PLoS ONE: Aberrant glycogensyntasekinase 3β er involveret i kræft i bugspytkirtlen Cell Invasion og Modstand mod Therapy

Abstrakt

Baggrund og formål

De største hindringer for behandling af kræft i bugspytkirtlen er den meget invasive kapacitet og modstand mod kemo- og stråleterapi. Glycogensynthasekinase 3β (GSK3p) regulerer flere cellulære veje og er impliceret i forskellige sygdomme, herunder kræft. Her undersøger vi en patologisk rolle for GSK3p i den invasive og behandlingsresistent fænotype af kræft i bugspytkirtlen.

Metoder

bugspytkirtelkræftceller blev undersøgt for GSK3p udtryk, phosphorylering og aktivitet ved hjælp af Western blotting og

in vitro

kinaseassay. Virkningerne af GSK3p hæmning om kræft celle overlevelse, spredning, invasiv evne og modtagelighed for gemcitabin og strålebehandling blev undersøgt efter behandling med en farmakologisk inhibitor eller RNA-interferens. Effekter af GSK3p hæmning om kræft celle xenografter blev også undersøgt.

Resultater

bugspytkirtelkræftceller viste højere ekspression og aktivitet af GSK3p end ikke-neoplastiske celler, der var forbundet med ændringer i dens differential fosforylering . Hæmning af GSK3p væsentligt reduceret spredning og overlevelse af kræftceller, lysfølsomme dem at gemcitabin og ioniserende stråling, og svækket deres migration og invasion. Disse virkninger var forbundet med fald i cyclin D1 udtryk og Rb fosforylering. Inhibering af GSK3p ændres også den subcellulære lokalisering af Rac1 og F-actin og den cellulære mikroarkitektur, herunder lamellipodia. Sammenfaldende med disse ændringer var den reducerede sekretion af matrixmetalloproteinase-2 (MMP-2) og nedsat phosphorylering af fokal adhæsionkinase (FAK). Virkningerne af GSK3p hæmning på tumor invasion, følsomhed over for gemcitabin, MMP-2 ekspression og FAK fosforylering blev observeret i tumorxenoplantater.

Konklusion

målretning af GSK3p repræsenterer en effektiv strategi til at overvinde dobbelte udfordringer i invasiv og behandling modstand i bugspytkirtelkræft

Henvisning:. Kitano A, Shimasaki T, Chikano Y, Nakada M, Hirose M, Higashi T, et al. (2013) Afvigende glycogensyntasekinase 3β er involveret i kræft i bugspytkirtlen Cell Invasion og Resistance til terapi. PLoS ONE 8 (2): e55289. doi: 10,1371 /journal.pone.0055289

Redaktør: Sharmila Shankar, University of Kansas Medical Center, USA

Modtaget: August 22, 2012; Accepteret: December 20, 2012; Udgivet: 8. februar, 2013 |

Copyright: © 2013 Kitano et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud-in-Støtte til videnskabelig forskning fra det japanske ministerium for uddannelse, videnskab, sport, teknologi og kultur; Japan Society for fremme af Science (til KK, TM); Japan Society for Technology (til KK, TM); Den Extramural Forskningssamarbejde Tildeling af Kanazawa University Cancer Research Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er et stort sundhedsproblem på grund af en samlet 5-års overlevelse på mindre end 10 [1]%. Det er kendetegnet ved den meget proliferative og invasive kapacitet af tumorcellerne og en stærk disposition for metastase [2] – [4]. Den aggressive natur af pancreascancer hæmmer tidlig diagnosticering og kurativ kirurgisk indgreb og gør det resistent over for kemoterapi og stråling [3], [4]. Den udbredte terapi er infusion gemcitabin, selv om færre end 20% af patienterne reagerer på denne behandling [3], [4]. Hidtil ukendte terapeutiske strategier, der forbedrer virkningerne af gemcitabin og dæmpe invasive egenskaber af bugspytkirtelkræftceller er nødvendige. Molekylære mål-rettet terapi er opstået og omfatter målretning af vækstfaktorreceptorer angiogen faktor /receptor og matrixmetalloproteinaser, da disse er aberrerende udtrykt i pancreascancer [2] – [4]. Adskillige kliniske forsøg med bugspytkirtelkræft har allerede rettet disse vækstfaktorer, enten som monoterapi eller i kombination med gemcitabin, men de fleste har vist lille eller ingen terapeutisk fordel [5]. Identifikation af nye molekylære mål, der kunne forbedre de terapeutiske virkninger af gemcitabin og stråling er derfor en høj prioritet [6].

Glycogensynthasekinase 3β (GSK3p) er en serin /threoninproteinkinase, der regulerer flere signalveje [ ,,,0],7]. Baseret på dets kendte funktioner og involvering i primære patologier, har GSK3p været inddraget som et terapeutisk mål for glucose intolerance, neurodegenerative lidelser og inflammation [8]. Vi har tidligere demonstreret, at deregulerede ekspression, aktivitet og phosphorylering af GSK3p er særskilte træk ved gastrointestinale cancere og glioblastom og at GSK3p opretholder overlevelse og proliferation af disse tumorceller. En rolle for afvigende GSK3p i disse tumortyper understøttes af den iagttagelse, at farmakologisk inhibering af dets aktivitet reducerer overlevelse og proliferation af cancerceller og prædisponerer dem til apoptose

in vitro

i tumorxenoplantater [9] – [ ,,,0],12]. Selv om dens rolle i kræft stadig debatteres [13], de overordnede resultater hidtil viser, at afvigende udtryk og aktivitet af GSK3p er en almindelig og grundlæggende kendetegn i et bredt spektrum af kræft (revideret i [14]).

Baseret på tidligere undersøgelser som viste inddragelse af GSK3p i NF-KB-medieret celleoverlevelse [15], blev GSK3p sig at understøtte overlevelse bugspytkirtelkræftceller via denne pathway [16], [17]. Selvom GSK3p er en vigtig regulator af celle polarisering og migration under fysiologiske processer såsom væv udvikling og sårheling [18], er meget lidt kendt om sin rolle i migration og invasion af kræftceller. Her undersøgte vi potentialet inddragelse af GSK3p i den invasive karakter af kræft i bugspytkirtlen og dens modstand mod gemcitabin og ioniserende stråling, de to store hindringer for mere effektiv behandling.

Materialer og metoder

Etik Statement

skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter med kræft i bugspytkirtlen før operation. Denne undersøgelse blev godkendt af Medical Ethics Committee of Kanazawa University.

Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr i Kanazawa Medical University, og i overensstemmelse med nationale retningslinjer for anvendelsen af ​​dyr i forskning i Japan (https://www.lifescience.mext.go.jp/policies/pdf/an_material011.pdf). Protokollen blev godkendt af Udvalget for dyreforsøg i Kanazawa Medical University.

cellelinjer og vævsprøver

Humane embryonale nyreceller (HEK-293) og bugspytkirtlen kræftceller (Panc-1, MIA PaCa-2, BxPC-3, Capan-1) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). Disse cellelinier blev karakteriseret ved DNA-profilering i ATCC, og passeret i mindre end seks måneder efter genoplivning. De blev holdt ved 37 ° C med 5% CO

2 i DMEM (HEK-293, PANC-1, MIA PaCa-2, Capan-1) og RPMI 1640 (BxPC-3) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika (penicillin G og streptomycin) (GIBCO). Celler blev høstet under den eksponentielle vækstfase til udsugning af RNA og protein.

Denne undersøgelse omfattede 15 patienter med kræft i bugspytkirtlen, der blev opereret på Kirurgisk Afdeling Onkologisk, Kanazawa Universitetshospital (tabel S1). De kirurgiske prøver blev fikseret i neutral-bufferet 10% formalin, indlejret i paraffin og behandlet til histopatologisk diagnose og immunhistokemiske undersøgelser.

Western Blotting

Protein blev ekstraheret fra dyrkede celler ved hjælp af lysisbuffer (CelLytic -MT, Sigma-Aldrich) indeholdende en blanding af protease og phosphataseinhibitorer (Sigma-Aldrich). Koncentrationer af proteinekstrakter blev målt ved Coomassie Protein Assay Reagents (Pierce). En 30 ug portion af protein blev separeret i natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og analyseret ved Western blotting for proteinerne af interesse og deres phosphorylering [9], [11], [12] under anvendelse af de respektive primære antistoffer (tabel S2). Elektroblottet membraner (Amersham) blev blokeret med 5% bovint serumalbumin før detektion af phosphorylerede proteinfraktioner. Mængden af ​​protein i hver prøve blev overvåget ved ekspression af β-actin. Signaler blev udviklet ved hjælp af forøget kemiluminescens (ECL).

In vitro

kinaseassay for GSK3p aktivitet

En nonradioisotopic

in vitro

kinase assay (NRIKA) [19] blev anvendt til at påvise aktiviteten af ​​GSK3p afledt fra celler. Den NRIKA anvender en sekventiel kombination af immunopræcipitationer at isolere GSK3p i cellulære proteinprøver, en

in vitro

kinase reaktion, der anvender rekombinant humant β-catenin-protein (substrat) og ikke-radioisotopisk adenosintriphosphat (ATP), efterfulgt af immunoblotting at detektere β-catenin phosporylated i serin (S) 33, S37 og /eller threonin (T) 41 rester (p-β-catenin

S33 /37 /T41) [19]. Som en negativ kontrol blev det monoklonale muse-antistof til GSK3p erstattes af samme mængde af ikke-immunt muse-IgG (Sigma-Aldrich) i immunoudfældning trin. GSK3p-aktivitet påvises ved tilstedeværelsen af ​​p-β-catenin

S33 /37 /T41 i testen reaktion og ved sit fravær i den negative kontrolreaktion. Mængden af ​​immunopræcipiteret GSK3p og tilstedeværelsen af ​​rekombinant β-catenin-protein i kinasereaktionen blev overvåget ved immunoblotting

Immunhistokemi

Ekspression og /eller phosphorylering af GSK3p, matrixmetalloproteinase (MMP). – 2 og fokal adhæsion kinase (FAK) i tumor og tilstødende ikke neoplastiske væv af pancreas kræftpatienter blev undersøgt ved avidin-biotin-peroxidase-kompleks metode [11], [12]. Efter afparaffinering, mikrobølgeovn antigen demaskering og blokering af ikke-specifikke immunreaktioner, blev paraffinsnit inkuberet med antistof mod GSK3p, tyrosin (Y) 216-phosphoryleret GSK3p (p-GSK3p

Y216), MMP-2, FAK, Y397-phosphoryleret eller Y861-phosphoryleret FAK (p-FAK

Y397, p-FAK

Y861) og p-β-catenin

S33 /37 /T41, henholdsvis. Kilder og arbejdsmetoder fortyndinger af disse antistoffer blev vist i tabel S2. Snit blev derefter inkuberet med biotinyleret gede anti-kanin IgG eller heste-anti-muse-IgG (fortyndet 1:200; Vector). Immunreaktivitet blev påvist under anvendelse af ABComplex /HRP kit (DakoCytomation). For den negative kontrol blev primære antistoffer erstattet af ikke-immun kanin eller muse IgG (DakoCytomation). Overekspression eller højere phosphorylering af de respektive molekyler i tumorer blev defineret som stærkere ekspression eller phosphorylering af begge proteiner i tumorcellerne sammenlignet med ikke-neoplastiske pancreas kanaler i den samme patient.

Virkninger af GSK3p-inhibering på Cell Survival spredning

Celler podet i plader med 96 brønde blev behandlet med dimethylsulfoxid (DMSO; Sigma-Aldrich) eller en GSK3p-inhibitor (AR-A014418; Calbiochem) opløst i DMSO ved de angivne slutkoncentrationer i mediet. Især betyder AR-A014418 ikke inhibere aktiviteten af ​​26 tæt beslægtede kinaser og betragtes yderst specifik for GSK3p [20]. På angivne tidspunkter blev de relative antal af levedygtige og prolifererende celler bestemmes ved hjælp af WST-8 (4- [3- (4-iodphenyl) -2- (4-nitrophenyl) -2H-5-tetrazolio] -1,3 benzen disulfonat) assay kit (Cell optælling kit-8;. Wako) og Cell Proliferation ELISA BrdU kit (Roche), henholdsvis

Små interfererende RNA (siRNA) specifik mod human GSK3p (GSK3p Valideret Stealth RNAi) og negativ kontrol siRNA (Stealth RNAi negativ kontrol lav GC duplex) blev købt fra Invitrogen. Den GSK3p-specifikke siRNA rettet mod sekvensen 5′-GCUCCAGAUCAUGAGAAAGCUAGAU-3 ‘. Celler blev transficeret med 10 nM af enten siRNA anvendelse af Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). Virkningen af ​​RNA-interferens på GSK3p-ekspression blev bestemt ved Western blotting under anvendelse af et antistof mod både GSK3α og β (tabel S2). Specificiteten af ​​GSK3p-specifikke siRNA blev bekræftet i vores tidligere undersøgelser [11], [12]. For at undersøge virkningen af ​​GSK3p RNA-interferens på celleoverlevelse og proliferation, celler udsået i plader med 96 brønde blev transficeret med 10 nM kontrol eller GSK3p-specifik siRNA. På 72 timer efter transfektion blev de relative antal af levedygtige og prolifererende celler bestemt af de ovenfor beskrevne metoder.

Effekter af GSK3p Hæmning på modtagelighed af kræftceller til gemcitabin og for ioniserende stråling

cancerceller podet i 96-brønds plader (3-6 x 10

4 celler per brønd) blev behandlet med stigende koncentrationer af enten gemcitabin (Eli Lily) eller AR-A014418. Efter behandling i 72 timer blev det relative antal af levedygtige celler målt ved WST-8 assay til bestemmelse IC

50 (50% overlevelse celle inhiberende koncentration) for gemcitabin og AR-A014418 og skabe isobologrammer. Celler blev derefter behandlet med en dosis af gemcitabin tæt på IC

50 i nærværelse af DMSO eller en lav dosis (5 eller 10 uM) af AR-A014418. Isobologrammet metoden [21] blev anvendt til at bestemme, om virkningen af ​​GSK3p-inhibitor på pankreatisk cancercellelinie modtagelighed for gemcitabin var additiv, synergistiske eller antagonistiske.

Virkningen af ​​GSK3p-inhibitor på pankreatisk cancercellelinie modtagelighed for ioniserende stråling var undersøgt ved kolonidannende celleoverlevelse assay. I hver brønd i 6-brønds plader, 1.000 bugspytkirtelkræftceller blev udsået og behandlet sekventielt med enten DMSO eller en lav dosis (5 eller 10 uM) af AR-A014418 i 24 timer og med ioniserende stråling i doser på 0, 4 og 8 Gy. Efter 6 dage efter bestråling blev det samlede antal kolonier farvet med 0,1% krystalviolet (Wako) scoret i hver brønd. Det gennemsnitlige antal kolonier i tre separate forsøg blev beregnet med standardafvigelser.

Assays for cellemigrering og invasion

Kræft cellemigration og invasion blev undersøgt ved monolag-baserede sårhelende assay og transwell assay. Sammenflydende monolag af bugspytkirtelkræftceller i nærvær af DMSO eller AR-A014418 i en dosis på 5 eller 10 uM blev ridset med en 20 pi-mikropipettespids at skabe en celle-fri zone (sår). I hver tilstand, blev hullet afstanden mellem sårkanterne overvåges ved tre faste referencepunkter for 6 til 24 timer med et CCD-kamera (Axiocam MRM, Zeiss) forbundet til et fasekontrastmikroskop (Axiovert 40 CFL, Zeiss). Cellemigration ved hvert tidspunkt blev beregnet som den gennemsnitlige afstand af sår målt ved de tre punkter og sammenlignet mellem celler behandlet med DMSO og AR-A014418.

cellemigration og invasion blev undersøgt af Transwell assays under anvendelse uovertrukket og Matrigelcoatede 24-godt dobbelt-kammer-system (BD BioCoat ™ Matrigel ™ Incubation Afdeling, BD Bioscience). Cancerceller blev suspenderet i serum-frit medium indeholdende DMSO eller AR-A014418 (5 eller 10 uM), og 2 × 10

4-celler blev anvendt til det øvre kammer parring med det nedre kammer fyldes med medium indeholdende 10% FBS ( som kemo-tiltrækningsstof) og DMSO eller AR-A014418 (5 eller 10 uM). Ved 22 timer efter at tillade celler at migrere og invadere celler på den nedre side af kammeret blev fikseret og farvet med Diff-Quick Kit (symex). I hvert assay blev det totale antal celler pr høj effekt mikroskopisk felt på den nedre side af den uovertrukne eller Matrigelcoatede kammer talt og bedømt for at migrere eller invadere celler. Det gennemsnitlige antal celler i fem high-power mikroskopiske felter blev beregnet med standardafvigelser.

cellemorfologi og Immunofluorescens cytokemi

Kræftceller dyrket på et dækglas blev behandlet med enten DMSO eller AR- A014418 (5 eller 10 uM) i 12 timer og derefter ridset som beskrevet ovenfor. Ved 12 timer efter ridser blev cellerne langs sårkanterne observeret af fasekontrastmikroskopi. Disse celler blev derefter fikseret med 4% paraformaldehyd og permeabiliseret med 0,1% Triton-X (Sigma-Aldrich). Cellerne blev inkuberet serielt med monoklonalt muse-antistof til Rac1 (BD Bioscience, fortyndet 1:200) ved 4 ° C natten over og med Alexa Flour® 488-mærket anti-muse IgG (Invitrogen, fortyndet 1:1,000) ved stuetemperatur i 40 minutter i mørke. Efter afvaskning af overskydende antistof blev cellerne farvet for filamentøs (F-) actin med Alexa Flour® 546-mærket phalloidin (Invitrogen; fortyndet 1:40) i 20 min. Derefter blev cellekerner modfarvet med Hoechst 33342 (Molecular Probes) og observeret ved fluorescens mikroskopi (Keyence) til ekspression og subcellulær lokalisering af Rac1 og F-actin.

Rac1 Aktivitet

Protein blev ekstraheret fra celler behandlet med DMSO eller 10 uM AR-A014418 i 24 timer i 25 mM Tris-HCI-buffer (pH 7,5) indeholdende 150 mM NaCl, 5 mM MgCl

2, 1% NP-40, 1 mM dithiothreitol og 5% glycerol. Aktiv Rac1 blev isoleret fra proteinet prøve af pull-down-metoden ved hjælp af GST-human Pak1-PBD (Thermo) og harpiks (Glutathione Sepharose 4 Fast Flow, GE Healthcare). Fraktionen af ​​Rac1 bundet til guanosintriphosphat (GTP) (Rac1-GTP, en aktiv form) blev elueret fra harpikserne og påvist ved Western blot-analyse ved anvendelse af kanin-polyklonalt antistof mod Rac1 (fortyndet 1:1,000; Thermo). Separat blev hele cellulært protein probet for total Rac1 anvendelse af samme antistof.

ekspression og sekretion af matrixmetalloproteinase-2 (MMP-2)

Ekspression af MMP-2-mRNA blev undersøgt ved kvantitativ revers transkription-PCR (QRT-PCR). Totalt RNA blev isoleret fra celler ved anvendelse af ISOGEN (Wako). Komplementær DNA (cDNA) blev dannet ved anvendelse af en Reverse Transcription Kit (Promega). QRT-PCR blev udført under anvendelse af SYBR Premix Ex Taq

TMII (Takara Bio) med de respektive sæt af sense- og antisense-primere til amplifikation af MMP-2 og β-actin (tabel S2) [11].

MMP-2-ekspression blev analyseret ved gelatinezymografi [22]. Cancerceller blev podet på plader med 12 brønde i 48 timer og derefter behandlet med DMSO eller AR-A01418 (10 eller 25 uM) i 24 timer i serum-frit medium. Konditioneret medium eller behandlede celler blev inkuberet med SDS-prøvebuffer i 30 minutter ved 37 ° C. Prøver blev separeret på 10% SDS-PAGE indeholdende 0,005% Alexa Fluor 680-mærket gelatine. Efter elektroforese blev gelerne vasket i 2,5% Triton X-100 i 2 timer og derefter inkuberet i substratbuffer natten over ved 37 ° C. Gelen blev scannet af LI-COR Odyssey IR imaging system (Lincoln).

Tumor xenograft Study

Vi forberedt subkutane PANC-1-xenografter i mus som beskrevet [23]. Disse mus blev tildelt til 4 grupper og behandlet med intraperitoneal injektion (to gange om ugen i 10 uger) af DMSO (fortyndingsmiddel), gemcitabin (20 mg /kg legemsvægt) og AR-A014418 (2 mg /kg legemsvægt, svarende til 10 uM i dyrkningsmedie som bestemt og optimeret i vores tidligere undersøgelser [10], [12]) alene eller i kombination, henholdsvis. Alle mus blev afsluttet efter behandling, og de xenotransplantattumorer blev fjernet og behandlet til histologisk undersøgelse og immunhistokemi for ekspression af MMP-2 og FAK og phosphorylering af FAK i tumorceller som beskrevet ovenfor.

Statistisk analyse

Mellem-gruppe statistisk signifikans blev bestemt ved anvendelse af Student

t

test. I tumor xenograft undersøgelse blev tumorvolumener i hver behandlingsgruppe, udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Den statistiske signifikans af forskelle mellem dataene blev bestemt med Kruskal Wallis H-test efterfulgt af Mann-Whitney U-test med Bonferroni korrektion. En

P

værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Expression, Phosphorylering og Aktivitet af GSK3p i kræftceller

bugspytkirtelkræftceller. viste højere basale niveauer af GSK3p og Y216-phosphorylerede aktive form (p-GSK3p

Y216) og lavere niveauer af S9-phosphoryleret inaktiv form (p-GSK3p

S9) sammenlignet med HEK 293-celler (Fig. 1A ). Cancercelle-afledte GSK3p var aktiv til phosphorylering af dets substrat, β-catenin (fig. 1B). Disse resultater indikerer, at bugspytkirtelkræftceller udtrykker aktive GSK3p, der ikke er reguleret af differential fosforylering på S9 og Y216. Immunhistokemi for de serielle snit viste, at GSK3p og p-GSK3p

Y216 blev diffust udtrykt og colocalized i tumorcellerne og overudtrykt i de invasive tumorceller af 8/15 (53%) patienter med pancreascancer (Fig. 1C). Overekspression var hyppigere hos patienter med T3 /T4 primær tumor eller med lymfeknude og fjernt metastase på tidspunktet for kirurgi (tabel S1).

(A) Protein ekstrakt fra hver cellelinje blev analyseret ved Western immunoblotting for ekspressionen af ​​GSK3p og dets phosphorylering (p-GSK3p

S9, p-GSK3p

Y216). p-actin-ekspression blev overvåget som en loading kontrol. (B) GSK3p-aktivitet blev detekteret ved NRIKA [19] i de respektive celler. Som beskrevet i Materialer og metoder, er GSK3p aktivitet demonstreret ved tilstedeværelsen af ​​p-β-catenin

S33 /37 /T41 i testen reaktion (T), og ved deres fravær i den negative kontrol reaktion (NC). Mængden af ​​immunopræcipiteret GSK3p og tilstedeværelsen af ​​substrat (β-catenin) i kinasereaktionen blev overvåget ved immunblotting. (C, D) Serial paraffinsnit af et primært bugspytkirtelkræft og dens tilstødende ikke-neoplastisk væv (patient nr 5 i tabel S1) blev immunfarvet for GSK3p og p-GSK3p

Y216 (C) og for MMP-2 , FAK, p-FAK

Y397 og p-FAK

Y861 (D). Skalaen bar i hvert panel viser 100-um i længden.

Effekter af GSK3p Inhibitor om Cell Overlevelse og spredning

Vi undersøgte, om GSK3p bidrager til kræftcellen overlevelse og formering. Niveauerne af glycogen synthase (GS) phosphoryleret ved Y641 (p-GS

S641) og p-β-catenin

S33 /37 /T41 faldt i cancerceller efter behandling med AR-A014418 (fig. S1A, B ), der angiver dets aktivitet mod GSK3p i kræftceller. GSK3p-inhibering svækkede overlevelse og proliferation af cancerceller (fig. 2A, C). Udtømning af GSK3p ved RNA-interferens svækkede cellelevedygtighed og proliferation i alle cancercellelinier (fig. 2B, D). Disse resultater er i overensstemmelse med de tidligere undersøgelser [16], [17] tyder på, at afvigende GSK3p virkninger på overlevelse og spredning af kræft i bugspytkirtlen celler.

(A) Relative antal levedygtige celler på det angivne tidspunkt punkter var målt ved WST-8 assay for de respektive celler i nærværelse af DMSO eller AR-A014418 i de angivne koncentrationer. (B) relative antal af levedygtige celler blev målt for de respektive celler efter transfektion af ikke-specifik (NS) eller GSK3p-specifik siRNA. (C, D) Den relative antal prolifererende celler blev bestemt ved at måle mængden af ​​BrdU-inkorporering. Prolifererende celler blev scoret efter 48 timer efter behandling med DMSO eller AR-A014418 (10 uM, 20 uM) (C), eller efter transfektion med ikke-specifik (NS) eller GSK3p-specifik siRNA (D). Værdier, der vises i (A-D) er de middelværdier ± SD af fem separate forsøg. *

s

0,05, statistisk signifikant forskel mellem celler behandlet med DMSO eller AR-A014418 og mellem celler behandlet med ikke-specifik og GSK3p-specifikke siRNA

Effekter af GSK3p. hæmmer kombineret med gemcitabin eller Radiation Against Cancer Cells

ovenstående resultater førte os at tage fat om GSK3p hæmning kunne forstærke effekten af ​​gemcitabin og ioniserende stråling. Høje doser (25 eller 50 uM) af AR-A014418 alene havde en terapeutisk virkning mod cancerceller (fig. 2A, C). Derfor blev virkningerne af relativt lave doser (5 eller 10 uM) testet i kombination med gemcitabin eller ioniserende stråling. Først undersøgte vi dosisafhængige virkninger af AR-A014418 og gemcitabin på kræft celle overlevelse og bestemt deres IC

50-værdier (fig. 2A, fig. S2). IC

50 værdier for AR-A014418 var ens i PANC-1, MIA PaCa-2 og BxPC-3 celler, mens dem, for gemcitabin varieret (tabel S3). Vi undersøgte dernæst virkningen af ​​AR-A014418 af følsomheden af ​​cancerceller til gemcitabin. Når celler blev behandlet med stigende doser (1 ng /ml til 10 ug /ml) af gemcitabin, lavdosis AR-A014418 signifikant reducerede IC

50 af gemcitabin (fig. S2, tabel S4). Isobologram analyse [21] af dataene afslørede, at lav-dosis AR-A014418 i kombination med gemcitabin var additiv mod PANC-1-celler og synergistiske mod MIA PaCa-2-celler (fig. 3A). Vi bekræftede, at den kombinerede behandling med AR-A014418 signifikant forstærket effekt af gemcitabin mod kræft celle xenotransplantater (fig. 3C) i gnavere med nogen skadelige virkninger ved reagenset.

(A) Indflydelsen af ​​AR-A014418 om effekten af ​​gemcitabin blev analyseret ved anvendelse isobologrammet [21] ved at plotte IC

50 af kombinationsbehandlingen (fig. S2, tabel S4). (B) Den kombinerede virkning af ioniserende stråling og AR-A014418 blev testet i PANC-1 og MIA PaCa-2-celler ved kolonidannelse assayet. *

s

0,05, statistisk signifikant forskel mellem celler behandlet med DMSO eller AR-A014418. (C) Den kombinerede effekt af gemcitabin og AR-A014418 blev testet i PANC-1-xenografter. Athymiske mus med PANC-1 xenograft blev tildelt til fire grupper til behandling med intraperitoneal injektion (to gange om ugen) af DMSO (kontrol; 8 mus), gemcitabin (GEM; 20 mg /kg legemsvægt; 9 mus) og AR-A014418 ( Ar; 2 mg /kg legemsvægt; 8 mus), alene eller i kombination (GEM + AR; 9 mus). På tidspunktet efter behandling i 10 uger, tumorvolumen (cm

3) blev beregnet ved anvendelse af formlen 0,5 × S

2 × L, hvor S er den mindste tumor diameter (cm), og L er den største (cm ) [10], [12]. Det gennemsnitlige tumorvolumen blev sammenlignet mellem de 4 grupper. *

s

0,05, statistisk signifikant forskel mellem data

Effekten af ​​AR-A014418 kombineret med ioniserende stråling blev testet i kræftceller.. I kolonidannende celleoverlevelse assay nærvær af 10 uM AR-A014418 signifikant reduceret levedygtighed cancercellerne sammenlignet med behandling med ioniserende stråling alene (fig. 3B). Tilsammen viser disse resultater at kombineret behandling med GSK3p inhibitor sensibiliserer kræftceller til gemcitabin og ioniserende stråling.

Molekylær Alterations associeret med GSK3p Hæmning i cancerceller

For at forstå den mekanisme, der ligger til grund for inddragelsen af GSK3p i cancercelleproliferation og modstandsdygtighed over for terapi, undersøgte vi virkningen af ​​GSK3p-inhibering på ekspression og phosphorylering af proteiner involveret i cellecyklusregulering og proliferation. I overensstemmelse med tidligere studier (gennemgået i [2]), viste bugspytkirtelkræftceller phosphorylering af Rb-proteinet (p-Rb

S780, p-Rb

S807 /811;. Figur 4), hvilket antyder, at binding til E2F transskription faktor blev svækket [24]. Behandling med enten AR-A014418 eller GSK3p-specifikke siRNA faldt niveauerne af Rb phosphorylering og cyklin D1 udtryk (fig. 4), men ingen konsistente ændringer blev fundet for CDK4 eller CDK6 udtryk.

(A) Immunoblotting analyse sammenligner ekspressionen af ​​Rb, CDK4, CDK6 og cyclin D1, og phosphorylering af Rb på S780 og S807 /811 rester (p-Rb

S780, p-Rb

S807 /811) mellem celler behandlet med DMSO ( DM) eller 10 uM AR-A014418 (AR) i 24 timer. (B) Ændringer i niveauer af p-Rb

S780 og p-Rb

S807 /811 og udtryk for Rb og cyklin D1 blev undersøgt i MIA Paca-2-celler på de angivne tidspunkter efter behandling med 10 pM AR -A014418. (C) Angivelse af Rb, cyklin D1, GSK3α og GSK3p proteiner og niveauer af Rb phosphorylering (p-Rb

S780) blev undersøgt og sammenlignet mellem de samme bugspytkirtelkræftceller transficeret med ikke-specifik siRNA (NS) eller GSK3β- specifik siRNA (S) (10 nM hver). (A-C) β-actin udtryk blev overvåget som en belastning kontrol.

Effekter af GSK3p Hæmning om Cancer Cell Migration og Invasion

sårhelende assay viste, at migration af cancerceller var signifikant reduceret ved behandling med 5 uM og 10 uM AR-A014418 (fig. 5A, fig. S3). Vigtigere er, disse koncentrationer var utilstrækkelig til at inhibere celleproliferation 24 timer efter behandling (fig. 2A). I Transwell assay, 5 uM og 10 uM AR-A014418 hæmmede kemotaktisk migration af kræftceller og deres invasion af ekstracellulær matrix komponent (fig. 5B).

(A) Øvre paneler viser tidsforløbet for PANC- 1 cellemigration i et sårhelende assay i nærværelse af DMSO eller AR-A014418 (AR). Det nedre panel viser de relative bredder af sår målt som en procentdel af den oprindelige åbning ved tiden nul. *

s

0,05, statistisk signifikant forskel mellem celler behandlet med DMSO eller AR-A014418. (B) migrerende celler gennem ubestrøget transwell og invaderende celler gennem Matrigelcoatede transwell blev bedømt for PANC-1 og MIA PaCa-2-celler behandlet med DMSO eller AR-A014418 (AR) i 22 timer. Repræsentative photomicroscopic fund i hver analyse er vist nedenfor søjlerne. *

s

. 0,05, statistisk signifikant forskel mellem celler behandlet med DMSO eller AR-A014418

Ændringer i invasiv Fænotype af kræftceller Efter GSK3p Hæmning

De ovennævnte resultater førte os til hypotesen, at GSK3p har en rolle i cancer cell migration og invasion. Dette kan tilskrives epitel-mesenkymale overgang (EMT), en fænotype med ansvar for kræftcellen invasion og metastase [25]. Vi undersøgte ekspression af EMT-relaterede molekyler E-cadherin, N-cadherin og vimentin i cancerceller efter behandling med AR-A04418 og GSK3p-specifik siRNA. Der sås ingen vedvarende ændringer i niveauerne af ekspression af disse molekyler (fig. S1c, D), hvilket betyder, at EMT er usandsynligt, at den mekanisme, ved hvilken GSK3p-inhibering dæmper kræft cellemigration og invasion. En mulig forklaring kan være, at etablerede cancer cellelinjer allerede har erhvervet EMT fænotype.

Vi fokuserede næste på cellulær mikroarkitektur og især på lamellipodia der spiller en vigtig rolle i celle migration under fysiologiske processer og i cancerceller migration og invasion [26]. Et medlem af Rho-GTPase familie, Rac1, deltager i lamellipodia dannelse og i kræft progression [27]. Sårheling assay viste, at migrerende cancerceller danner lamellipodia på det sted, Rac1 lokalisering, med actinfilamenter organisere lamel struktur. Behandling med AR-A014418 faldt lamellipodia dannelse i cancerceller ved sårkanten og resulterede i diffus cytoplasmatisk fordeling af Rac1 og F-actin (Fig. 6A).