PLoS ONE: Sammenligning af effekt og toksicitet for traditionel kinesisk medicin (TCM) Herbal Blanding LQ og konventionel kemoterapi på lungekræft Metastase og overlevelse i mus Models

Abstrakt

I modsætning til vestlige medicin, der generelt bruger oprensede forbindelser og mål at målrette et enkelt molekyle eller sti, traditionel kinesisk medicin (TCM) sammensætninger omfatter normalt flere urter og komponenter, der er nødvendige for effekt. På trods af den meget lange tid og udbredt brug af TCM, er der meget få direkte sammenligninger af TCM og standard cytotoksisk kemoterapi. I nærværende rapport, vi sammenlignede effekten af ​​TCM urteblanding LQ mod lungekræft musemodeller med doxorubicin (DOX) og cyclophosphamid (CTX). LQ inhiberede tumor størrelse og vægt målt direkte såvel som ved fluorescerende protein billeddannelse i subkutant, ortotopisk, spontane eksperimentelle metastase og angiogenese musemodeller for lungekræft. LQ var effektiv mod primær og metastatisk lungekræft uden vægttab og organtoksicitet. I modsætning hertil CTX og DOX, selvom virkningsfuldt i lungekræft modeller forårsagede betydeligt vægttab, og organtoksicitet. LQ havde også antiangiogen aktivitet som observeret i lungetumorer vokser i nestin-drevet grønt fluorescerende protein (ND-GFP) transgene nøgne mus, som selektivt udtrykker GFP i fremspirende blodkar. Overlevelse af tumor-bærende mus blev også forlænget med LQ, der kan sammenlignes med DOX.

In vitro

blev lungekræft celler dræbt af LQ som observeret af time-lapse billeddannelse, der kan sammenlignes med cisplatin. LQ var mere potent til at inducere celledød på cancercellelinjer end normale cellelinier modsætning cytotoksisk kemoterapi. Resultaterne indikerer, at LQ har ikke-toksisk virkning mod metastatisk lungecancer

Henvisning:. Zhang L, Wu C, Zhang Y, Liu F, Wang X, Zhao M, et al. (2014) Sammenligning af effekt og toksicitet for traditionel kinesisk medicin (TCM) Herbal Blanding LQ og konventionel kemoterapi på lungekræft Metastase og overlevelse i musemodeller. PLoS ONE 9 (10): e109814. doi: 10,1371 /journal.pone.0109814

Redaktør: Beicheng Sun, The First Affiliated Hospital i Nanjing Medical University, Kina

Modtaget: Februar 7, 2014 Accepteret: September 13, 2014; Udgivet: 6 okt 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Cancer Institute tilskud CA132971 og give BA2011019 fra Jiangsu Videnskab og Teknologi Achievements Transformation tematiske særlige fonde, Kina. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Lei Zhang, Yong Zhang, Xiaoen Wang og Ming Zhao er datterselskaber af AntiCancer Inc. Fang Liu var en tidligere datterselskab af AntiCancer Inc. Robert M. Hoffman er en ikke-lønnet datterselskab af AntiCancer Inc. AntiCancer Inc. markedsfører dyremodeller for kræft. Der er ikke andre konkurrerende interesser. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft døden med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tegner sig for ca. 80% af thorax maligniteter. Den samlede overlevelse for NSCLC 5 år forbliver fattige, ca. 16%. Lungekræft har vist en lille forbedring i overlevelse for de sidste 30 år [1]. er et presserende behov Nye tilgange til behandling af lungekræft. Natur produkter er vigtige ressourcer for lægemiddeludvikling. For kræftsygdommen, 60% af nye lægemidler, stammer fra naturlige kilder. Der er i øjeblikket stigende interesse for traditionel kinesisk medicin (TCM) naturlægemidler blandinger, der har været anvendt til behandling af cancer i tusinder af år i Kina. I modsætning til vestlige medicin, der generelt bruger oprensede forbindelser og har til formål at målrette en enkelt molekyle eller sti, TCM sammensætninger omfatter normalt flere urter og komponenter. Der er meget anekdotiske beviser for virkningen af ​​TCM i form af naturlægemidler blandinger i kræftpatienter [2] – [9].

I en tidligere undersøgelse, vi bestemt den hæmmende effekt af TCM urt Celastrus orbiculatus Thunb . (COT) på tumorvækst, metastase og antiogenesis af hepatocelluar carcinom (HCC) Hep-G2-celler i en ortotopisk nøgen musemodel anvendelse af fluorescens imaging teknologi. Hele kroppen fluorescensimagografi blev udført for at måle tumorvækst og overvåge metastase udvikling. Højdosis, tidlig behandling med COT viste signifikant effekt på styring tumorvolumen og tumorvægt i den humane HCC Hep-G2 ortotopisk tumormodel [4].

Effektiviteten af ​​TCM urt tubeimu, ekstraheret fra knolden af anlægget

Bolbostemma paniculatum

blev testet på MDA-MB-231 humane brystkræftceller

in vitro

. MDA-MB-231-cellelinie blev manipuleret til at udtrykke RFP i cytoplasmaet og GFP knyttet til histon H2B i kernen, hvilket muliggør imaging i realtid af nuklear-cytoplasmatiske dynamik. Apoptose blev let visualiseres i disse celler ved nukleare ændrer form og fragmentering. De MDA-MB-231 RFP-GFP-celler blev dyrket enten i to dimensioner på plast eller i tre dimensioner på Gelfoam. Celler blev behandlet med en dichlormethan ekstrakt af frisk tubeimu. Tubeimu induceret apoptose af MDA-MB-231-celler, som iagttaget ved hjælp af fluorescensmikroskopi, så tidligt som 24 timer efter behandling in vitro i todimensionale kultur. Ved 48 timers behandling, kunne DNA-fragmentering observeres. Tubeimu også induceret apoptose af MDA-MB-231-celler i tredimensionel kultur på Gelfoam, men i mindre grad end i 2D kultur [5].

Trods den meget lang historie og udbredt anvendelse af TCM, er der meget få direkte sammenligninger af TCM og standard cytotoksisk kemoterapi. Vi har tidligere udviklet en TCM formulering af urter, LQ, der har vist sig at have potente ikke-toksiske terapeutiske egenskaber i klinisk og i ortotopisk musemodeller for pancreascancer [6]. Vi sammenlignede LQ til gemcitabin, hvilket er første-line behandling for kræft i bugspytkirtlen for anti-metastatisk og anti-tumor-aktivitet samt sikkerhed. Den terapeutiske effekt af LQ var sammenlignelig med gemcitabin, men med mindre toksicitet [6].

I denne rapport, vi brugte state-of-art fluorescens imaging teknologi og dyremodeller til at sammenligne effekt og toksicitet LQ til doxorubicin (DOX) og cyclophosphamid (CTX) på lungekræft. Med brugen af ​​GFP og /eller RFP stabilt udtrykt i humane cancerceller eller mus, blev effekten af ​​LQ sammenlignet med standard kemoterapi på tumor og metastatisk vækst samt angiogenese.

Vi viser her, at LQ har antitumor , anti-metastatisk og antiangiogen effekt i klinisk relevante musemodeller af lungekræft kan sammenlignes med doxorubicin og cyclophosphamid, uden deres giftighed.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Alle dyreforsøg blev udført med et anticancer Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) -protokol specifikt er godkendt til denne undersøgelse, og i overensstemmelse med de principper og procedurer, der er beskrevet i National Institute of Health guide for pasning og anvendelse af dyr under Assurance Nummer A3873-1. For at minimere enhver lidelse af dyrene blev anvendt anvendelsen af ​​bedøvelse og analgetika for alle kirurgiske eksperimenter. Dyr blev bedøvet med en blanding af ketamin (22-44 mg /kg), acepromazin (0,75 mg /kg), og xylazin (2-5 mg /kg) 20 pi ved intramuskulær injektion 10 minutter før operation. Svaret fra dyr under operationen blev overvåget for at sikre tilstrækkelig dybde af anæstesi. Ibuprofen (7,5 mg /kg oralt i drikkevandet hver 24. time i 7 dage efter kirurgi) blev anvendt for at tilvejebringe analgesi postoperativt i de kirurgisk behandlede dyr. Dyrene blev observeret dagligt og humant aflives ved CO

2 inhalering, da de mødtes følgende humane endpoint kriterier: udmattelse, hudlæsioner, betydelig krop vægttab, åndedrætsbesvær, næseblod, roterende bevægelse og kropstemperatur dråbe. Anvendelsen af ​​dyr var nødvendig for at forstå den in vivo-effektivitet, især anti-metastatisk virkning af de testede midler. Dyrene blev anbragt med ikke mere end 5 pr bur. Dyrene blev anbragt i en barriere facilitet på en højeffektiv partikler luft (HEPA) -filtered rack under standardbetingelser af 12-timers lys /mørke-cykler. Dyrene blev fodret en autoklaveret laboratorium gnaver kost.

cellelinjer og cellekultur

menneskelige lunge kræft cellelinier H460 [12], A549 [13], mus Lewis lungekræft (LLC) [ ,,,0],14], og abe normal nyre endotelcelle linje (VERO) [15] blev holdt i RPMI-1640 (HyClone, South Logan, UT) med 10% føtalt bovint serum (Gemini Bio-Products, Calabasas, CA). Human navlevene-endotelceller (HUVEC) [16] blev opretholdt i EGM-2 Bulletkit medium (Lonza, Anaheim, CA).

LLC-celler stabilt udtrykt rødt fluorescerende protein (RFP), som tidligere beskrevet [10] , [11]. H460 celler, der stabilt udtrykte grønt fluorescerende protein (GFP), som tidligere beskrevet [12], [17] – [19]. H460 dual-farve celler udtrykte GFP knyttet til histon H2B i kernen som beskrevet tidligere [20] – [22].

Mus

athymiske nøgne mus (

nu /nu

) og C57BL /6-mus (AntiCancer Inc., San Diego, CA), 6-8 uger gamle, blev anvendt i denne undersøgelse. Nestin-drevet-GFP (ND-GFP) transgene C57 /B6 nøgne mus (AntiCancer, Inc.), der udtrykker GFP under kontrol af den nestin promotor blev også anvendt [23] – [26]. Ikke-transgen C57 B /6-mus (Anticancer, Inc.) blev også anvendt.

Subkutan

tumorvækst

A549, H460, LLC, og H460-GFP-celler blev høstet ved trypzinization og vasket to gange med phosphatbufret saltvand (PBS) (HyClone, South Logan, UT). Celler (5 x 10

6) blev injiceret subkutant i den højre flanke af musene i et samlet volumen på 100 pi PBS inden for 30 min af høsten. De subkutane tumorer blev også anvendt som kilden til væv til ortotopisk implantation i lungen.

Kirurgisk ortotopisk implantation (SOI)

tumorstykker (1 mm

3) afledt af H460- GFP subkutane tumorer vokser i nøgne mus blev implanteret ved kirurgisk ortotopisk implantation (SOI) [27] på venstre visceral lungehinden i kohorter af yderligere nøgne mus [12], [28] – [30]. Musene blev bedøvet ved Isofluran inhalation. En lille 1 cm tværgående incision blev foretaget på den venstre laterale brystet af de nøgne mus via den fjerde interkostale rum. Et lille indsnit (0,4-0,5 cm) mellem den tredje og fjerde ribben på brystvæggen givet adgang til det pleurale rum og resulterede i total lunge sammenbrud. Tumor fragmenter (1 mm

3) blev syet sammen med en 8-0 kirurgisk sutur og fast ved at gøre en knude. Lungen blev taget op af en pincet, og tumoren fragment syet ind i den nedre del af lungen med én sutur. Lungevævet blev derefter genindsat i brysthulen. Brystmusklerne og hud blev lukket med en 6-0 kirurgisk sutur. Lukkede tilstand brystvæggen blev undersøgt straks og, hvis en lækage fandtes, det blev lukket ved supplerende suturer. Efter lukning af brystvæggen, lunge var un-oppustet ved at trække luft fra brystet hulrum med en 25-gauge ½ nål. Efter tilbagetrækningen af ​​luft, kan en helt oppustet lunge ses gennem den tynde brystvæggen af ​​musen. Derefter blev hud og bryst muskel den lukket med en 6-0 kirurgisk sutur i ét lag. Alle procedurer af den ovenfor beskrevne operation blev udført med en 7 × mikroskop [12].

Eksperimentel metastase syngen musemodel

LLC-RFP-celler (2 x 10

6) blev høstet ved trypsinisering og vasket med kold PBS, derefter injiceret i halevenen hos nøgne eller C57B /6 mus i et totalvolumen på 100 pi med en 1 ml 29-gauge, latexfri sprøjte inden for 30 minutter høst. Podningen og standsning af enkelte cancerceller på lungen, blev akkumulering af cancer-celle emboli, levedygtighed cancer-celle, og metastatisk kolonidannelse afbildet ved 14 dage efter celleinjektion [31]. Individuelle billeder af udskårne lunger fra mus i den eksperimentelle metastase model blev opnået med OV100 Mindre Husdyrs Imaging System (Olympus Corp., Tokyo, Japan). Det samlede fluorescens område og lungevægt rød blev målt for metastatisk byrde. Billederne blev analyseret ved hjælp af Imaging-Pro plus 6,0 software (MediaCybernetics Inc., Rockville, MD).

Farvekodet angiogenese model

ND-GFP transgene nøgne mus, 6 til 8 uger gamle , blev anvendt. Musene blev bedøvet og RFP-udtrykkende LLC-celler (5 x 10

5 celler i 25 pi) blev injiceret ind i huden på øret og trædepude af nøgne mus ND-GFP med en 1 ml 27G½ latexfri sprøjte [ ,,,0],32]. Den samlede længde af GFP-udtrykkende blodkar og fluorescensintensiteten blev kvantificeret. Billederne blev analyseret med Imaging-Pro plus 6,0 software (MediaCybernetics Inc.).

Vurdering af effekt

in vivo

Effekten af ​​behandlingen blev bestemt ved standard målinger af tumor volumen og tumorvægt i de subkutane modeller. Tumor volumen blev beregnet ved hjælp af formlen (lang diameter × korte diameter

2) /2. I de ortotopisk modeller, Musene blev aflivet og undersøgt, da de optrådte pre-morbid. Efter eutanasi, hver mus undergik laparotomi og mediansternotomi og blev derefter afbildes for at identificere primære og metastatiske tumorer ved billeddannelse RFP eller GFP-fluorescens. Den OV100 Mindre Husdyrs Imaging System blev anvendt [33]. Efter at have udført hele kroppen, åben billedbehandling, blev de faste organer grundigt undersøgt for tegn på metastaser. Kropsvægt, struktur observation orgel, og generelle udseende hver mus blev overvåget og registreret som tegn på systemisk toksicitet

Hæmatoxylin og eosin (H

Atractylodes macrocephale:

rod;

Coix Lacryma-JOBI:

kerne;

Polyporus adusta

: hele svampe. Vi fulgte US farmakopéer UPS231 for heavy metal test. Alle urterne blev testet og niveauerne af tungmetaller lå under den amerikanske farmakopé mindste daglige dosis. Hver urt blev ekstraheret i kogende vand i 20 minutter, blev opløsningen filtreret. Resten blev ekstraheret med 75% ethanol, og ekstrakten blev filtreret. Både vand ekstrakt og ethanolekstrakt blev kombineret og koncentreret ved lyofilisering. For at få 100 mg LQ krævede 402 mg tørrede urter. Det lyofiliserede pulver blev suspenderet i PBS. Blandingen blev hvirvelbehandlet i 1 min og inkuberet ved 80 ° C i 30 min. Prøven blev afkølet til stuetemperatur og blev derefter centrifugeret ved 2000 rpm i 10 min. Supernatanten blev opsamlet i en slutkoncentration på 90 mg /ml. LQ blev derefter fortyndet til dosis omfattende eksperimenter i musemodeller eller filtreres gennem et 0,2 um membran til

in vitro

brug.

In vivo

dosering var ved tvangsfodring.

Narkotika

Doxorobucin (DOX) (Bedford Laboratories, Bedford, OH), cyclophosphonate (CTX) (SIGMA, St. Louis, MO), Pingxiao (PX) (CP Pharmaceutical Co., Ltd., Xian, Kina), cisplatin (CDDP) (DONG-A Pharmaceutical Co., Seoul, Korea), og paclitaxel (Taxol) (Bedford Laboratories, Bedford, OH ) blev anvendt.

Time-lapse billeddannelse af H460 dual-farve celler

En FluoView FV1000 konfokal laser mikroskop (Olympus Corp., Tokyo, Japan) blev anvendt til billedet H460 dual-farve celler behandlet med LQ og CDDP for time-lapse billeddannelse. billeder i høj opløsning blev taget til fange direkte for en 72-timers periode med 30 min intervaller ved 37 ° C.

MTS assay

Cellerne blev udsat for forskellige koncentrationer af LQ og kemoterapeutiske midler til 72 timer. Antallet af levedygtige celler blev efterfølgende bestemt ved anvendelse af Cell Titer 96 Vandig One Solution Cell Proliferation assay (Promega, Madison, WI) som beskrevet i vejledningen.

Statistisk analyse

Data blev vurderet ved hjælp af den studerendes

t

-test. Kaplan-Meier-analyse med en log-rank test blev anvendt til bestemmelse overlevelse og forskelle mellem kontrol- og behandlingsgrupper. En

s Drømmeholdet værdi af ≤0.05 blev defineret som statistisk signifikant.

Resultater og Diskussion

Sammenligning af effekten af ​​LQ og CTX på subkutane musemodeller for lungekræft

Vi testede effekten af ​​forskellige doser af LQ og CTX på forskellige lungekræft cellelinier

in vivo

. H460, A549, og LLC-celler vokser subkutant i 7 dage i nøgne mus blev behandlet med enten LQ (150, 300, og 600 mg /kg) i 10 dage, TCM urteblanding PX [34] (600 mg /kg, dagligt sonde) i 10 dage, eller CTX (30 mg /kg /dosis daglig ip) i 7 dage. I kontrolgruppen fik musene givet PBS ved oral indgivelse. Tumorvækst måles ved størrelsen var signifikant inhiberet af LQ i doser på 150 mg /kg, 300 mg /kg, og 600 mg /kg i en dosisafhængig måde (figur 1A-F) (alle p 0,01). Final tumor vægt var også signifikant reduceret efter LQ behandling på alle doser (alle p 0,01) (Figur 1G). CTX og PX også inhiberede tumorstørrelse og tumorvægt betydeligt, sammenlignet med kontrolmusene (alle p 0,01) (. Figur 1A-G). LQ (600 mg /kg) var mere effektivt end PX (600 mg /kg) baseret på tumorstørrelse og vægt (alle p 0,01). (. Figur 1D, E, F og G)

I den H460 og A549-cellelinier, hver behandlingsgruppe indeholdt 6-mus og 10 mus blev anvendt til de ubehandlede kontrolgrupper. For LLC cellelinie, hver behandlingsgruppe indeholdt 8 mus og 16 mus blev anvendt til den ubehandlede kontrolgruppe. Efter de subkutane tumorer voksede, blev nøgne mus gives enten CTX (30 mg /kg /dag i.p.) i 7 dage eller PX (600 mg /kg /dag p.o.) i 10 dage. PBS (po), blev anvendt i kontrolgruppen. Mus blev behandlet ved 150, 300, og 600 mg /kg /dag af LQ (po) i 10 dage. Tumorstørrelse blev målt to gange om ugen. Tumorvægt blev målt ved endepunktet. Statistisk signifikans mellem grupperne blev bestemt med Students

t

-test. H460 (A F) havde vækstinhibering og tumorstørrelse inhibering efter behandling med alle midler. Tumoren vægt var også signifikant hæmmet af alle agenter (G) (

p

0,01). Efter LQ behandling blev lunge tumorvækst og tumorvægt signifikant hæmmet sammenlignet med den ubehandlede kontrolgruppe i alle modeller (

s

0,01). CTX og PX behandling resulterede i en signifikant inhibering af tumorvægt (

P

0,01) sammenlignet med kontrolgruppen for alle cellelinier. LQ havde mere effekt end PX (

s

0,05) på alle cellelinjer (G). CTX induceret tab af kropsvægt (

s

0,05)., Men ikke LQ eller PX (H)

blev observeret Kropsvægten og generelle udseende hver mus under forsøgene og ved slutpunktet. Det kropsvægt i CTX-behandlede mus faldt betydeligt efter behandling (

s

0,05) og genvundet langsomt efter ophør behandling. Der var imidlertid ikke noget fald på kropsvægt i LQ grupper med alle doseringer. (Fig. 1H). Hjerte, lever, milt, lunge, nyre og tarm hos en mus fra hver gruppe (ubehandlet kontrol LQ og CTX) blev farvet med H vi anvendte 600 mg /kg LQ (daglig gavage) på H460 humane lungecancer-cellelinie. Vi testede H460-GFP celler, der vokser subkutant i forhold til H460 parentale cellelinje i nøgne mus behandlet med LQ. Vi anvendte DOX (7,5 mg /kg i.v., to gange om ugen i tre gange) som den positive kontrol til at sammenligne med LQ. I kontrolgruppen blev musene givet PBS til oral indgivelse. Tumorafbildning (figur 3D, E F) og caliper måling (. Figur 3A) viste, at tumorvækst blev inhiberet efter LQ og DOX behandling (P-værdi = 0,029, P-værdi = 0,005, henholdsvis), sammenlignet med kontrolmusene . Endelig tumorvægt var også signifikant inhiberet efter LQ behandling og DOX behandling sammenlignet med PBS-kontrol (

s

= 0,037,

s

= 0,01 hhv.) (Fig. 3B). Men DOX resulterede i et betydeligt tab i kropsvægt, sammenlignet med de LQ-behandlede dyr (

s

= 0,002) og til de ubehandlede kontroller (p = 0,001) (fig. 3C). I modsætning hertil blev der ingen signifikant kropsvægttab fundet i LQ-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen (fig. 3C). Dataene foreslog også, at H460-GFP og H460 parentale cellelinje viste ingen forskel på vækst hos mus og reaktion på LQ.

Fem mus blev anvendt i hver gruppe. Efter de subkutane tumorer voksede til 100 mm

2 blev nøgne mus gives enten DOX (7,5 mg /kg i.v.) (to gange om ugen i 3 gange). PBS (po), LQ (600 mg /kg daglig po). Tumorstørrelse og kropsvægt blev målt hver dag. Tumorvægt blev målt ved endepunktet. Statistisk signifikans mellem grupperne blev bestemt med Students

t

-test. Efter LQ behandling blev lunge tumorvækst og tumorvægt signifikant inhiberet (

P

0,01), sammenlignet med den ubehandlede kontrolgruppe. DOX behandling resulterede også i en signifikant tumorvækst og vægt hæmning i forhold til de ubehandlede kontroller (

P

0,01). Den DOX-behandlede mus havde en betydelig krop-vægttab i forhold til LQ-behandlede og ubehandlede kontroller (

P

0,01). *

s

0,05; **

s

0,01. Billeder af H460-GFP tumorer i levende mus fra det subkutane nøgen-musemodel er vist for de forskellige behandlingsgrupper, og ubehandlet kontrol (D); LQ (E); og DOX (F).

Sammenligning af LQ og DOX effekt på H460-GFP menneskelig lungekræft ortotopisk model

For at bestemme den anti-metastatisk effekt af LQ, en ortotopisk nøgen -mouse model af human lungecancer, blev H460-GFP anvendes [12]. Åbne billeder af tumorer i lunger fra behandlede og ubehandlede mus er vist i fig. 4C-E. Tumorstørrelse blev inhiberet af LQ og DOX (alle p 0,01) (. Figur 4A). Tumor vægt blev signifikant reduceret i LQ-behandlede mus (600 mg /kg daglig sonde) sammenlignet med PBS-kontrolgruppen (

s

= 0,0041) (fig. 4A). DOX (7,5 mg /kg i.v., to gange om ugen i tre gange) også inhiberede tumorvægt (

s

0,0001) (. Figur 4A). DOX i signifikant vægttab i forhold til den ubehandlede kontrol (

s

0,001) (. Figur 4B). I modsætning hertil blev der ingen signifikant kropsvægttab findes i LQ-behandlede dyr sammenlignet med den ubehandlede kontrol (fig. 4B). Der var ingen metastase fundet i kontrolgruppen.

Ti mus blev anvendt i hver gruppe. H460-GFP-fragmenterne fra tumorer dyrket subkutant (1 mm i diameter) blev høstet og implanteret ved kirurgisk ortotopisk implantation (SOI) i den venstre lunger nøgne mus. De nøgne mus blev givet enten PBS (po); DOX (7,5 mg /kg i.v. to gange om ugen i 3 gange fra dag 7) eller LQ (600 mg /kg /dag po dagligt. Fra dag 7). Legemsvægt blev målt hver dag. Tumorvægte blev målt ved endepunktet. Statistisk signifikans mellem grupperne blev bestemt med Students

t-t

est. Lung tumorvækst blev signifikant hæmmet af LQ (

s

0,01), uden vægttab. DOX hæmmede lunge tumorvækst (

s

0,001), men inducerede signifikant vægttab i forhold til at styre mus (

s

0,001). Åbne billeder af H460-GFP tumorer i orthotopisk nøgen musemodel er vist for de forskellige behandlingsgrupper og ubehandlede kontrol (C); LQ (D); og DOX (E).

Resultaterne ovenfor angivne LQ kan hæmme betydeligt ortotopisk lunge tumor vækst uden toksicitet modsætning DOX, som forårsagede signifikant vægttab.

Effekten af ​​LQ på eksperimentel lunge cancermetastase i nøgne mus og i immun-kompetente C57BL /6-mus

Vi testede anti-metastatisk effekt af LQ i forsøgsmodeller musemodeller. RFP-udtrykkende Lewis lungecarcinomceller (LLC-RFP) celler blev injiceret i.v. i både nøgen og C57BL /6 immun-kompetente mus for at opnå eksperimentel metastase. Individuelle billeder af udskårne lunger fra musene blev opnået. Lungerne i den ubehandlede kontrolgruppe blev udvidet, og farven var mørkerød grund af størrelsen af ​​tumoren. De LQ-behandlede dyr havde rosa lunger med væsentligt reduceret størrelse i forhold til ubehandlede kontroller. Den røde fluorescens intensitet og område på grund af tilstedeværelsen af ​​LLC-RFP tumor blev reduceret i de LQ-behandlede mus sammenlignet med de ubehandlede kontrolmus (

s

0,01) (. Fig 5A-B). LQ ligeledes inhiberede tumor kolonisering i lungen i både nøgne og C57BL /6-mus (fig. 5A-B). Reduceret samlede lunge vægt i LQ-gruppen, sammenlignet med den ubehandlede kontrol, også indikeret reduceret tumor kolonisering i både LQ-behandlede nøgen og C57BL /6 mus (

s

= 0,001 og

s

= 0,01, henholdsvis) (fig. 5C-D). Det samlede areal af rød fluorescens af lungen blev beregnet. Det fluorescerende område korreleret med lungevægt. Den samlede RFP tumor areal i LQ-behandlede mus var 4% og 20%, i forhold til deres nøgen eller C57BL /6 kontrol, henholdsvis (alle

s

værdi 0,001) (. Figur 5E). Resultaterne indikerede, at LQ signifikant kan inhibere tumor kolonisering i lungen og derved indikerer anti-metastatisk virkningsfuldhed.

Seks mus blev anvendt i hver gruppe. Individuelle billeder af udskårne lunger fra musene i den eksperimentelle metastase-model blev opnået. LLC-RFP cancerceller (2 × 10

6) injiceret i halevenen hos nøgne mus eller C57BL /6-mus. Fra dag 2 blev musene givet PBS (po) hver dag som den ubehandlede kontrol. Mus blev behandlet med LQ (600 mg /kg /dag po) i 10 dage. De LQ-behandlede mus havde betydeligt reduceret lunge vægt (

s

0,001) og reducerede rød fluorescens område i lungen (

s

0,001) i forhold til de ubehandlede PBS kontroller. A og B er billeder af lungerne. C-D er lungevægte. E er den samlede rød fluorescens område.

LQ forlænget overlevelse af tumorbærende dyr Salg

LQ signifikant forlænget overlevelse af mus med orthotopisk-implanteret H460 lungecancer samt i mus med LLC lungemetastasen. Median-overlevelse steget fra 26 dage i de ubehandlede kontroldyr til 30,3 dage i mus behandlet med LQ (

s

= 0,005), til 33,4 dage i mus behandlet med DOX i ortotopisk lungekræft model (

p

= 0,0001) (fig. 6A, C). I den eksperimentelle metastase model blev median overlevelse steget fra 14 dage i de ubehandlede kontroldyr til 20 dage i LQ-behandlede mus (p = 0,001) og 22 dage i DOX-behandlede mus (

s

0,001) (fig. 6B, C). LQ forlængede overlevelsen af ​​tumorbærende dyr sammenlignes med DOX.

Ti mus blev anvendt i hver gruppe. LQ signifikant øget overlevelse i både de ortotopisk (

p

= 0,015) og eksperimentel metastase (

p

= 0,001) modeller. DOX også signifikant forøget (

s

0,001). Overlevelse i begge modeller

Destruktion af tumor blodkar af LQ

I ND-GFP musemodel, kun nye blodkar induceret af tumoren express nestin-driven GFP. Observation med FV-1000 imaging system viste, at blodkarrene i tumoren var meget tætte og sammenvævet at danne et blodkar netværk (fig. 7A). Efter LQ behandling blev GFP blodkar i LLC-RFP tumorer i øret og trædepuden alvorligt beskadiget (fig. B). GFP blodkar fragmenteret i forskellige områder af tumoren, og tumor nekrose iagttoges. Samlet fluorescerende område, integreret optisk intensitet og længde og tæthed af GFP blodkar blev kvantificeret. Resultaterne viste, at tumor blodkar blev reduceret til -50% af kontrol (

s

0,05) efter LQ administration (Fig 7C).

LLC-RFP celler blev dyrket i nestin-. drevet GFP (ND-GFP) transgene nøgne mus, hvori blodkar spirende udtrykte GFP. Tre mus blev anvendt i hver gruppe. I LQ-behandlede mus, tumor blodkar syntes at blive ødelagt. GFP fluorescens af blodkar blev kvantificeret for området, tæthed, integreret optisk densitet (IOD), længde og tæller. Målingerne viste, at LQ faldt blodkar med 50%.

LQ-induceret kræft celledød

in vitro

H460 dual-farve celler, der udtrykker GFP i kerne og RFP i cytoplasmaet blev dyrket i 35 mm peri-skål behandlet med LQ eller CDDP. Celleproliferation blev afbildet hver 4. time i 72 timer. Celleproliferation blev fuldstændig inhiberet af LQ. Efter behandlingen var der ingen mitose. H460 dual-color celler behandlet med LQ faldt i størrelse. Cytoplasmaet skrumpede på et tidligt tidspunkt og forsvandt, men kernerne forblev (fig. 8A, B, D). Ved sene stadier, kerner fragmenteret. I CDDP-behandlede H460 dual-color celler blev apoptotiske celler og få prolifererende celler observeret (fig. 8C). Ca. 60% af cellerne apoptotiske med 36-timers tidspunktet. Fragmenterede kerner blev observeret, men havde en anden udseende end i celler behandlet med LQ. LQ kan udløse en anden celledød mekanisme end apoptose induceret af CDDP. Yderligere undersøgelser vil blive udført i fremtiden. Salg

A og B) ubehandlede kontrolceller ved 0 time og 36 timer. C) CDDP-behandlede celler ved 36 timer. D) tidsforskydningen billeddannelse af LQ-behandlede H460 celler ved 4, 24 og 72 timer. Celleproliferation blev inhiberet. Celleproliferation angivet med gule pile. Apoptotiske celler angivet med grønne pile. Blå og røde pile angiver ændringer i det samme område.

Sammenligning af effekten af ​​LQ og kemoterapi på kræft celledeling

in vitro

H460, A549, og LLC spredning blev testet

in vitro

med LQ og sammenlignet med CDDP, DOX, og paciltaxel (fig. 9A-D). Alle cellelinier var følsomme for LQ i et lignende mønster. IC

50 var mellem 0,36 mg /ml til 0,45 mg /ml (Fig. 9a). H460, A549, og LLC spredning blev også hæmmet af CDDP, paciltaxel, og DOX (fig. 9B-D) med IC

50 mellem 5~25 uM, 1~5 uM og 5~25 uM hhv. Imidlertid normale cellelinier HUVEC og VERO var, modstandsdygtig over for LQ med en IC

50 ca. 9 mg /ml (mere end 20 gange mindre følsom end cancercellerne).