PLoS ONE: TIG3 Tumor suppressor-Dependent Organelbiosyntese Omfordeling og apoptose i hudkræft Cells

Abstrakt

TIG3 er en tumor suppressor protein, der begrænser keratinocyt overlevelse under normal differentiering. Det er også vigtigt i cancer, da TIG3 er reduceret i tumorer og i huden cancercellelinier, hvilket antyder, kan være påkrævet tab af ekspression for cancer celleoverlevelse. Et vigtigt mål er at identificere, hvordan TIG3 begrænser celle overlevelse. I den foreliggende undersøgelse viser vi, at TIG3 ekspression i epidermale pladecellecarcinom SCC-13 celler reducerer celleproliferation og fremmer morfologiske og biokemiske apoptose. For at identificere den mekanisme, der driver disse ændringer, vi vise, at TIG3 lokaliserer nær centrosom og at pericentrosomal ophobning af TIG3 ændrer mikrotubuli og microfilament organisation og organel distribution. Organel ophobning ved centrosom er kendetegnende for apoptose og vi viser, at TIG3 fremmer pericentrosomal organel akkumulation. Disse ændringer er forbundet med reduceret cyclin D1, cyclin E og cyclin A, og øget p21 niveau. Desuden er Bax niveau øges og Bcl-XL er reduceret, og spaltning af procaspase 3, procaspase 9 og PARP øges. Vi foreslår, at pericentrosomal lokalisering af TIG3 er en vigtig begivenhed, der resulterer i mikrotubuli og microfilament omfordeling og pericentrosomal organel klyngedannelse og det fører til kræftcelle apoptose

Henvisning:. Scharadin TM, Jiang H, Jans R, Rorke EA, Eckert RL (2011) TIG3 Tumor suppressor-Dependent Organelbiosyntese Omfordeling og apoptose i hud kræftceller. PLoS ONE 6 (8): e23230. doi: 10,1371 /journal.pone.0023230

Redaktør: Janine Santos, University of Medicine og Dentistry of New Jersey, USA

Modtaget: Marts 25, 2011; Accepteret: 12 Jul 2011; Udgivet: 17 August, 2011

Copyright: © 2011 Scharadin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health tilskud til VE (NIH R01 AR094713 og NIH R01 AR04694). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

TIG3 (Tazarotene-induceret gen 3), som også kaldes retinsyrereceptor responder 3 (RARRES3) og retinoid-inducerbart gen 1 (RIG1) [1] – [5], er et hundrede sixty- fire aminosyrer langt protein [6]. TIG3 blev oprindeligt identificeret som forøget efter behandling af dyrkede epidermale keratinocytter eller psoriasis epidermis med den syntetiske retinoid, Tazarotene [6]. Det udtrykkes i lave niveauer i hyperproliferative epidermis (fx pladecellecarcinom og psoriasis) og ekspression genoprettes ved retinoid behandling [7] – [9]. I retinoid-behandlede psoriatiske epidermis, forøges TIG3 ekspression forbundet med genoprettelse af normal differentiering [6], [10]. Foreningen af ​​øget TIG3 udtryk med normal epidermal fænotype antyder, at TIG3 kan virke som en pro-differentiering regulator. For at undersøge virkningsmekanismen studerede vi TIG3 funktion i normale humane keratinocytter [10] – [12]. Disse undersøgelser viser, at TIG3 er til stede i forsvindende små mængder i keratinocytter i monolagskultur, men forøges i differentierede Gummibåd kulturer [12]. Vektor-medieret ekspression af TIG3 i keratinocytter resulterer i reduceret proliferation og øget forhornede kuvert dannelse, hvilket antyder, at TIG3 regulerer keratinocytdifferentiering [10] – [12]. Igangværende undersøgelser viser, at TIG3 fungerer via flere mekanismer, men en fremtrædende virkningsmekanisme er regulering af transglutaminase-aktivitet [10], [11]. Type I transglutaminase (TG1) er et nøgleenzym i keratinocytter og anden overflade epitel, som udtrykkes i suprabasale differentierede celler [13] – [20]. Transglutaminase katalyserer dannelse af ∈- (γ-glutamyl) lysin protein-protein krydsbindinger at samle forhornede konvolut, en væsentlig del af den epidermale barriere [21], [22]. Vores undersøgelser tyder på, at TIG3 co-lokaliserer med TG1 fører til øget transglutaminase aktivitet [10], [11]. Yderligere undersøgelser viser, at TIG3 reducerer keratinocytproliferation, men ikke forårsager apoptose [10], [11]. TIG3 består af en aminoterminal hydrofilt segment og et C-terminalt membranforankringsdomæne [6], [23]. Mutagenese-undersøgelser viser, at mutanter, der mangler den C-terminale membran-forankring domæne er ikke aktiv [10], [11], [23]. I modsætning hertil N-terminal trunkering konverterer TIG3 til et protein, der forårsager apoptose i keratinocytter [12].

TIG3 udtrykkes ved reducerede niveauer i hudtumorer [7]. Således et vigtigt mål for den foreliggende undersøgelse er at karakterisere virkningen af ​​TIG3 ekspression i huden cancerceller. Vi viser, at genoprette TIG3 ekspression reducerer overlevelsen af ​​epidermale pladecellecarcinom celler via en mekanisme, der involverer pericentrosomal TIG3 lokalisering fører til ændret mikrotubulus organisation og organel distribution. Dette er forbundet med ændringer i niveauet af cellecyklus og apoptose regulatorer.

Resultater

falder TIG3 udtryk celle nummer

Vi begyndte ved at undersøge virkningen af ​​TIG3 på SCC- 13 celleoverlevelse. TIG3 blev leveret af adenovirus infektion. Fig. 1A viser, at tom vektor-inficerede celler stige i antal i løbet af 72 timer, men at celletallet reduceres betydeligt ved 48 og 72 timer i TIG3-udtrykkende celler. Fig. 1B viser, at TIG3 niveau er maksimal i de inficerede celler ved 24 og 48 timer efter infektion og reduceres med 72 timer. Ud over den TIG3 monomer, observere vi akkumulering af højmolekylære former, som menes at være kovalent tværbundet TIG3 [10] – [12]. Som tidligere rapporteret, er TIG3 udtrykkes ved lave niveauer i de fleste transformerede celler [10], er [11], og derfor ikke opdages ved tiden nul.

Subkonfluente kulturer af SCC-13 celler, der vokser i 3,8 cm

2 brønde, blev inficeret med 10 MOI tAd5-EV eller tAd5-TIG3. Ved 0, 24, 48, og 72 timer efter infektion blev celler talt og lysater fremstillet. En TIG3 ekspression formindsker celleantal. Værdier er middelværdi ± SEM, n = 3. De sammenligninger markeret med en stjerne er signifikant forskellige som bestemt ved t-test (p 0,001). B TIG3 detekteres ved immunoblot i tAd5-TIG3 inficerede SCC-13 celler. Monomeren er synlig ved 18 kDa og konsollen angiver højere molekylvægt tværbundet TIG3 [10], [11]. Molekylvægte er angivet til venstre af blottet i kDa.

TIG3 nedsætter celleproliferation ved at inhibere cellecyklusprogression

Vi næste overvåget cellecyklusprogression. Vi begyndte ved at vurdere procentdelen af ​​celler i S-fasen ved hjælp BrdU mærkning. SCC-13-celler blev inficeret med TIG3-udtrykkende virus og efter 24 timer er mærket med BrdU i 2 timer før detektion af BrdU og TIG3. Som vist i fig. 2A, 54 ± 2,8% (middel ± SEM) af EV-inficerede celler var positive for BrdU sammenlignet med 23% ± 4% af TIG3-udtrykkende celler. Som vist i fig. 2B, de mest fremtrædende cellecyklus ændringer er en reduktion i G1 og stige i subG1 begivenheder. For at undersøge den mekanisme ansvarlig for disse ændringer, vi målte niveauet af vigtige regulerende proteiner. Fig. 2C viser, at cyclinafhængige kinase (CDK1, CDK2, CDK6, cdk4) niveauer ikke ændres af TIG3, men cyclin D1 og cyclin E niveauer er faldet, og p21 niveauet hæves. Disse ændringer er i overensstemmelse med reduceret progression gennem G1-fasen og G1 /S overgang. Fig. 2D viser, at p21 mRNA niveau stiger parallelt med stigningen i p21-protein.

A SCC-13 celler dyrket på dækglas blev inficeret med 10 MOI af EV eller TIG3-kodende virus og efter 24 timer behandlet med 10 pM BrdU i 2 timer og derefter fikseret og farvet med anti-BrdU (rød) og anti-TIG3 (grøn). BrdU-inkorporering er en markør for syntesen fasen af ​​cellecyklussen. Antallet af BrdU-positive celler som en procentdel af det samlede antal celler præsenteres under hvert panel. Værdierne er gennemsnit ± SEM (n = 3), og værdierne er signifikant forskellige som bestemt ved t-test (p 0,001). Bars = 10 um. B SCC-13 celler blev opsamlet til flowcytometri ved 24 timer efter infektion med EV eller TIG3-kodende virus. Celler blev farvet med 50 ug /ml propidium før analyse iodid. TIG3 reducerer begivenheder i G1 og øger subG1 begivenheder. C Ved 24 timer efter infektion blev cellerne høstet og ekstrakter fremstillet til påvisning af regulerende proteiner. Molekylvægte er angivet til venstre af blottet i kDa. D Celler blev behandlet som ovenfor, og derefter høstet til detektion af p21 kodende mRNA ved realtid-PCR. Et lignende resultat blev observeret i hver af tre forsøg.

TIG3 inducerer apoptose

Tilstedeværelsen af ​​subG1 DNA-indhold kan være forbundet med celle apoptose. Vi vurderede dermed virkningerne af TIG3 på apoptose. Som vist i fig. 3A, TIG3 ekspression aktiverer spaltning af procaspase 9 og procaspase 3 og genererer spaltet PARP. Derudover pro-apoptotiske regulator, Bax, forøges, og prosurvival regulator, Bcl-XL, reduceres. Øget apoptose kan også iagttages

in situ

. Fig. 3B viser, at meget få spaltet PARP-positive celler i kontrolkulturerne (1 ± 1%, middelværdi ± SD), men at antallet er markant forøget i TIG3-positive (23 ± 8%) kulturer. Disse resultater sammen med stigningen i subG1 DNA-indhold (fig. 2B), tyder på, at TIG3 inducerer apoptotisk celledød.

A SCC-13 celler blev inficeret med 10 MOI af EV eller TIG3-kodning virus og efter 24 timer lysater blev fremstillet til påvisning af apoptose markører. Beslaget indikerer høj molekylvægt tværbundet TIG3 [10], [11]. Molekylvægte er angivet til venstre af blottet i kDa. B ved 24 timer efter infektion SCC-13 celler blev fikseret og farvet med anti-spaltet PARP (rød). TIG3 stigninger spaltet PARP-farvning. Procentdelen af ​​spaltet PARP-positive celler er præsenteret i hvert panel (middelværdi ± SD). Pilene angiver spaltet PARP-positive celler. Lignende resultater blev observeret i hver af tre eksperimenter.

TIG3 lokaliserer på en pericentrosomal placering og forårsager organel omfordeling

For at få indsigt i TIG3 virkningsmekanisme vi overvåget TIG3 subcellulære placering i tAd5-TIG3 virus-inficerede celler. Som vist i fig. 4A, TIG3 (grøn) akkumulerer langs cellens periferi nær plasmamembranen (pilespidser) og i en perinukleær placering (pile), og kernerne i TIG3-udtrykkende celler er reduceret i størrelse. For yderligere at vurdere TIG3 placering blev cellerne farvet til at opdage pericentrin, en centrosom markør. Billederne i fig. 4B afslører TIG3 farvning sammenstillet med pericentrin farvning (hvid pil) i nærheden af ​​kernen (n). TIG3 (grøn) lokaliseres i den generelle nærhed af pericentrin (rød) tyder akkumulering i nærheden af ​​centrosom.

A SCC-13-celler blev inficeret med 10 MOI tAd5-EV eller tAd5-TIG3 og ved 24 timer efter infektion blev fikseret og farvet med anti-TIG3 (grøn). Pile viser pericentrosomal og pilespidser angiver membran lokalisering. Nr TIG3 detekteres i tom vektor-inficerede celler. B-celler, inficeret som ovenfor, blev fikseret og farvet med TIG3 (grøn) og pericentrin (rød). Pilene angiver pericentrin farvning af centrosom og n angiver kernerne. Barer = 10 um.

centrosom er et kontrolpunkt for en bred vifte af cellefunktioner. Det fungerer som det mikrotubulus organiserende center (MTOC), som er stedet for mikrotubulussamling [24], [25]. Desuden replikerer under celledeling og datter centrosomer tjener til at organisere mitosespindler der styrer kromosom adskillelse [24], [26]. Vigtigere er det, MTOC tjener som et kontrolpunkt bevægelse af molekylær motor-bæres fragt, herunder organeller for, langs mikrotubuli [27]. Desuden er centrosom dysfunktion associeret med celle apoptose [28]. Vi undersøgte derfor, om pericentrosomal TIG3 ophobning ændrer mikrotubuli distribution. Som vist i fig. 5A, er de mikrotubuli i TIG3-negative celler spredt over hele cellen i en typisk gitter-typen netværk, der udstråler ud fra centrosom (hvid pil). I modsætning hertil i TIG3-udtrykkende celler (sort pil angiver pericentrosomal TIG3), mikrotubuli lokaliseres som et bånd (røde pile) på cellens periferi og ikke stråle ud fra centrosom, hvilket antyder, at TIG3 virkninger mikrotubulus placering og forankring. Dette er bedst observeres i fig. 5A (nedre felt), som kun viser β-tubulin farvning. Mikrotubuli i TIG3-positive celler (til venstre) mangler centrosom-baserede klynger, mens TIG3-negative celle (til højre) har centrosom-forankrede mikrotubuli (hvid pil). For at vurdere virkningen af ​​TIG3 på mikrotubuli-netværket, blev antallet af celler, som viser mikrotubuli udstrålende fra centrosom tælles. Som vist i plottet, er procentdelen af ​​celler, som viser centrosom-rettet netværk markant reduceret i TIG3-udtrykkende celler.

A SCC-13 celler blev inficeret med 10 MOI tAd5-EV eller tAd5-TIG3 og ved 24 h efter infektion blev cellerne fikseret og farvet med anti-TIG3 (grøn plet) og anti-β-tubulin (rød farve). TIG3 akkumuleres ved den forventede perinukleære placering (sort pil). β-tubulin akkumuleres i en atypisk ring i cellen periferien (røde pile). Den normale β-tubulin netværk i TIG3-negative celle er angivet ved en hvid pil, der peger til centrosom. Kerner blev Hoechst farves (blå). Bundpanelet er identisk med toppen, bortset fra at kun β-tubulin (rød) signal er indikeret. Bars = 10 uM. Grafen viser antallet af Tad-EV og tAd5-TIG3 inficerede celler med centrosom-stammer mikrotubuli arrays. Celler blev talt i tyve uafhængige mikroskopfelter og mindst ét ​​hundrede celler blev talt pr behandlingsgruppe. Værdierne er gennemsnit ± SEM. Parret t-test analyse afslører, at midlerne er signifikant forskellige (p 0,001). For at vurdere virkningen af ​​TIG3 på tubulin opløselighed blev celler inficeret med tAd5-EV eller tAd5-TIG3 og efter 24 h samlede ekstrakt, opløselige og pellet fraktioner blev forberedt og elektroforeseret efterfulgt af immunfarvning at opdage β-tubulin og β-actin. Tilstedeværelsen af ​​størstedelen af ​​β-actin i den opløselige fraktion indikerer, at fraktioneringen var vellykket. B TIG3 udtryk forårsager glødetråd actin sammenbrud omkring kernen. SCC-13-celler blev inficeret med adenovirus som ovenfor, og efter 24 timer farvet med anti-β-actin (rød farve) og anti-TIG3 (grøn plet). Kerner blev Hoechst farves (blå). For TIG3-positive celler, venstre panel viser TIG3 og p-actin-signaler (rød og grøn), medens det højre panel viser kun β-actin (rød) kanal. Den sorte pil viser TIG3 akkumuleres mindst centrosom og den røde pil angiver β-actin microfilament nuklear ring. Bars = 10 um. Plottet viser antallet af Tad-EV og tAd5-TIG3 inficerede celler viser actin Microfilament ringe omkring kernen. Celler blev talt i atten uafhængige mikroskopfelter og mindst ét ​​hundrede celler blev talt pr behandlingsgruppe. Værdierne er gennemsnit ± SEM. Parret t-test-analyse viser, at midlerne er signifikant forskellige (p 0,001).

omfordeling af tubulin til cellemembranen i TIG3-positive celler antyder, at det kan være uopløselige. For at vurdere dette, vi forberedt samlede celle ekstrakt fra TIG3-negative og positive celler og forberedt opløselige og særlige (pellet) fraktioner. Vi derefter analyseret for β-tubulin i hver fraktion ved immunoblot. Som vist i fig. 5A, er membranen lokaliseret β-tubulin ikke i pelletfraktionen, hvilket antyder, at selv om det er lokaliseret på cellens periferi ved eller nær ved membranen, forbliver opløselig.

tubulin og aktin netværk tæt samspil og så vi overvåges virkningen af ​​TIG3 på actin filament distribution (fig. 5B). I TIG3-negative celler (EV), β-actin (rød) distribuerer hele cytoplasmaet. I modsætning hertil TIG3-positive celler (grøn plet) et særskilt glødetråd actin ring formularer på det nukleare periferien (rød pil). Dette er vist i både en sammenflettede billede og β-actin-farvning alene (fig. 5B). Antallet af celler, som viser en nuklear actin ring blev talt. Plottet viser, at procentdelen af ​​celler, som viser en nuklear actin ring er markant forøget i TIG3-udtrykkende celler.

Fordi organel bevægelse og forankring afhænge af tubulin og aktin net [29], forventede vi, at TIG3 kan påvirke organel distribution. For at vurdere virkningen af ​​TIG3 på organel placering blev cellerne farvet at opdage GM130 (cis-Golgi), mannose-6-fosfat receptor (M6PR, trans-Golgi og sen endosom) [30], rab11 (genanvendelse endosomer), calnexin ( endoplasmatisk reticulum), og clathrin tung kæde (CHC, intracellulær transport vesikler). Fig. 6A viser, at GM130 (rød) lokaliseres ved en perinukleær placering i TIG3-negative og positive celler; men det forekommer mere komprimeret i TIG3-positive (grønne pletter) celler. M6PR, rab11 og calnexin også synes komprimeret på pericentrosomal placering i TIG3-positive celler (hvide pile). Dette opnås let visualiseres for calnexin, ved at sammenligne fordelingen vist i rødt enkelt farvebillede (indsæt) det observerede niveau for EV-inficerede celler (fig. 6A), som en intens pericentrosomal koncentration af calnexin observeres i TIG3-positive celler . Desuden clathrin tung kæde er en særligt dramatisk eksempel, idet farvningen vises fordelt i hele cytoplasmaet i EV-inficerede celler, men i det væsentlige alt CHC akkumuleres i nærheden af ​​centrosom i TIG3-positive celler. Det fremgår således, at TIG3 ændrer intracellulær organel fordeling på en måde, koncentrater og komprimerer mange organeller i nærheden af ​​centrosom. Denne kompaktering blev kvantificeret ved måling af todimensionale arealet, de enkelte organeller i kvadratiske mikron ved hjælp ImageJ software (fig. 6B). Denne analyse afslører en betydelig og statistisk signifikant reduktion i område for GM130, M6PR og rab11. Calnexin og CHC fordeling blev ikke analyseret på denne måde, da kondens var indlysende. Vi undersøgte også effekten af ​​TIG3 på organel proteinniveau. Fig. 7 viser, at TIG3 udtryk forårsager en beskeden reduktion i niveauet af nogle organel proteiner, herunder calnexin, rab11, GM130 og EEA1; dog niveauet af andre markørproteiner ikke ændret.

A SCC-13 celler blev inficeret med 10 MOI tAd5-EV eller tAd5-TIG3 og efter 24 timer fikseret og farvet til at opdage TIG3 (grøn) og forskellige organel markører (rød). De markører indbefatter GM130 (cis-Golgi), M6PR (mannose-6-phosphat-receptor, trans-Golgi og sen endosom), rab11 (genbrug endosom), calnexin (ER), og CHC (clathrin tung kæde, intracellulær transport vesikel). Hvide pile angiver pericentrosomal lokalisering af TIG3. Kerner farves blå. For GM130, M6PR, og rab11, alle paneler er rød /grøn /blå flettede billeder. EV og TIG3 billeder af calnexin farvning er rød /grøn /blå flettede billeder. Indsatserne i TIG3 /calnexin billede er single-farvebilleder. For CHC pletten, er det kun det røde (CHC) billede vist. Bars = 10 um. B TIG3 indvirkning på subcellulære organel distribution. For at måle organel spredning, blev mikroskopet fokuseret på z-planet viser den maksimale organel spredning og det område, som den organel blev overvåget ved hjælp ImageJ software og præsenteres som organel område i um

2. Værdierne er gennemsnit ± SEM (n = 30 felter), herunder måling af mindst tredive celler pr behandlingsgruppe. Parret t-test analyse identificerer midlet som signifikant forskellige (p 0,001).

SCC-13-celler blev inficeret med 10 MOI tAd5-EV eller tAd5-TIG3 og efter 24 h cellelysater var forberedt til immunoblot påvisning af de angivne proteiner. TIG3 udtryk reducerer niveauet af rab11, GM130 og EEA1, men ændrer ikke LAMP1 niveau. Molekylvægte er angivet til venstre af blottet i kDa.

Diskussion

TIG3 (Tazarotene-induceret gen 3) blev oprindeligt identificeret som forøget efter behandling af dyrkede epidermale keratinocytter eller psoriatisk epidermis med den syntetiske retinoid, Tazarotene [6], og blev senere identificeret i gastrisk kræftceller og kaldte RIG1 [5]. Efterfølgende undersøgelser afslører TIG3 mRNA i en række væv og celler i kultur [1], [5], [31] – [33]. TIG3 niveau øges ved retinoid behandling [4], [34] og i nogle celletyper TIG3 genekspression undertrykkes af MAPK signalering [35].

TIG3 er medlem af NIPC /P60 superfamilie af proteiner [ ,,,0],36]. Det N-terminale domæne (aa1-134) koder regioner, som er konserverede blandt medlemmer af lecithin:retinol acyltransferase (LRAT) og H-rev tumor suppressor familier [37] – [39]. Funktionel analyse af TIG3 struktur indikerer, at de C-terminale hydrofobe domæne (aa135-164) fungerer som et membran-anker [6], [23], og at den N-terminale region koder calcium-uafhængig phospholipase A1 /2-aktivitet [31] , [32], [40]. Desuden indeholder phospholipase A1 /2-aktivitet ikke kræver det C-terminale hydrofobe domæne [40]. TIG3 har vist sig at reducere celleoverlevelse i en række celletyper [6], [10], [11], [34], [41], [42], men mekanismen ansvarlig for undertrykkelse er ikke godt forstået. I nogle celletyper, kan TIG3 handle via regulering af MAPK og PI3K /Akt signalering [1], [3], [41].

TIG3 i epidermis

TIG3 udtrykkes i suprabasale differentierede lag af keratinocyt tømmerflåde kulturer [12] og i suprabasale epidermis [7], [8], og TIG3 udtryk er reduceret i hyperproliferativ hudsygdom og i huden kræftceller [6] – [9]. Retinoid behandling øger TIG3 niveau, og dette er forbundet med reduceret celleproliferation [6] – [9]. TIG3 udtrykkes ikke i normale keratinocytter opretholdt i monolagskultur og vektor-medieret TIG3 udtryk er forbundet med reduceret celleantal [8], [10] – [12]. Mekanistiske undersøgelser i keratinocytter viser, at det C-terminale membranforankringsdomæne er påkrævet for aktivitet [10], [11], [23] og at ekspression af TIG3 i normale humane dyrkede keratinocytter aktiverer udvalgte differentierings- hændelser [10] – [ ,,,0],12]. Især TIG3 interagerer med type I transglutaminase (TG1) for at øge TG1 katalytisk aktivitet [10], [11]. TG1 er et nøgleenzym i differentierende keratinocytter, der katalyserer dannelsen af ​​protein-protein krydsbindinger fører til samlingen af ​​forhornede kappe, en vigtig komponent i hudpermeabilitet barriere [43]. Fuldlængde TIG3 protein stimulerer differentiering-associeret transglutaminase-aktivitet i keratinocytter. I modsætning hertil aminoterminale trunkerede former forårsage apoptose og niveauet af apoptose er mere udtalt som den N-terminale ende forkortes [12]. Andre undersøgelser peger på unikke effekter af forskellige TIG3 subdomæner [40], [42], [44]. Den suprabasale mønster af TIG3 udtryk i epidermis er konsistent med en rolle TIG3 som controller af keratinocytdifferentiering hændelser.

TIG3 udtryk i huden kræftceller reducerer spredning og øger apoptose

Tidligere undersøgelser indikerer, at TIG3 mRNA er til stede ved reducerede niveauer i hudkræft og i huden cancercellelinier [8]. Imidlertid vides der kun lidt om, hvorvidt TIG3 regulerer hudkræft celleoverlevelse og tumorprogression. Vi viser, at ekspression af TIG3 forårsager en markant reduktion i SCC-13 celleantal, der er associeret med reduceret G1 og S events fase og forøget sub-G1 DNA-indhold. Disse ændringer cellecyklus er forbundet med TIG3-afhængige ændringer i cellecyklus regulatorisk protein niveau. TIG3 ekspression reducerer cyclin D1 og cyclin E niveauer og øger niveauet af p21 cyclin-afhængig kinase inhibitor. Disse resultater stemmer overens med en reduktion i celle progression gennem G1 /S overgang. Desuden viser vi, at TIG3 øger SCC-13 celle apoptose som det fremgår af øget produktion af aktiveret caspase 9 og 3 og øget kløvet PARP. Desuden immunfarvning undersøgelser afslører spaltet PARP ophobes i TIG3-positive celler. Disse resultater er særligt interessante da TIG3 ikke forårsager apoptosis i normale humane keratinocytter. I stedet TIG3 forårsager, at cellerne til at undergå differentiering [10] – [12]. I modsætning hertil mutantformer af TIG3 forårsage apoptose i normale humane keratinocytter [12]. Den omstændighed, at TIG3 forårsager apoptose i cancerceller foreslår en anden virkningsmekanisme i normale versus transformerede celler. Desuden er nogle af disse ændringer er forbundet med ændringer i målgen mRNA-niveau. For eksempel er TIG3-afhængig stigning i p21-protein associeret med en parallel stigning i p21 kodende mRNA, hvilket indikerer, at TIG3 regulerer p21 gentransskription eller RNA stabilitet. Vi ved ikke på nuværende tidspunkt, om denne handling er direkte eller indirekte.

TIG3 udtryk er forbundet med pericentrosomal organel klyngedannelse

Et vigtigt spørgsmål er, hvor TIG3 er lokaliseret i cellen. En interessant tidligere undersøgelse i HeLa livmoderhalskræft celler antyder, at TIG3 lokaliserer i cis- og trans-Golgi og at denne lokalisering er påkrævet for at stimulere apoptose [2]. Som vist i fig. 6A, antistof co-farvning af SCC-13 celler antyder, at TIG3 lokaliserer i cis- og trans-Golgi (GM130, M6RP), den sene endosom (M6PR), genbrug endosomet (rab11), det endoplasmatiske reticulum (calnexin) og de intracellulære transport vesikler (CHC). Men vi mener, at det er usandsynligt, at TIG3 hovedsageligt er lokaliseret i disse strukturer af flere grunde. Først TIG3 synes kun at lokalisere med organel kun i umiddelbar nærhed af centrosom og ikke mere perifert. For det andet, viser vi, at TIG3 ændrer mikrotubuli og microfilament distribution og dette er forbundet med pericentrosomal organel akkumulation. For det tredje, i en anden rapport, vi studerer fordelingen af ​​TIG3 i normale humane keratinocytter og disse undersøgelser tyder stærkt på en pericentrosomal TIG3 placering (ikke vist). Baseret på disse resultater, hævder vi, at den største effekt af TIG3 er i centrosom og at forekomsten af ​​co-lokalisering af TIG3 med organel markører er et artefakt skyldes pericentrosomal organel klyngedannelse.

Organelbiosyntese flytning er en velkendt fænomen, der forekommer under apoptose [45]. Det menes at forbedre organel membran blanding for at lette spredningen af ​​pro-apoptotiske effektorer [45] – [50]. Men hvordan disse organeller og organel fragmenter mødes under apoptose det er ikke godt forstået, men menes at involvere centrosom og mikrotubuli. Den centrosom fungerer som et mikrotubuli organisere center (MTOC) i interfase celler og som arrangør af mitoseapparat hos mitotiske celler. Som mikrotubulus kimdannelse centrum centrosom funktion kræves til intracellulær organel handel [24], [51]. Organeller bevæger sig langs mikrotubuli forbundet med specifikke motoriske proteiner [27], [51]. Tidligere rapporter implicerer mikrotubuli motorer i at bringe organel og organel fragmenter til mikrotubuli organisering center (centrosom) under apoptose [45], [52]. Disse omfatter Golgi-apparatet, endosomer, endoplasmatisk reticulum, mitokondrier og andre organeller [45], [47], [53], [54]. Den bedst karakteriserede eksempel er omfordeling af mitokondrier til Golgi-proximale mikrotubulus organiserende center i cellerne eksponeret for TNFa, oxidativt stress eller viral infektion [45]. Adskillige rapporter tyder på, at denne proces aktiverer MAPK signalering at phosphorylere kinesin lette kæde at standse mitokondrier anterograd spredning fører til akkumulering af disse organeller nær centrosom [45].

Disse tidligere rapporter beskriver pericentrosomal organel clustering som respons på behandling med vækstfaktorer, oxidativt stress eller andre stimuli [45]. Vore foreliggende undersøgelser er unikke ved, at organel klyngedannelse udløses ved ekspression af et tumor suppressor protein. Den omstændighed, at TIG3 ophobes nær centrosom tyder på, at det kan have en direkte rolle i reguleringen af ​​organel bevægelse under apoptose. Vores undersøgelser viser, at TIG3 tilstedeværelse ændrer den normale subcellulære lokalisering af mikrotubuli og mikrofilamenter, som kan være en mekanisme, hvorved det ændrer organel placering. Fremtidige studier vil nødt til at tage, om TIG3 ændrer også mikrotubuli motor-afhængige transport af organeller. Vores arbejdshypotese er, at TIG3 kan ændre både mikrotubuli distribution og mikrotubuli-baserede motorik til at forårsage pericentrosomal organel klyngedannelse. Baseret på vores analyse, TIG3 fremmer ophobning af organeller på centrosom herunder endoplasmatiske reticulum, Golgi apparatet, genanvendelse endosomer, sent endosom, og transport vesikler. Det er dog ikke alle organeller transporteret til centrosom. For eksempel, lysosomer, som målt ved påvisning af LAMP1, distribuere i arrays langs mikrotubuli og i TIG3-positive celler, er dette mønster intensiveres (ikke vist). Således vil yderligere undersøgelser være nødvendige for at forstå den rolle TIG3 i reguleringen mikrotubuli funktion og organel transport.

Materialer og metoder

Cell Kultur og adenovirusinfektion

SCC-13 celler blev opnået fra American Type Culture Collection (Rockville, MD) og blev opretholdt i højglucose DMEM (Gibco, 11.960-044) suppleret med 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 5% føtalt bovint serum (Sigma, St. Louis, MO). Adenovirus blev fremstillet som tidligere beskrevet [10]. tAd5-TIG3

1-164, er en tetracyklin-inducerbar virus, der koder for fuld-længde TIG3 protein og et tetracyclin-enhancer element [10], [11]. Ad5-TA virus koder tetracyclintransaktivatoren (TA). tAd5-EV er en tom virus anvendt som kontrol. For infektion blev cellerne vasket med PBS, inkuberet med 10 MOI på TIG3-kodning eller tom virus i nærvær af 5 MOI af Ad5-TA i DMEM indeholdende 6 ug polybren /ml (Sigma, H9268). Efter 5 timer blev mediet erstattet med virus-frit medium og inkubation blev fortsat i yderligere 24-72 timer før fremstillingen af ​​celler og ekstrakter til immunohistologi og immunoblot.

Immunologiske metoder

for immunoblot blev ekstrakter fremstillet i cellelyse-buffer (20 mM Tris-HCI, pH 7,5, indeholdende 150 mM NaCl, 1 mM ethylenglycol-bis (aminoethylether) -tetraeddikesyre, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natriumpyrophosphat, 1 mM glycerophosphat, 1 mM natriumvanadat, 1 ug /ml leupeptin (Cell Signaling, 9803, Danvers, MA) og 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse af Bradford Bio-Rad protein assay (Bio-Rad,