PLoS ONE: Tab af Androgen receptor-Dependent Vækstsuppression af Prostata Cancer Cells kan forekomme Uafhængigt fra Erhvervelse oncogen Addiction til Androgen receptor Signaling

Abstrakt

Omdannelsen af ​​androgen receptor (AR) signalering som en mekanisme af vækst undertrykkelse af normale prostata-epitelceller til den for vækststimulering i prostatacancerceller er ofte forbundet med AR mutation, amplifikation og overekspression. Således nedregulering af AR signalering er almindeligt terapeutisk for prostatacancer. Den E006AA cellelinjen blev etableret fra et hormon naiv, lokaliseret prostatacancer. E006AA celler er genetisk aneuploid og vokser lige så godt, når xenotransplanteret til enten intakte eller kastrerede nog men ikke nøgne mus. Disse celler udviser: 1) X-kromosom dobbeltarbejde og

AR

genamplifikation, selvom paradoksalt nok ikke kombineret med øget AR udtryk, og 2) somatiske, dominant-negative Serin-599-Glycine tab af funktion mutation i dimerisering overflade af det DNA-bindende domæne af

AR

gen. Ingen effekt på væksten af ​​E006AA celler observeres ved anvendelse målrettet knockdown af endogen mutant AR, ektopisk ekspression af vildtype AR, eller behandling med androgener eller anti-androgener. E006AA celler repræsenterer en prototype for en nyligt identificerede undertype af prostata kræftceller, der udviser en dominerende negative AR tab af funktion i en hormonelt naiv patient. Dette tab af funktion eliminerer AR-medierede væksthæmning normalt induceres ved normale fysiologiske niveauer af androgener, hvilket frembringer en selektiv vækstfordel for disse maligne celler i hormonalt naive patienter. Disse data understrege, at tabet af AR-medierede vækst undertrykkelse er en selvstændig proces, og at det uden yderligere ændringer, er utilstrækkelig til at erhverve onkogen afhængighed AR signalering. Således vil patienter med prostata cancer celler, der huser sådanne AR tab af funktion mutationer ikke drage fordel af aggressiv hormon eller anti-AR terapier, selvom de udtrykker AR protein

Henvisning:. D’Antonio JM, Vander Griend DJ , Antony L, Ndikuyeze G, Dalrymple SL, Koochekpour S, et al. (2010) Tab af Androgen receptor-Dependent Vækstsuppression af Prostata Cancer Cells kan forekomme Uafhængigt fra Erhvervelse oncogen Addiction til Androgen receptor signalering. PLoS ONE 5 (7): e11475. doi: 10,1371 /journal.pone.0011475

Redaktør: Janine Santos, University of Medicine og Dentistry of New Jersey, USA

Modtaget: April 23, 2010; Accepteret: 14 Juni 2010; Udgivet: 8 Juli 2010

Copyright: © 2010 D’Antonio et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. NIH Grant R01DK52645 og Maryland Stem Cell Research Fund MSCRF-II-0428 generøst støttet denne forskning. Donald Vander Griend blev understøttet af en Urologi Training Grant (NIH T32DK07552), og ved en DOD Post-ph.d. Training Award (PC060843). Jason DAntonio understøttes af en Urologi Training Grant (NIH T32DK07552-21A1). Dr. Koochekpour blev støttet af en bevilling fra NIH /NCRR-Center of Biomedical Research Excellence (COBRE, 1P20 RR021970) og tildele R21CA149137. De finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Inden for det sidste årti har der været en fornyet interesse for androgen receptor (AR) signalering, som den vedrører normal prostata funktion, prostata carcinogenese, og metastatisk progression. I den normale prostata, AR funktioner via en gensidig parakrin interaktion mellem epitel og stromaceller [1]. Androgen binding til AR i prostata stromaceller aktiverer en transkriptionel kaskade resulterer i produktion og sekretion af parakrine vækstfaktorer, kendt som andromedins, som diffunderer ind i epitel rum, binder celleoverflade beslægtede receptorer og aktivere signalveje, der stimulerer proliferationen og overlevelse af epitelcellerne [1]. I nærvær af fysiologiske niveauer af androgen og dermed andromedins, ligand-bundne AR beliggende i den sekretoriske luminale epitelcelle forhindrer overvækst af epitel kammer ved at undertrykke celleproliferation og fremme cellulær differentiering [1], [2], [3] [4]. Betydningen af ​​denne celle kontekst-afhængige AR vækst-undertrykkende evne er dokumenteret af undersøgelser, der viser, at betinget tab af AR-ekspression i epithel-rum, men ikke i stromale celler, resulterer i øget luminal epitelcelleproliferation [5], [6]. Når et fysiologisk niveau af androgen ikke opretholdes, såsom følgende androgen ablation, omfanget af andromedins falder til et niveau, hvor de kan hverken stimulere proliferation eller blokerer aktiveringen af ​​apoptose i de epitelceller, og således prostata regredere [1].

Under prostata carcinogenese begge til AR-uafhængige og AR-afhængige signalveje ordninger bidrager til malign transformation af epitelceller [7]. I AR-uafhængige vej er AR-proteinet ikke udtrykkes og derfor AR-reguleret undertrykkelse af malign cellevækst er tabt. Vigtigere, når Ar er derefter ektopisk udtrykt i sådanne AR-uafhængige prostatacancerceller, androgen-aktiverede AR signalering inhiberer cellevækst [8]. I AR-afhængige vej, er AR funktion ofte konverteret fra en vækst suppressor til et onkogen stimulerende prostatakræft celleoverlevelse og proliferation [1], [9], [10]. Mens enten AR-uafhængige eller -afhængige veje er mulige, størstedelen af ​​prostatakræft erhverve onkogen AR signalering, hvilket således tilvejebringer den logiske begrundelse for, hvorfor androgen ablation er standard terapi for metastatisk prostatacancer, da det inhiberer proliferation og aktiverer apoptose i disse metastatiske cancerceller [ ,,,0],11]. Desuden AR signalering fortsat et centralt mål selv for kastrationsniveauer-resistent metastatisk prostatakræft [7]. Dette er baseret på resultatet af undersøgelser, der viser, at mens ualmindelige i hormonalt naive patienter, AR genmutation og amplifikation, hvilket resulterer i forhøjet AR proteinekspression detekteres i de fleste metastatisk prostatacancer væv fra patienter med kastrationsniveau-resistent metastatisk sygdom [12], [13]. I overensstemmelse med disse kliniske observationer, AR genmutation, forstærkning og protein overekspression er almindeligt observeret i de fleste af prostata cancer cellelinjer afledt kastrationsniveauer-resistente værter [14], [15]. Disse kastrationsniveauer-resistent prostatacancer cellelinier ikke undergår apoptose, når androgener er udtømte eller androgener anvendes antagonister; men de stopper prolifererende og aktivere celledød, hvis AR protein er reduceret til under et kritisk niveau både

in vitro

[14], [16], [17] og

in vivo

[ ,,,0],18]. Disse observationer er i overensstemmelse med begrebet “onkogen afhængighed” [19] for at AR protein-ekspression og funktion, og dokumentere, at sådanne kastrationsniveauer-resistente prostatacancerceller forbliver afhængige af AR signalering for deres ondartet vækst [1], [9].

tilstedeværelsen af ​​AR udtryk, somatiske AR mutationer eller forstærkning betyder ikke nødvendigvis dog, at en prostatakræft celle afhængige AR signalering. Dette udsagn er baseret på den foreliggende undersøgelse, som dokumenterer en yderligere undertype af humane prostatacancerceller. I denne subtype, er AR gennemgået en dominant negativ, tab af funktion mutation selvom AR er genetisk forstærkes uden at patienten nogensinde modtager androgen ablation terapi. En sådan dominant negativ tab af AR funktion i maligne celler frembringer en selektiv vækstfordel ved at eliminere normale androgen-afhængige AR-signalering-induceret væksthæmning; Men mens det er nødvendigt, det er utilstrækkeligt for disse maligne celler erhverve et onkogen afhængighed AR-signalering.

Metoder

Etik Statement

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med dyr protokol MO09M434 godkendt af Johns Hopkins Animal Care og brug Udvalg specielt til denne undersøgelse.

Celler og materialer

E006AA [20], S006AA [20], LNCaP og PC-3 (opnået fra ATCC, Manassas, VA), og LNCaP C4-2B (opnået fra UroCor, Oklahoma City, OK) celler blev opretholdt i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), og LAPC-4 celler i IMDM (Invitrogen) plus 1 nM R1881 , begge indeholdende 10% FBS (Hyclone, Logan, UT), 1 × Pen /Strep, og L-glutamin. CWR22 xenograft tumorvæv var en venlig gave fra Thomas Pretlow (Case Western Reserve University, Cleveland, OH). Trækul /dextran strippet FBS (csFBS) blev opnået fra Hyclone og anvendes som supplement phenolrødt-frit RPMI (Invitrogen) for luciferase og chromatin immunopræcipitationsanalyser. Det syntetiske androgen R1881 blev indkøbt fra Perkin-Elmer (Boston, MA). PSA-analyse blev gennemført af JHMI Clinical Chemistry Laboratory. Cellevækst blev målt ved en 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay (CellTiter Ikke-radioaktivt celleproliferationsassay fra Promega Corp. (Madison, WI)). Kort beskrevet blev celler udpladet i en 96-brønds format og fik lov at adhærere natten over. Celler blev behandlet med bærer eller lægemiddel. På bestemte dage, blev 15 pi MTT farvereagens til hver brønd, pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i 4 timer blev 100 pi Stop reagens til hver brønd, og pladerne læses af en Molecular Devices SpectraMAX plus pladeaflæser ved 570 og 650 nm. Absorbans-aflæsninger blev derefter plottet mod en standardkurve for at bestemme celletal. Resultater er præsenteret fra dag 4. Klonogen overlevelse blev analyseret som følger: 500 celler (parental E006AA, E006AA LV-ikke-nedregulering-shRNA, og E006AA LV-AR-shRNA) blev udpladet pr brønd i 6-brønds plader, fik lov til at klæbe og kolonisere i seks dage, derefter samtidigt fikseret og farvet i en 0,5% krystalviolet /25% methanol-opløsning, og kolonier blev talt manuelt.

karyotype analyser og fluorescens in situ hybridisering

cytogenetisk analyse var udført under anvendelse af standardmetoder. Kromosomafvigelser blev beskrevet i henhold til iSCN retningslinjer [21]. FISH blev udført på cellelinierne og på en normal mandlig kontrol under anvendelse af prober, der er købt fra Vysis (Abbott Molecular), specifikke for AR Gene (Xq12) og X centromer. Hybridiseringen blev udført ifølge producentens instruktioner. For hver cellelinie blev 100 interfase cellekerner scorede og forholdet mellem rød (AR) til grønne (Xcen) signaler blev beregnet. Der blev også analyseret i alt 9-20 metafaser. Billeder blev erhvervet ved hjælp af en standard epifluorescensmikroskop og FISH View software (Applied Spectral Imaging).

In vivo

Tumor Analyser

In vivo

vækst assays blev udført som tidligere beskrevet [22], [23]. For subkutane injektioner, blev en million E006AA celler i 200 pi 80% Matrigel (BD Biosciences, fortyndet med kold HBSS) injiceret i flankerne af mandlige nøgen eller nog-SCID mus. For CWR22 xenograft inokulationer blev 20 mg væv injiceret pr mus. Kirurgisk kastration blev udført som tidligere beskrevet [22], [23]. Passage af tumorvæv blev udført ved hakning tumorvævet, passerer det gennem et sterilt væv si, vaske det i PBS, og re-injektion af 50 mg af tumor i 200 pi 80% Matrigel.

Immunohistologisk Detection

Immunfarvning for AR (N-20; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), PSA (Dako Cytomation, Carpinteria, CA), ΔNp63 (LabVison /NeoMarkers, Freemont, CA), Nkx3.1 (UMBC) og CK5 (Babco, Richmond CA) blev udført på xenograft sektioner som tidligere beskrevet [24], med følgende modifikationer: Vævssnit blev deparrafinized, rehydreret og kortvarigt ækvilibreret i vand. For AR og Nkx3.1 immunhistokemi blev antigen demaskering udført ved kogning objektglassene i 1 mmol /L EDTA (pH 8,0) i 15 min. For P63 farvning blev objektglassene dampet i 20 min i Antigen demaskering Solution (Vector Laboratories, Burlingame CA) i 20 minutter. Endogen peroxidaseaktivitet blev standset ved inkubation med peroxidase blok i 5 minutter ved stuetemperatur. For AR og Nkx3.1 farvning, ikke-specifik binding blev blokeret ved inkubation i 1% bovint serumalbumin i Tris-HCI pH 7,5 i 20 minutter ved stuetemperatur. Objektglas blev inkuberet med primære antistoffer, herunder en kanin polyklonalt AR-antistof (1:25 fortynding) i 45 minutter ved stuetemperatur; muse monoklonalt PSA antistof (1:50 fortynding) 45 minutter ved stuetemperatur; monoklonalt muse P63 antistof (1:50 fortynding) i 45 minutter ved stuetemperatur; kanin polyklonalt Nkx3.1 antistof (1:1000 fortynding) i 45 minutter ved stuetemperatur; og kanin polyklonalt CK5 antistof (1:2500 fortynding) i 45 minutter ved stuetemperatur. Efter primært antistof ansøgning blev objektglassene inkuberet med poly-HRP konjugeret sekundært (EnVision (AR, P63) eller PowerVision (PSA, Nkx3.1, CK5)) ved 1:3000 fortynding i 30 minutter ved stuetemperatur. Signalpåvisning blev udført under anvendelse af 3,3′-diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) som chromagen i 20 min. Objektglas blev modfarvet med hematoxylin, dehydreret, og monteret.

Lentiviral Infektion

Stabil vild type human AR cDNA-ekspression og FACS-sortering for GFP-positive celler blev udført som tidligere beskrevet [8], [25]. Stabil mutant LV-AR S599G blev skabt først ved PCR amplifikation af E006AA cDNA indeholdende den S599G mutationen. Både PCR-fragmentet og vildtype-Lenti-viral AR plasmid blev restriktionsspaltet med Eco81I og Tth111I. Spaltet PCR-produkt og LV-AR plasmid blev isoleret, oprenset, ligeret under anvendelse hurtig T4 ligase kit (Fermentas), og sekventeret for at bekræfte S599G insertion. Short-hårnål knockdown af AR blev udført ved hjælp MISSION

TM lentivirale shRNA transduktion partikler rettet enten AR alene eller en ikke-silencing shRNA kontrol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). 1 × 10

4 E006AA eller LNCaP-celler blev udpladet pr brønd og tilladt at adhærere i 4 eller 24 timer hhv. Celler blev transduceret ved en MOI på 2 (2 × 10

4 partikler /brønd) uden polybren. Antibiotisk selektion [1,5 ug /ml puromycin (Sigma)] blev igangsat 48 timer senere.

AR Sequencing

RNA blev høstet ved anvendelse af Qiagen miRNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA) og kontaminerende DNA blev fjernet under anvendelse af Ambion DNA-free kit (Ambion, Austin, TX). Hævet revers transcriptase III (Invitrogen, Carlsbad, CA) og 1 ug af total RNA blev anvendt til frembringelse cDNA’er med oligo-dT-primere. Genomisk DNA blev ekstraheret under anvendelse af Qiagen DNA Mini kit og inkuberet med RNase (Roche, Mannheim, Tyskland) ved 37 ° C i 30 min til fjernelse af forurenende RNA. PCR-amplifikation af cDNA’er og genomisk DNA blev udført ved anvendelse Platinum

Pfx

DNA-polymerase (Invitrogen) i overensstemmelse med producentens specifikationer med de følgende overlappende primersæt: (1) 5′-AGAGAGGTAACTCCCTTTGGCT-3 ‘og 5’-ACGCTCTGGAACAGATTCTGG -3 ‘(740bp), (2) 5′-TCCCGCAAGTTTCCTTCTCT-3′ og 5’-GATACTGCTTCCTGCTGCTGTT-3 ‘(756bp), (3) 5′-TGAGGAACAGCAACCTTCACAG-3′ og 5’-ACAGGGTAGACGGCAGTTCAA-3 ‘(704bp) , (4) 5’-GCCGAATGCAAAGGTTCTCT-3 ‘og 5′-TTGACACAAGTGGGACTGGGA-3′ (700 bp), (5) 5’-CAGTTGTATGGACCGTGTGGT-3 ‘og 5′-CTACACCTGGCTCAATGGCT-3’ (723bp), (6) 5 ‘ -CGGAAGCTGAAGAAACTTGG-3 ‘og 5′-AGAAGCGTCTTGAGCAGGAT-3′ (685bp), (7) 5’-ATTCCAGTGGATGGGCTGAA-3 ‘og 5′-TAGCTCTCTAAACTTCCCGTGG-3′ (714bp), (8) 5’-CTTCCCATTGTGGCTCCTAT-3 ‘og 5’-ACCTTCTCGTCACTATTGGC-3 ‘(361bp); og for genomisk DNA-amplifikation af exon 3 af AR-genet: (9) 5’-TGTTTGGTGCCATACTCTGTCCAC-3 ‘og 5′-GCATCCTCACTCACCTTCTGTTGG-3’ (530bp). PCR-produkter var kolonne oprenset under anvendelse af Qiagen QIAquick (Qiagen) og blev sekventeret ved Johns Hopkins University DNA Analysis Facility ved hjælp af både forward og reverse primere.

Western blot analyse

Hele cellelysater var fremstilles på en per celle basis i lysepuffer (20 mM Tris-HCI pH 7,8, 140 nM NaCI, 1 mM EDTA, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,5% Nonidet P-40) suppleret med PhosSTOP phosphatase inhibitor tablet og proteaseinhibitortablet (Roche ), og 1 mM dithiothreitol. Hele cellelysater blev underkastet SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Membraner blev blokeret i 5% mælk (TBS + 0,1% Tween-20) i 1 time. Kaninen polyklonale AR antistof (SC-816), og monoklonalt muse Ck8 (SC-53.266) og monoklonalt muse-CK18 (SC-32.722) antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), og monoklonale muse ß-Actin antistof blev anskaffet fra Sigma (A5441) og blev anvendt i forbindelse med et anti-kanin-HRP-antistof (7074, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) eller anti-muse-HRP (NA931V, GE Healthcare, UK).

Nuclear og cytoplasmiske cellefraktioner blev fremstillet under anvendelse af Nuclear Complex Co-IP kit (Active Motif, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev cellerne vasket og derefter skrabet i koldt PBS suppleret med phosphataseinhibitorer. Cellepellets blev resuspenderet og lyseret i 1 × hypotonisk opløsning plus detergent, centrifugeret ved 6.000 x g i 5 minutter ved 4 ° C, og cytoplasmiske fraktioner fjernes. Nukleare pellets blev resuspenderet i digestionspuffer plus enzymatisk klipning cocktail og inkuberet ved 4 ° C i 90 minutter. 0,5 M EDTA blev tilsat for at standse enzymatiske forskydningskræfter reaktioner og nukleare lysater centrifugeret i 10 minutter ved 4 ° C. Alle fraktioner blev kombineret med lige volumen 2 x SDS-prøvepuffer og denatureret ved 95 ° C i 5 min. Prøver blev separeret på 4-15% PAGE og blottet med enten anti-AR. (N-20; Santa Cruz), den cytoplasmatiske markør Vinculin (Sigma), eller den nukleare markør HDAC (Santa Cruz Biotechnologies)

Måling AR transkriptionsaktivitet

Celler blev udpladet (per brønd) i hvide polystyren, klar bund, sterile 96-brønds vævskulturplader i overensstemmelse hermed: LNCaP C4-2B (9.000); PC-3 (7.000); E006AA, E006AA LV-AR, E006AA LV-ikke-nedregulering-shRNA, E006AA LV-AR-shRNA (5000). Celler med eller uden androgen (1,0 nM R1881) blev udpladet i seks replikater i RPMI (Invitrogen) suppleret med 10% csFBS (Hyclone), men uden phenolrødt eller pen /strep og fik lov at adhærere natten over. Celler blev transficeret under anvendelse Fugene 6 (Roche) med 50 ng Probasin-PSA-ildflue og 5 ng pRL-TK-Renilla (Promega, Madison, WI) Luciferase reporter-konstruktioner per brønd i et forhold på 3:01 (pi Fugene: pg totalt DNA) i serumfrie medier [26]. På dag tre blev seks behandling brønde stimuleret med androgen mens seks kontrolbrønde modtog 0,1% køretøj. På dag 4 blev mediet omhyggeligt aspireret, og cellerne blev behandlet i henhold til Dual luciferaseassaykit instruktioner (Promega # E1910). Kort beskrevet blev 30 pi passiv lysisbuffer tilsat til hver brønd, og pladen rystet på et rysteapparat i 15 minutter ved stuetemperatur. Firefly og Renilla enzymatiske aktivitet blev målt ved anvendelse af en Wallac Jet 1450 Microbeta plade injektor. Tredobbelt transficerede LNCaP C4-2B celler fik 50 ng Probasin-PSA-ildflue, 5 ng pRL-TK-Renilla, og 50 ng LV-AR-S599G konstruktioner per brønd i et forhold på 3:01 (pi Fugene: ug total DNA) i serumfrie medier.

chromatin immunoprecipitation

LNCaP C4-2B og E006AA celler dyrket i phenolrødt-frit RPMI suppleret med 10% csFBS, blev høstet via trypsinbehandling og chromatin fremstillet ifølge den MagnaChip kit fra Upstate, Temecula, CA. ~ 1 × 10

7-celler blev resuspenderet i 10 ml medium, fastsat ved tilsætning 275 pi 37% formaldehyd og forsigtigt rystet ved 22 ° C i 12 min. Efter tværbinding, 1 ml glycin blev tilsat, og cellerne forsigtigt rystet i 5 minutter ved 22 ° C, vasket to gange i kold PBS, resuspenderet i 500 pi cellelysebuffer plus 2,5 pi proteasehæmmere (5 mM PIPES pH 8, 85 mM KCI, 0,5% NP-40) og centrifugeret i 5 minutter ved 4 ° C. Cellepellets blev resuspenderet i 500 pi cellelysebuffer plus 2,5 pi proteaseinhibitorer, inkuberet 15 min på is med kort vortex hver 5 min og centrifugeret ved 800 x g i 5 minutter ved 4 ° C. Nukleare pellets blev resuspenderet i buffer nukleare lysis plus 2,5 pi proteasehæmmere (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCI pH 8,1). Kromatin blev sonikeret til en gennemsnitlig DNA længde på 500-1200 bp hjælp Fisher Scientific Sonic Dismembrator Model 100 (4 × 15 sek pulser på indstilling 3). Fem pi blev gemt til styreindgang og 50 pi prøver blev fortyndet i 450 pi fortyndingsbuffer (0,01% SDS, 1,1% Triton, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCI pH 8,1, 167 mM NaCl). Fire ug antistof blev tilsat til respektive rør: 4 pi 1 mg /ml kanin-IgG eller 40 pi 100 pg /ml kanin-anti-AR (SC-816, Santa Cruz) og roteres O /N ved 4 ° C. Immune komplekser blev centrifugeret 10 min ved 10.000 x g i 4 ° C for at pelletere eventuelle aggregater eller ikke-specifikke komplekser. Supernatanten (ønsket immunkomplekser) blev høstet og kombineret med 20 pi protein A Dynabeads (Invitrogen, CA) og forsigtigt omrørt 2 timer ved 4 ° C. Rørene blev anbragt i et Millipore magnetisk stativ og immunkomplekser sekventielt vasket 1 gang med lav saltbuffer (0,1% SDS, 1% Triton, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCI pH 8,1, 150 mM NaCl), puffer med højt saltindhold (0,1 % SDS, 1% Triton, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCI pH 8,1, 500 mM NaCl), LiCI buffer og TE, med 3 min omrøring hvert vasketrin. For at vende tværbindingerne, blev perlerne resuspenderet i 100 pi Chelex og kogt 10 minutter ved 95 ° C, centrifugeret 1 min ved 12.000 x g ved 4 ° C, og supernatanter opsamles. Perler blev resuspenderet i 120 pi vand, centrifugeret igen, og supernatanterne hældt sammen med tidligere supernatant. Det indfangede DNA blev oprenset under anvendelse af Qiagen PCR oprensningskit (# 28104) ifølge producentens instruktioner og analyseres ved PCR og q-PCR.

PCR-analyse af immunpræcipiteret DNA

Brug 5 Prime HotMasterMix ( Eppendorf), blev PCR-reaktioner udført som følger: 94 ° C i 2 minutter, derefter 32 cyklusser 30 sek denaturering ved 94 ° C, 30 sekunder af annealing (som angivet nedenfor for hvert primerpar), og 30 sekunders forlængelse ved 65 ° C, derefter en 2 min endelig forlængelse ved 65 ° C. PCR-produkter blev separeret på 2% agarosegeler og farvet med ethidiumbromid. Primere til amplifikation af DNA-fragmenter er som følger: PSA-promotoren ARE (52 ° C) fwd 5′-GCCAAGACATCTATTTCAGGAGC-3 ‘, rev 5′-CCCACACCCAGAGCTGTGGAAGG-3′; KLK2 promotoren (52 ° C) fwd 5’-CTCCAGACTGATCTAGTATG-3 ‘, rev 5′-TTGGCACCTAGATGCTGACC-3’; SP1 websted P45

Skp2 promotoren (53 ° C) fwd 5′-GATCCACGCTCAGAGACGAC-3 ‘, rev 5′-TTCGAGATACCCACAACCCC-3′; Tcf4 bindende element i c-myc promotor (55 ° C) fwd 5’-GCTCTCCACTTGCCCCTTTTA-3 ‘, rev 5′-GTTCCCAATTTCTCAGCC-3’.

Kvantitativ PCR analyse af immunpræcipiteret DNA

Brug BioRad IQ SYBER Green Supermix (Hercules, CA), blev PCR-reaktioner udført med BioRad ICycler som følger: 95 ° C i 3 minutter, derefter 40 cyklusser 30 sek denaturering ved 95 ° C, 30 sekunder af annealing ved 55 ° C, og 45 sekunder af forlængelse ved 72 ° C (data blev indsamlet under udstrækning), efterfulgt af en 110cycle smelte kurve fra 45-100 ° C for at sikre primer effektivitet. Tidligere designede primere til kvantitativ opformering af DNA-fragmenter, der indeholder en formodet ER i PSA-gen-promotoren og en ARE III i PSA forstærker regionen er: ER fwd 5’CCTAGATGAAGTCTCCATGAGCTACA-3 ‘, rev 5′-GGGAGGGAGAGCTAGCACTTG-3′; ARE III fwd 5’-TGGGACAACTTGCAAACCTG-3 ‘, rev 5′-CCAGAGTAGGTCTGTTTTCAATCCA-3’ [27]. Procent input beregninger blev udført som følger:% input = 2 (Ct

AR chip – Ct

input) x100. T-test blev anvendt til at bestemme p-værdi.

Resultater

E006AA Celler er Tumorgenetisk i intakte og kastreret NOG-SCID mus

Koochekpour et al. rapporterede etableringen af ​​en ny human prostatacancer-cellelinie, E006AA, der var afledt af en Gleason 6 lokaliseret prostatacancer i et hormon-naive prostatacancer patient af African American afstamning [20]. Matchende normale prostata stromaceller, betegnet S006AA, var også dyrket fra samme radikal prostatektomi prøve [20]. Den epitel oprindelse E006AA cellerne blev bekræftet ved positivt udtryk for cytokeratiner 8 (Ck8) og 18 (CK18), mens det stromale oprindelse S006AA cellerne blev bekræftet af den positive udtryk for mesenchymale markører desmin og alpha-glatmuskelactin og fravær af Ck8 og CK18 [20]. I de oprindelige undersøgelser, E006AA celler var ikke-tumorigene når xenotransplanteret til intakte mandlige nøgne mus [20]. Da nøgne mus har unormalt høje niveauer af aktiverede naturlige dræber (NK) T-celler, hvilket resulterer i en forøget host immuno-reaktivitet over en voksende tumor [28], dette rejst spørgsmålet om, hvorvidt disse E006AA celler blev immortaliseret men kun delvist transformeret eller om de er fuldt maligne men følsom overfor NK celledrab. Du kan løse problemet, E006AA celle subkutane vaccinationer i både intakte mandlige nøgen og NOG /SCID /γ

c

null triple defekte mus [dvs NOG-SCID-mus mangelfuld i NK, B og T-celler] var indledt [29]. Inokulering af E006AA celler i nøgne mus (n = 15) viste, at E006AA celler danner tydelige tumorer og nåede ~100-200 mm

3 efter seks uger hos 100% af musene. Efter seks uger, men alle de E006AA tumorer i nøgne mus intakt mandlige stoppet med at vokse og svandt over et andet tidsrum på 5-10 uger (figur 1A). I modsætning til situationen i nøgne mus, E006AA voksede tumorer med en accelereret hastighed i NOG-SCID-mus og ikke relatere (figur 1A). Interessant, selvom tumorigen, intet serum PSA kunne påvises i E006AA tumorbærende mus (n = 10).

(A) Podning af E006AA celler i mandlige nøgne mus sammenlignet med mandlige nog-SCID-mus. (B) Overførsel af tumorvæv stammer fra en etableret E006AA xenograft tumor fra en mandlig NOG-SCID mus til intakte mandlige Nude og NOG-SCID-mus. (C) Væksten i E006AA og CWR22 menneskelige prostata cancer xenotransplantattumorer i kastreret vs. intakt hanmus på otte uger. (D) Histologisk analyse (H & E) og immunfarvning af E006AA xenograft vævssnit for AR, PSA, P63, og CK5 (billeder taget ved 20 x og 40 x). (E) Western blot-analyse af Ck8 og CK18 ekspression i LNCaP, PC-3, E006AA og S006AA celler. ß-Actin tjente som en belastning kontrol.

For yderligere at bekræfte, at den observerede spontan regression af E006AA xenotransplantattumorer i nude værter, men ikke i NOG-SCID-mus, stammer fra immun genkendelse og eliminering af NK celler fjernede vi en etableret og voksende E006AA tumor fra en NOG-SCID vært og transplanteret væv fra denne tumor tilbage til enten intakte mandlige NOG-SCID (n = 5) eller nøgne mus (n = 5). Svarende til vores tidligere observationer, gennemgik transplanterede E006AA tumorer forsinket regression i intakte mandlige nøgne mus under dannelse kontinuerligt voksende tumorer i NOG-SCID værter (Figur 1B). Disse kombinerede resultater dokument, som E006AA celler er faktisk tumorgene men sårbar over for NK-celle drab.

Efter at have demonstreret tumorgenicitet af E006AA celler, vi næste evalueret deres androgen lydhørhed,

in vivo

, ved at pode disse celler i både intakte (n = 10) og kastrerede (n = 8) mandlige nog-SCID værter. Tumorer udviklet lige godt i begge værter, og der var ingen forskel i vækstraten eller tumor volumen i de kastrerede vs intakte nog-SCID dyr (Figur 1C). At sikre kastrationsniveauer af cirkulerende androgener, væksten af ​​androgen-responsive CWR22 human prostatacancer xenograft i kastrerede (n = 5) vs. intakt (n = 5) hanmus blev også analyseret. Til forskel i intakte mus, væksten af ​​CWR22 xenotransplantattumorer hos kastrerede værter var dybt inhiberet (figur 1C). Disse resultater dokument, E006AA celler udviser kastrationsniveau-resistent vækst,

in vivo,

selvom de oprindeligt blev etableret fra et hormonelt naiv primær prostatacancer. At karakterisere fænotypen af ​​disse E006AA celler blev nog-SCID xenotransplantattumorer fjernet og behandlet til histologisk og immunhistokemisk analyse. Figur 1D illustrerer, at E006AA celler er lokalt invasive, gennemtrængende skeletmuskulatur fibre på det lokale sted for inokulering med de invaderende celler udviser kendetegnende træk ved forstørrede og polymorfe cancer cellekerner, hvor AR-proteinekspression er detekterbar. Efter aftale med tidligere serum analyse havde de E006AA xenograft cellerne ikke pletter positive for PSA (Figur 1D), eller AR-regulerede NKX 3.1 proteiner (data ikke vist). Derudover manglede cancercellerne ekspression af basal cellespecifik markør, P63, men var positive for epiteliale cellemarkører cytokeratin 5 (CK5) (figur 1D), Ck8 og CK18 (figur 1E), hvilket yderligere bekræfter den epitheliale oprindelse E006AA celler [30], [31], [32].

for at udelukke en alternativ forklaring på, hvorfor E006AA celler vist at være tumorigen i nærværende undersøgelse, men ikke-tumorigen i de oprindelige undersøgelser, E006AA celler rutinemæssigt vedligeholdes

in vitro

blev karyotyped direkte fra cellekultur (figur 2A) og viste sig at have en identisk, abnorm karyotype som oprindeligt rapporteret for E006AA cellelinjen [20]. Sådanne celler blev podet i nog-SCID værter og en stadigt voksende tumor blev efterfølgende høstet at genetablere

in vitro

E006AA kulturer. Karyotype-analyse af disse tumorafledte E006AA celler dokumenteres samme unormal karyotype, som set i

in vitro

-maintained cellelinje (figur 2B), hvilket eliminerer muligheden for, at E006AA celler blev genetisk ustabile efter inokulering i NOG- SCID mus og udviklet yderligere cytogenetiske forandringer, der afsluttede deres malign transformation i en tumorigen variant.

(a) Karyotype analyse af E006AA celler før injektion og

in vivo

tumorvækst. (B) Analyse af E006AA celler afledt af en NOG-SCID tumor-bærende mus, der dokumenterer ingen væsentlige karyotypic ændringer under tumorvækst.

Forstærkning, Mutation, og Expression af AR i kastrere-Resistant E006AA Cells

Fluorescens

i situ

hybridisering (FISH) blev udført med prober specifikke for

AR

gen [Xq12] (rødt signal) og X centromer (grønt signal) ( Figur 3A). Interfase analyse viste, at i 91% af cellerne undersøgte, var der to røde signaler forbundet med hver grønt signal. Da der er en gentagelse af X-kromosomet, betyder det, at i gennemsnit,

AR

gen forstærkes mindst fire gange i E006AA cellelinje.

(A) Cytogenetisk analyse af AR status i normale mandlige kontrol- og E006AA celler som bestemt ved fluorescens in situ hybridisering (FISH) under anvendelse af prober specifikke for AR Gene (Xq12, rødfarvet) og X centromeren (grøn farve). (B) sekventeringsresultaterne af overlappende primer PCR-amplifikation af E006AA mRNA og cDNA identificeret en missense-mutation (Ser599Gly), som svarer til “X” positionen af ​​det konserverede AXRND motiv i DBD D-boks (som angivet ved sorte pilespids i position