, [10, 11] således besluttede vi at bestemme, om antistof-baserede blokade af MHC klasse II forhindret anerkendelse af inficerede celler ved adenovirus-primede splenocytter. Til dette formål har vi kvantificeret IFN-γ-produktion i co-kulturer af adenovirus-primede splenocytter med virusinficerede MEF’er præinkuberet med blokerende antistoffer for MHC klasse I eller II. Vi observerede, at celler behandlet med antistoffer mod MHC klasse II-proteiner viste signifikant hæmning af IFN-γ produktion sammenlignet med celler behandlet med antistoffer mod MHC klasse I proteiner eller IgG-behandlede kontroller (Fig 2A). For at bekræfte disse data, vi udfordrede præsentationen af ​​adenovirus-antigener af en specifik siMHC klasse II (figur 2B). Vi observerede, ned-modulering af MHC klasse II-mRNA resulterede i et fald i antallet af celler der præsenterer adenovirale epitoper (figur 2C). Angivelse fremherskende rolle MHC klasse II i processen, viste, at den ned-modulering af MHC klasse I havde meget mindre effekt på præsentationen af ​​adenovirus-afledte antigener end gjorde det nedregulering af MHC klasse II. Disse data indikerer, at adenovirus-afledte antigener overvejende er præsenteret via MHC klasse II, den dominerende vej for epitoppræsentation for proteiner behandles via autofagi. [10, 11]

(a) Mock- eller Δ24RGD-inficeret Wild- indtaster MEF’er blev præinkuberet med antistoffer mod MHC klasse I, MCH klasse II, eller IgG isotop og derefter co-dyrket med splenocyter opnået fra Δ24RGD-inficerede mus. Fold-change af IFN-γ niveauer (pg /ml) i co-kultur medie vises i forhold til kontrol og vist som middelværdi ± SD. **

P

0.01 (uparret, tosidet Student

t-test

). (B) Wild-type MEF-celler blev transficeret med en pulje af sinc, siMHCI, siMHCII eller kombineres lige store mængder af siMHC I og siMHC II i 48 timer og derefter inficeret med Δ24RGD adenovirus ved en MOI på 10 for yderligere 48 timer . Hel-cellelysater blev analyseret ved anvendelse af anti-MHC klasse I og anti-MHC klasse II-antistoffer. Virkningen af ​​hver siRNA behandling på proteinniveauet af MHC-molekyler er illustreret. (C) Vildtype-MEF’er blev transficeret med en pulje af sinc, siMHCI, siMHCII eller kombineres lige store mængder af siMHCI og siMHCII i 48 timer, og derefter inficeret med Δ24RGD adenovirus ved en MOI på 10 for yderligere 48 timer. Derefter blev cellerne farvet til påvisning af adenovirale antigener. Propidiumiodid blev anvendt til at vurdere cellernes levedygtighed. Data er vist som procentdelen af ​​positive celler (gennemsnit ± SD). Faldet i procentdelen af ​​positive adenovirus-inficerede, siMHCII-transficerede celler sammenlignet med adenovirus-inficerede, sinc-transficerede celler var statistisk signifikant. **

P

0.01 (uparret, to-halet Students

t-test)

.

adenovirale strukturelle proteiner interagerer med P62 og nedbrydes i autolysosome

Næste vi søgt at undersøge, om strukturelle adenovirale proteiner blev nedbrudt i autophagolysosomes. Fordi p62 chaperone protein binder sig til ubiquitinerede proteiner til deres binding og nedbrydning i autophagolysosomes, [30] vi analyseret den potentielle interaktion mellem P62 og fiber protein udfører co-immunoprecipitaton eksperimenter. Vi viste, at den adenovirale fiber protein blev ubiquitineres under adenovirusinfektion og interageret med P62 (Fig 3A). I overensstemmelse med en rolle autophagolysosome i nedbrydningen af ​​adenovirale fiber protein, interaktionerne mellem P62 og fiber protein var mere tydelig i

Atg5

– /- MEF’er, som er deficiente for adenovirus-inducerede autofagi [7] ( fig 3A). Faktisk detaljeret undersøgelse af fiber protein niveauer på flere tidspunkter efter adenoviral infektion afslørede bemærkelsesværdigt højere niveauer af disse proteiner i autofagi-mangel

Atg5 – /-

MEF’er celler sammenlignet med vildtype

Atg5

MEF (

Atg5 vægt

) inficeret med lige store mængder af vildtype adenovirus (fig 3B). Desuden observerede vi også, at efter adenoviral infektion var der et signifikant fald i procentdelen af ​​celler, der præsenterede adenovirale proteiner i

Atg5 – /-

MEF’er kulturer sammenlignet med

Atg5wt

MEF’er (fig 3C ). Som forventet blev lignende resultater observeret med

P62

– /- MEF’er inficeret med adenovirus, der bekræfter, at mangel på

P62

udtryk resulterede i en betydelig reduktion af den procentdel af adenovirale pels-positive celler med hensyn til adenovirus-inficerede vildtype

P62 Salg MEF’er (fig 3D), sandsynligvis på grund af den mangelfulde p62-medieret transport af adenovirale proteiner til autophagosome. Disse data foreslog yderligere, at adenovirale proteiner blev nedbrudt i autophagolysosomes under aktiv autophagic flux resulterer i præsentation af adenovirus-afledte epitoper på værtscellens overflade.

(a) Cellelysater fra

Atg5wt

eller

Atg5 – /-

MEF’er inficeret med AdWT (50 MOI) blev analyseret for fiber /ubiquitin og fiber /P62 protein-komplekser. LC3-I til LC3-II konvertering og P62 ekspressionsniveauer blev analyseret i et input prøve (5%). Actin er vist som en loading kontrol. (B) Cellelysater fra

Atg5wt

og

Atg5

– /- MEF’er var mock-inficeret eller inficeret med AdWT (50 MOI) for de angivne tidspunkter og analyseres for adenoviral fiber udtryk. Actin blev anvendt en belastning kontrol. (C)

Atg5wt

og

Atg5 – /- Restaurant MEF’er blev mock-inficeret eller inficeret med AdWT adenovirus (50 MOI) i 48 timer og derefter farvet med antistoffer mod adenovirale kappeproteiner, inkuberet med APC-konjugeret sekundært antistof og analyseret ved flowcytometri. IgG isotype blev anvendt som kontrol. Propidiumiodid blev anvendt til at vurdere cellernes levedygtighed. Data er vist som procent af APC-positive celler (middel ± SD) af tre uafhængige forsøg. ***

P

0,001 (procent af APC-positive i AdWT-inficerede

Atg5wt

celler vs. AdWT-inficeret

Atg5

– /- celler) (uparret, tosidet Student

t-test

). (D)

p62wt

og

P62 – /- iBooked.dk MEF’er blev inficeret med AdWT adenovirus (100 MOI) i 48 timer og derefter farvet med antistoffer mod adenovirale coat proteiner, inkuberet med APC-konjugeret sekundært antistoffer, og analyseret ved flowcytometri. IgG isotype blev anvendt som kontrol. Propidiumiodid blev anvendt til at vurdere cellernes levedygtighed. Data er vist som procent af APC-positive celler (middel ± SD) af tre eksperimenter. ***

P

0,001 (procent af APC-positive celler i AdWT-inficerede

P62

– /- vs. AdWT-inficeret

p62wt

celler) (uparret, tosidet Student

t-test

).

Generation of Δ24FvIII adenovirus

Ændring af adenovirale capsider ved indsættelse af antigener sekvenser er en lovende teknologi til udvikling af vacciner og anti-cancer-vacciner, [31] og derfor har vi forsøgt at afgøre, om autophagy var den vigtigste mekanisme til behandling af ektopiske cancer-specifikke epitoper kodet af adenovirale fibre. Vi derefter genereret en eksperimentel model, som ville give os mulighed for at afgøre, om der kunne påvises en specifik sekvens i adenovirale fiber i adenovirus-inficerede celler. Til dette formål har vi konstrueret og fremstillet et kimært adenovirus fiber omfatter sekvensen af ​​en velkarakteriseret human epitop (Fig 4A). Den resulterende konstruktion blev betegnet Δ24FvIII, og bruges Δ24 tumor-selektive backbone adenovirus [32] og kodet epitop LEEKKGNYVVT indsat i HI-løkke af adenovirus fiber sekvens. Dette peptid er afledt fra forbindelsesområdet sekvens af det trunkerede protein frembragt i mutant variant III i mutant EGFR og har tidligere vist sig at være særdeles immunogene [21] (Fig 4A).

(a) Skematisk fremstilling af genereringen af ​​VIII kimære fiber. PCR-baseret mutagenese blev anvendt til at indsætte sekvensen af ​​LEEKKGNYVVT epitop i den hypervariable region af HI sløjfen. Et unikt EcoRV-restriktionssted blev inkorporeret for at tillade indsættelsen af ​​ektopisk sekvens mellem glycin-543 og asparaginsyre-544. (B) Ekspression af det kimære fiber omfatter den LEEKKGNYVVT peptid blev vurderet i A549-celler inficeret med Δ24FvIII (40 MOI). Proteinlysater blev underkastet Western blot-analyse 72 timer efter infektion under anvendelse af både anti-fiber og L8A4 anti-LEEKKGNYVVT antistoffer. (C) Levende vildtype

Atg5

og

Atg5

– /- MEF’er blev inficeret med Δ24FvIII ved en MOI 150 i 48 timer og derefter farvet med L8A4, efterfulgt af FITC-konjugerede sekundære antistoffer til flowcytometri analyse. Ethidiumhomodimer-1-farvning blev anvendt til at udelukke døde celler. Procenter af FITC-positive levende celler er vist i øverste højre hjørne af hver graf. Faldet i antallet af positive celler i Δ24FvIII-inficerede

Atg5

– /- sammenlignet med Δ24FvIII-inficerede vildtype

Atg5

celler var statistisk signifikant. Data er vist som middelværdi ± SD af tre eksperimenter. ***

P

0,001 (uparret, tosidet Student

t-test

). (D) HeLa-celler blev inficeret med Δ24FvIII ved en MOI på 40. IFN-γ (300 enheder /ml) eller /og bafilomycin A1 (BA1; 100 nM) blev tilsat til mediet 6 timer eller 24 timer efter infektion, hhv. Levende celler blev farvet med L8A4 48 timer efter infektion og derefter inkuberet med FITC-konjugerede sekundære antistoffer for at visualisere positive celler med et flowcytometer. Ethidiumhomodimer-1-farvning blev anvendt til at udelukke døde celler. Graf repræsenterer middelværdier for tre eksperimenter ± SD. *

P

0,05; **

P

0.01 (uparret, tosidet Student

t-test

).

Celler inficeret med F_21 “\\ o” Humphrey, 1990 # 149 “thEGFRvIII-afledt kræft-specifikke epitop

Brug en yderst specifik antistof genereret mod den EGFRvlll peptid [21], vi dokumenteret, at ekspressionen af ​​det kimære fiber let blev detekteret i Δ24FvIII-inficerede celler (fig 4B). vi antager, at ektopisk sekvensen af ​​det humane epitop indsat i den adenovirale fiber blev behandlet via autofagi og præsenteres i overfladen af ​​inficerede celler Derfor, efter vildtype og autofagi-deficient

Atg5

-. /- MEF’er blev inficeret med Δ24FvIII, overfladerne af levende celler var undersøges for tilstedeværelsen af ​​LEEKKGNYVVT med anvendelse af det specifikke antistof [21] og FACS analyser. Vi viste, at en høj procentdel af vildtype

Atg5

MEF’er blev positivt identificeret ved anti-LEEKKGNYVVT antistof (fig 4C .) Men procentdelen af ​​positive celler blev signifikant reduceret i autofagi-mangel

Atg5

– /- MEF’er inficeret med Δ24FvIII adenovirus (fig 4C). blev opnået lignende data, når HeLa-celler blev inficeret med Δ24FvIII adenovirus og autofagi flux blev blokeret med bafilomycin A1. Således er andelen af ​​HeLa-celler der præsenterer LEEKKGNYVVT peptid faldt dramatisk, når de inficerede kulturer blev behandlet med bafilomycin A1 (Fig 4D). Stærkt tyder den specifikke aktivering af antigen-maskiner under infektion, præsentationen af ​​LEEKKGNYVVT peptid steg efter tilsætning af IFN-γ, som transkriptionelt aktivere MHC, [33] for kulturer inficeret med Δ24FvIII adenovirus (Fig 4D). Endelig yderligere understreger den rolle, autofagi i behandlingen af ​​LEEKKGNYVVT, bafilomycin A1 forbehandling inducerede en blokerende effekt, antagoniserede og faldt betydeligt den positive modulering af antigenpræsentation medieret af IFN-γ (fig 4D).

Diskussion

Vores data giver beviser for første gang, at hæmning af autophagy i adenovirus-inficerede celler forhindrer effektiv præsentation af adenovirus-afledte og fiber-indarbejdet cancer-specifikke epitoper. Vi har også vist, at adenovirale proteiner interagerer med autophagy last-receptor p62 protein, stærkt antyder, at p62 kan bære adenovirale capsidproteiner til autophagosome. Interessant, er P62 blevet foreslået til at arbejde som en potentiel sensor for virusinfektion og forbindelsen mellem virus proteiner og autofagi. [34] Det faktum, at P62 binder adenoviral fiber kraftigt antydet, at autofagi var involveret i adenovirale protein nedbrydning.