PLoS ONE: Inhibering af TCF-4 inducerer apoptose og øger kemosensitivitet af Colon Cancer Cells

abstrakt

Aberrant aktivering af β-catenin /TCF-4-signalering er blevet impliceret i human carcinogenese, herunder colorectal cancer. I denne undersøgelse sammenlignede vi virkningerne af TCF-4 knockdown med β-catenin knockdown på celleproliferation, apoptose, og kemosensitivitet i SW480 og HCT116 colon cancerceller ved anvendelse adenovirusvektor-medieret korte hårnål RNA (shRNA). Vores resultater viser, at sammenlignet med P-catenin knockdown, TCF-4 knockdown mere effektivt inhiberede kolonidannelse, apoptose og øget 5-FU og oxaliplatin-medieret cytotoksicitet i colon cancerceller. Vi undersøgte endvidere de mekanismer, der er involveret i de forskellige effektiviteter observeret med β-catenin og Tcf-4 knockdown i tyktarmen kræftceller. FOXO4 er et medlem af underfamilien af ​​pattedyr FOXO forkhead transkriptionsfaktorer og spiller en vigtig rolle i at kontrollere celleproliferation, apoptose, og DNA-reparation. Vores data viser, at proteinniveauet af FOXO4 ikke ændrede efter behandling med både β-catenin og TCF-4 shRNA. Imidlertid blev β-catenin shRNA sig at forøge akkumulering af phosphoryleret FOXO4 S193 og formindske ekspressionen af ​​FOXO målgener p27KIP1 og MnSOD, hvorimod TCF-4 shRNA viste den modsatte virkning. Derfor sammenlignet med p-catenin knockdown, Tcf-4 knockdown viser bedre effekt for at hæmme proliferation og inducere apoptose af kolorektal cancer celler, som kan være relateret til øget FOXO4 transkriptionel aktivitet. Disse resultater antyder, at TCF-4 er et attraktivt potentielt terapeutisk mål for kolorektal cancer terapi

Henvisning:. Xie J, Xiang D-B, Wang H, Zhao C, Chen J, Xiong F, et al. (2012) Hæmning af TCF-4 fremkalder apoptose og Forbedrer kemosensitivitet af Colon Cancer Cells. PLoS ONE 7 (9): e45617. doi: 10,1371 /journal.pone.0045617

Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: April 3, 2012; Accepteret: August 23, 2012; Udgivet: 24 september, 2012 |

Copyright: © Xie et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 30.700.978). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Den kanoniske Wnt signalvejen spiller en central rolle i mange cellulære processer, fra fosterudvikling til voksen vævshomeostase [1]. Aktiviteten af ​​denne signalvej er bestemt af mængden af ​​β-catenin stede i cytoplasmaet. I mangel af Wnt-signalering, er cytoplasmatisk β-catenin normalt holdes på et lavt niveau gennem løbende ubiquitin-proteasom-medieret nedbrydning af β-catenin, som reguleres af en ødelæggelse kompleks sammensat af adenomatøs polyposis coli (APC), glycogensyntase kinase 3β (GSK-3β), Axin /Conductin, Caseinkinase 1α (CK1α), og andre proteiner, der medierer disse biokemiske reaktioner. Binding af Wnt proteiner til celleoverfladen receptorkompleks Fz /LRP letter phosphorylering af cytoplasmatiske hale af LDL-receptor-relateret protein (LRP) cytoplasmatiske hale af GSK-3β [2]. Dette udløser interaktionen af ​​Fz /LRP kompleks med Dishevelled (Dsh) og Axin, som fører til inaktivering af ødelæggelse kompleks, hvilket resulterer i akkumulering af ikke-phosphoryleret β-catenin i cytoplasmaet. Den akkumulerede β-catenin derefter translokerer til kernen og binder til Tcf /LEF transkriptionsfaktorer for at regulere nedstrøms target gener, såsom c-myc og cyclin D1 [3] -. [5]

Aberrant Wnt /β catenin signalering er blevet rapporteret at bidrage til forskellige humane sygdomme, herunder colorectal cancer (CRC) [6], [7]. APC-genet eller GSK-3β phosphoryleringssted inden exon 3 i

β-catenin

genet (

CTNNB1

) er muteret i mange cancerceller, herunder CRC, hvilket resulterer i den aktiverede transkriptionel aktivitet af β-catenin /Tcf signalering [8]. Desuden er nuklear translokation af β-catenin i CRC signifikant associeret med tumorudvikling og ringe overlevelse [9], [10]. Derfor styring af β-catenin og /eller kontrol med sin nedstrøms target genekspression er et ideelt mål for kræftmedicin og chemoprevention [11], [12], [13] .Van de Wetering

et al

. rapporterede, at knockdown af β-catenin af små interfererende RNA (siRNA) eller knockdown af TCF-4 ved dominant negativ TCF-4 (dnTCF) effektivt hæmmede aktiviteten af ​​TCF-reporter TOPFlash og induceret cellecyklusstop og vækst anholdelse i LS174T kolon kræftceller [14], [15].

et al.

Rapporterede imidlertid Tang at knockdown af TCF-4 ved siRNA’er øget cellevækst i DLD-1 colon cancerceller [16]. Disse uoverensstemmelser tyder på, at forskellige cellelinjer kan reagere forskelligt på TCF-4 knockdown.

FOXO4 er et medlem af underfamilien af ​​pattedyr FOXO forkhead transkriptionsfaktorer [17], som er vigtige i en række forskellige processer, herunder celleproliferation , differentiering, apoptose, DNA-reparation, og beskyttelse mod stress [18]. Det er en AKT nedstrømsmål og bliver phosphoryleret på tre højt konserverede serin og threoninrester (Thr-28, Ser-193, og Ser-258) efter PKB /AKT aktivering. Nylige undersøgelser har vist, at β-catenin binder til FOXO transskriptionsfaktoren, som spiller en tumor suppressor rolle i en række forskellige cancere. β-catenin binder til FOXO og forøger den transkriptionelle aktivitet [19]. Desuden cGMP-afhængig proteinkinase (PKG) inhiberer TCF signalering i colon cancerceller ved at blokere β-catenin-ekspression og aktivering FOXO4 [20]. Det fremgår derfor, β-catenin at tjene et dobbelt virkning ved at balancere positive (gennem TCF-4) og negative (gennem FOXO4) regulering af celleproliferation og apoptose.

I denne undersøgelse har vi den hypotese, at den nedstrøms transkriptionsfaktor TCF-4 er en mere lovende terapeutisk mål end β-catenin til behandling CRC. Vores mål var at sammenligne effekten af ​​TCF-4 knockdown og β-catenin knockdown på celleproliferation, apoptose, og kemosensitivitet i SW480 (mutant

APC

, vildtype

CTNNB1

) og HCT116 (mutant

CTNNB1

, vildtype

APC

) tyktarmskræft cellelinjer bruger korte hårnål RNA (shRNA). Vi viser, at sammenlignet med p-catenin knockdown, TCF-4 knockdown inhiberer signifikant celleproliferation, inducerer celle apoptose, og forbedrer kemosensitivitet af colon cancerceller gennem opregulering af FOXO4 transkriptionsaktivitet.

Materialer og metoder

Celledyrkning og reagenser

SW480 og HCT116-celler blev erhvervet fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og opretholdt i RPMI1640 tilsat 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 E /ml penicillin og streptomycin under standard dyrkningsbetingelser. Oxaliplatin blev 5-fluorouracil (5-FU) og methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Plasmidet pDC316-EGFP-U6 blev leveret af Vector Gene Technology Company Limited (VGTC, Beijing, Kina) og plasmidet pBHGloxΔE1 blev 3Cre fra Microbix Biosystems, Inc. (Microbix, Toronto, Canada).

rekombinante adenovirusvektorer

på grundlag af cDNA sekvenser (

β-catenin

GenBank nr.

NM_001098209,

Tcf-4

GenBank nr. NM_030756), en specifik par oligonukleotider med en kort hårnål og dens negative kontrol sekvens blev udformet og syntetiseret, og derefter indsat i en lille shuttle plasmid pDC316-EGFP-U6 ved BamHI og Hind III restriktionsenzymsites. Oligonukleotider blev designet med følgende primere [21]:

Forward β-catenin shRNA primer

‘- GATCCCGTGGGTGGTATAGAGGCTCTTCAAGAGAGAGCCTCTATACCACCCACTTTTTGGAAA-3′, omvendt β-catenin shRNA primer:. 5’-AGCTTTTCCAAAAAGTGGGTGGTATAGAGGCTCTCTCTTGAAGAGCCTCTATACCACCCACGG-3 «

Forward Tcf-4 shRNA primer

5′-GATCCCCGGAGCGACAGCTTCATATGTTCAAGAGACATATGAAGCTGTCGCTCCTTTTTGGAAA-3 ‘, omvendt Tcf-4 shRNA primer:

5′-AGCTTTTCCAAAAAGGAGCGACAGCTTCATATGTCTCTTGAACATATGAAGCTGTCGCTCCGGG-3;

Kontrol shRNA:. fremad

5′-GATCCCCCAGTAACTGAATAGCTACCTTCAAGAGAGGTAGCTATTCAGTTACTGTTTTTGGAAA-3 ‘, modsat retning. 5’-AGCTTTTCCAAAAACAGTAACTGAATAGCTACCTCTCTTGAAGGTAGCTATTCAGTTACTGGGG-3 ‘. Styringen shRNA havde ikke homologi til eventuelle relevante humane gener. Alle konstruktioner blev verificeret ved DNA-sekventering. De resulterende shuttle plasmider blev co-transficeret med adenovirus rescue plasmid pBHGloxΔE1, 3Cre i 293-celler at erhverve rekombinant adenovirus. Rekombinant adenovirus effektivitet blev påvist ved at undersøge den cytopatiske virkning og EGFP-ekspression i cellerne. Adenovirus titere blev målt efter amplifikation og rensning under anvendelse TCID50 assays.

kolonidannelse Assay Salg

SW480-celler blev inficeret med rekombinante adenovira i 90 minutter, og efter 24 timer blev de podet ved 300 celler /brønd i 6-brønds plader og fik lov til at binde i 24 timer. Efter inkubation blev mediet ændret, og pladerne blev inkuberet i yderligere 10 dage under de samme dyrkningsbetingelser. Kolonier blev fikseret og farvet med 0,1% krystalviolet i 100% ethanol og derefter talt. Kloner af mindst 50 celler blev talt som en koloni.

cytotoksicitetsassays

SW480-celler blev inficeret med de rekombinante adenovira i 90 minutter, og efter 24 timer blev de udpladet i 96-brønds plader ved 4000 celler /brønd. Efter 24 h dyrkning blev cellerne behandlet med de angivne koncentrationer af 5-FU eller oxaliplatin i 72 timer. Derefter blev 20 pi MTT (5 g /l) tilsat til hver brønd og inkuberet i yderligere 4 timer. Dyrkningsmedierne blev derefter kasseret, 0,15 ml dimethylsulfoxid (DMSO) blev tilsat, og pladerne blev inkuberet i yderligere 10 min med vibration. Absorbansen blev målt ved 490 nm under anvendelse af en mikropladelæser (model 550, Bio-Rad, USA).

Apoptose Assay

SW480-celler blev udpladet i seks-brønds plader ved en densitet på 0,5 × 10

6 celler /brønd. Fireogtyve timer efter udpladning blev cellerne ved 70% konfluens inficeret med adenovirus i 90 minutter og derefter vasket til fjernelse af adenovira. Efter yderligere 24 timers dyrkning blev den apoptotiske indeks bedømt ved flowcytometri under anvendelse Annexin-V-FITC kit som tidligere beskrevet [22].

Western blot-analyse

Celler blev høstet og totale proteiner blev ekstraheret med RIPA-buffer indeholdende proteaseinhibitorer. Western blot blev udført som tidligere beskrevet [22]. Kort fortalt blev lig protein portioner (50 ug) i hver prøve opløst ved 10 eller 12% natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE), og proteinerne blev overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner. Efter blokering med 5% fedtfri tørmælk blev membranerne inkuberet med antistoffer mod p-catenin (1:5,000), TCF-4 (1:1,000), c-myc (1:2000), cyclin D1 (1: 2000), FOXO4 (1:1000), FOXO4 S193 (1:500), p27KIP1 (1:2000), MnSOD (1:2000), Caspase-3 (1:500), og β-actin (1:3000) . Membranerne blev derefter inkuberet med et peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (1:2000) (Pierce, Rockford, IL, USA). Proteinerne blev detekteret med et forøget kemiluminescens påvisningssystem (Pierce), og lysemission blev fanget på Kodak røntgenfilm.

Transfektion og reportergenassay

I målinger af β-catenin /TCF-4 transkriptionel aktivitet, et par luciferase reporterplasmider (TOPflash /FOPflash; Upstate Biotechnology) blev anvendt. PRL-TK luciferasereportergen plasmid (Promega) blev cotransficeret at normalisere for transfektionseffektivitet. Transient transfektion blev udført under anvendelse Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN, USA) ifølge producentens anvisninger. Cellerne blev inficeret med de rekombinante adenovira i 90 minutter, og efter 24 timer, blev efterfølgende cotransficeret med TOPflash luciferase reporter (eller mutant kontrol FOP flash vektor) og pRL-TK. Efter yderligere 24 timers inkubation blev cellerne høstet for luciferaseaktivitet måling med dual-luciferase reporter assaysystem (Promega). blev udført tre replikat eksperimenter.

Statistisk analyse

Data blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse (standardafvigelse). Den statistiske signifikans af forskelle blev bestemt ved envejs variansen (ANOVA) under anvendelse af SPSS v12.0 software (SPSS, Chicago, Illinois, USA). En værdi på

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

1. Knockdown af TCF-4 eller β-catenin af adenovirus-medieret transduktion af shRNA

Sådan knockdown ekspression af TCF-4 eller β-catenin, blev adenovirusvektorer genereret til at udtrykke et shRNA målretning TCF-4 eller β- catenin. Western blot-analyse afslørede et dosisafhængigt fald i TCF-4 eller β-catenin-proteinekspression ved 48 timer efter infektion med de respektive adenovirale vektorer i SW480 og HCT116-celler, mens der ikke blev observeret nogen ændring i proteinet ekspression efter infektion med et adenovirus indeholdende scrambled shRNA (fig. 1).

SW480 og HCT116-celler blev behandlet med forskellige infektionsmultiplicitet (MOI) på adenovirus bærer shRNA. Prøver blev opsamlet ved 48 timer efter infektion. Western blot analyse af cellelysater for proteinet ekspression af β-catenin (a) og TCF-4 (b).

2. TCF-4 Knockdown Undertrykker Wnt Signaling

SW480 og HCT116 cellelinjer har konstitutivt aktiv β-catenin /TCF-4 transkriptionel aktivitet. Derfor blev cellerne transient transficeret med en TCF reporterplasmid, TOPflash, som består af tre TCF bindingssteder opstrøms for en minimal tk-promotoren og luciferase åbne læseramme, eller kontrol plasmid, FOPflash, der er identisk med TOPflash bortset fra at det indeholder mutant inaktive TCF bindingssteder. Figur 2a viste, at både β-catenin shRNA og TCF-4 shRNA markant undertrykt endogen β-catenin /TCF-4 transkriptionel aktivitet sammenlignet med kontrollen shRNA i både SW480 og HCT116 cellelinier.

SW480 og HCT116-celler var behandlet med adenovirus (50 MOI) transporterer shRNA. a, ved 24 timer efter infektion blev cellerne cotransficeret med reportergener huser TCF-4 bindingssteder (TOPflash) eller en mutant TCF-bindingssted (FOPflash) henholdsvis sammen med pRL-TK. Luciferaseaktivitet blev bestemt 24 timer efter transfektion, normaliseret mod værdier for den tilsvarende pRL-TK-aktivitet. Værdier repræsenterer middel ± S.D. af tre uafhængige forsøg. *

P

0,01 versus kontrol shRNA. b, ved 48 timer efter infektion blev cellerne høstet og proteinekspression blev bestemt ved Western blot.

cyclin D1

c-Myc

er kendt β-catenin /TCF-4 målgener, og derfor undersøgte vi også protein ekspression af cyclin D1 og c-myc ved Western blot. Figur 2b viser, at β-catenin shRNA eller TCF-4 shRNA behandling resulterede i et markant fald i cyclin D1 og c-myc-protein i både SW480 og HCT116-celler.

3. TCF-4 Knockdown Forhøjer FOXO4 Aktivitet

At analysere proteinniveauet og aktivering af FOXO4 protein, blev SW480 og HCT116-celler dyrket i 48 timer efter infektion med adenovirus, og proteinniveauet blev vurderet ved Western blot. Proteinet niveau af FOXO4 ikke blev signifikant ændret efter behandling med β-catenin shRNA eller TCF-4 shRNA (fig. 3). Imidlertid blev proteinniveauet af phosphoryleret FOXO4 S193 markant forøget efter behandling med β-catenin shRNA, og faldt efter behandling med TCF-4 shRNA (fig. 3). Ekspressionsniveauerne af FOXO målgener p27KIP1 og MnSOD blev markant nedsat efter behandling med β-catenin shRNA og forøget efter behandling med TCF-4 shRNA (fig. 3).

SW480 og HCT116-celler blev behandlet med adenovirus ( 50 MOI), der bærer shRNA. Prøver blev opsamlet ved 48 timer efter infektion. Proteinet niveau FOXO4, fosforyleret FOXO4 S193, p27KIP1, og MnSOD blev bestemt ved western blot.

4. TCF-4 Knockdown inhiberer Cell Proliferation og inducerer Cell Apoptose i Colorectal Cancer Cells

Vi næste undersøgte effekten af ​​TCF-4 knockdown på celledeling og apoptose i SW480 og HCT116 celler. Celleproliferation blev bestemt ved anvendelse af et kolonidannelse assay. Som vist i figur 4a, TCF-4 knockdown inducerede en signifikant stærkere inhibering af celleproliferation sammenlignet med p-catenin knockdown i både SW480 og HCT116-celler (p 0,05, s 0,01, henholdsvis). For at undersøge om TCF-4 shRNA-medieret vækstinhibering er associeret med apoptose, behandlede og ubehandlede celler blev analyseret ved flowcytometri. Som vist i figur 4b, både β-catenin shRNA og TCF-4 shRNA inducerede en signifikant stigning i antallet af apoptotiske celler sammenlignet med ubehandlede celler og kontrol shRNA behandlede grupper (p 0,01), og TCF-4 shRNA inducerede et større antal af apoptotiske celler end p-catenin shRNA (p 0,01). Den proapoptotiske enzym caspase-3 aktiveres ved et punkt af konvergens mellem indre og ydre apoptose induktion veje [23]. Derfor undersøgte vi caspase-3-spaltning som en markør af apoptose. Overensstemmelse med flowcytometri resultater, TCF-4 shRNA inducerede en større stigning i caspase-3-spaltning sammenlignet med p-catenin shRNA (fig. 4c).

Celler blev behandlet med adenovirus (50 MOI) transporterer shRNA for 24 timer. a, Celleproliferation blev bestemt ved anvendelse af et kolonidannelse assay. b, blev Cell apoptose bestemt under anvendelse Annexin-V-FITC-farvning. C blev Ekspressionen af ​​proapoptotiske enzym caspase-3 bestemt ved western blot. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdien ± s.d. af tre eller flere uafhængige bestemmelser. *

P

0,01 versus kontrol shRNA;

#

P

0,05 versus β-catenin shRNA;

##

P

. 0,01 versus β-catenin shRNA

5. TCF-4 Knockdown Forbedrer kemosensitivitet i tyktarmskræft Celler

SW480 og HCT116 celler blev forbehandlet med de rekombinante adenovirus bærer de respektive shRNA og blev derefter behandlet med 5-FU eller oxaliplatin i forskellige koncentrationer i 72 timer. Cellelevedygtighed blev bestemt under anvendelse af et MTT-assay. Som vist i figur 5, β-catenin shRNA behandling steg 5-FU og oxaliplatin-medieret cytotoksicitet. Desuden TCF-4 shRNA behandling resulterede i en mere markant stigning af cytotoksicitet i forhold til p-catenin shRNA behandling på hvert krydsfelt af 5-FU og oxaliplatin (p 0,01).

Celler blev inficeret med adenovirus (50 MOI), der bærer shRNA; 48 timer efter infektion blev celler behandlet med 5-FU eller oxaliplatin i forskellige koncentrationer i 72 timer. Cellelevedygtigheden blev bestemt under anvendelse af et MTT-assay. Bar grafer repræsenterer middelværdier af tredobbelte bestemmelser ± sd

Diskussion

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de mest almindelige voksne maligne tumorer forekommer i hele verden i både sygelighed og dødelighed . Trods forbedringer i medicinsk behandling, resultaterne af behandling for lokalt fremskreden og metastatisk sygdom er fortsat skuffende, med 5-års overlevelsesraten lavere end 10% hos patienter med metastaser. Aberrant WNT pathway signalering er en tidlig progression begivenhed i 90% af CRC. Det sker gennem mutationer af især

APC

(op til 80%) og mindre ofte af

β-catenin

(ca. 10%) eller AXIN2 [24]. Mutationer i

APC /β-catenin

gener, som resulterer i aberrerende aktivering af β-catenin /TCF-4-vejen, er almindelige i CRC, hvilket antyder, at målrettet inhibering af denne vej kunne være en potentiel terapeutisk fremgangsmåde at kontrollere CRC. Vi og andre har tidligere rapporteret, at naturlige forbindelser og ikke-steroide anti-inflammatoriske lægemidler (NSAID’er) inhiberer Wnt /β-catenin signalvej [22], [25], [26], [27], [28]. Imidlertid er der i øjeblikket ingen selektiv inhibitor for denne pathway tilgængelig som et terapeutisk middel. Nylige undersøgelser har vist, at shRNA-medieret gen-nedregulering af β-catenin signifikant inhiberer celleproliferation og inducerer celle apoptose i humane coloncancer-celler [29], [30], [31].

I den foreliggende undersøgelse, vi specifikt fokuseret på at sammenligne effektiviteter af β-catenin knockdown og Tcf-4 knockdown i tyktarmen kræftceller, og undersøgt de mulige molekylære mekanismer, der er ansvarlige for disse effekter. Vi har vist, at TCF-4 knockdown inducerer en væsentligt stærkere inhibering af celleproliferation, induktion af apoptose, og forbedring af kemosensitivitet i colon cancerceller sammenlignet med p-catenin knockdown.

Aktiveret β-catenin /TCF-4 signalering ved akkumulering af β-catenin i kernen er blevet impliceret i human carcinogenese, herunder CRC. Denne ophobning kan skyldes mutationen af ​​enten tumorsuppressorgen

APC

eller

β-catenin

selv. Mindst 60% af sporadiske CRC tilfælde indeholde en APC mutationen, og næsten halvdelen af ​​dem viser abnormiteter i både APC alleler [32], [33], [34]. I den foreliggende undersøgelse har vi foretaget en detaljeret mekanistisk forsøg at evaluere effekten af ​​hæmning af β-catenin /TCF-4-signalering i human CRC anvendelse af det humane CRC SW480-cellelinien, som huser mutant APC og vildtype β-catenin, og HCT116 cellelinien, der huser mutant β-catenin og vildtype APC. Vi først konstrueret adenovirale vektorer, der bærer human β-catenin eller TCF-4 shRNA for at knockdown ekspressionen af ​​β-catenin eller TCF-4. Western blot-analyse afslørede et dosisafhængigt fald i TCF-4 eller β-catenin proteinekspression i SW480 og HCT116-celler ved 48 timer efter infektion med de respektive adenovirale vektorer. Desuden har både β-catenin shRNA og TCF-4 shRNA markant undertrykt β-catenin /TCF-4 transkriptionel aktivitet samt ekspressionen af ​​to kendte målgener, cyklin D1 og c-myc, i SW480 og HCT116-celler. Disse data indikerer, at både β-catenin knockdown og Tcf-4 knockdown undertrykke β-catenin /Tcf-4-aktivitet

in vitro

.

Koordinering mellem celleproliferation og apoptose spiller en meget vigtig rolle i carcinogenese og udviklingen af ​​tyktarmskræft. Den β-catenin /Tcf-4-vejen er en vigtig signalvej som tips balancen i celledeling og apoptose i kræftceller. I vores undersøgelse, β-catenin knockdown inhiberede celleproliferation og induceret celle apoptose i både SW480 og HCT116-celler. Sammenlignet med β-catenin knockdown, TCF-4 knockdown inducerede en signifikant større inhibering af celleproliferation og induktion af apoptose. Desuden fandt vi, at TCF-4 knockdown væsentligt forbedret den kemosensitivitet af både SW480 og HCT116 celler til 5-FU og oxaliplatin.

Vi undersøgte de mekanismer, der er involveret i den differentierede effektiviteter af β-catenin knockdown og Tcf- yderligere 4 knockdown i SW480 og HCT116-celler. Vores data viser, at proteinniveauet af FOXO4 ikke ændrede efter behandling med både β-catenin og TCF-4 shRNA. Imidlertid blev β-catenin shRNA sig at forøge akkumulering af phosphoryleret FOXO4 S193 og formindske ekspressionen af ​​FOXO målgener p27KIP1 og MnSOD, hvilket stemmer overens med en tidligere rapport, der viser, at β-catenin-specifikt siRNA inhiberede TCF reporter aktivitet og FOXO- afhængig signalering i LS174 coloncancerceller [19]. I modsætning hertil viste TCF-4 shRNA den modsatte regulerende rolle for p-catenin på FOXO4. Disse resultater antyder, at β-catenin shRNA-induceret nedregulering af FOXO4-afhængig signalering er uafhængig af TCF-4.

FOXO faktorer spiller vigtige roller i at kontrollere celleproliferation, apoptose, og oxidativ stress [17]. [18]. Deres funktioner er reguleret af flere signalveje, herunder AKT. I fravær af AKT-aktivering, er FOXO4 placeret i kernen, hvor det fungerer som en transskriptionsfaktor [35]. Ved AKT aktivering, FOXO4 bliver phosphoryleret på tre højt konserverede serin og threoninrester (Ser-193, Thr-28 og Ser-258) efterfulgt af inaktivering og nuklear udstødelse [36]. Essers et al. [19] viste, at der var funktionelle vekselvirkning mellem β-catenin og FOXO i oxidativt stress signalering, og β-catenin-specifikke shRNA reducerede TCF og FOXO transkriptionel aktivitet i LS174T kolon cancerceller, som udtrykker en mutant form af β-catenin. Akkumulerende tyder på, at FOXO faktorer fungerer som tumorsuppressorer i en række forskellige kræftformer. Tang et al. [37] fandt også, at FOXO4 inhiberede ekspression af HIF-1α og VEGF i cancerceller. Desuden viste en nylig undersøgelse, at overekspression af vildtype FOXO4 førte til en stigning i doxorubicin-cytotoksicitet i HCT116 colon cancerceller, der blev yderligere forværret af overekspression af et FOXO4 mutant udelukkende lokaliseret i kernen [38].

Derfor er vi hypotesen, at opregulering af FOXO4 aktivitet er ansvarlig for større effektivitet af TCF-4 shRNA effekter i colon cancerceller sammenlignet med p-catenin shRNA. På den ene side kan TCF-4 og FOXO4 konkurrere om β-catenin [19]. Når Tcf signalering inhiberes, β-catenin binder direkte til FOXO4 og forøger FOXO4 transkriptionel aktivitet. På den anden side kan Tcf4 knockdown nedregulerer visse signalveje, såsom Akt. En nylig rapport viser, at der blev detekteret en signifikant reduktion af AKT2 niveauer og phosphorylering af Akt efter knockdown af TCF-4 ved anvendelse TCF-4 siRNA i gliomceller [39]. Derfor inaktivering af Akt af TCF-4 shRNA resulterer i dephosphorylering af FOXO4, hvilket følgelig aktiverer FOXO-afhængig signalering.

Som konklusion har vi vist, at målrettede hæmning af β-catenin /TCF-4-signalering inhiberer celle spredning, inducerer apoptose, og forbedrer kemosensitivitet af kolon kræftceller. I forhold til p-catenin knockdown viste TCF-4 knockdown større effektivitet til inhibering CRC cellevækst og inducere apoptose, som kan være relateret til en stigning i FOXO4 transkriptionsaktivitet. Disse resultater antyder, at TCF-4 kan være et attraktivt terapeutisk mål for CRC terapi. Der er behov for fremtidige undersøgelser for at bekræfte disse resultater og konstatere nytten af ​​at målrette Tcf-4.