PLoS ONE: Alternative signalveje som potentielle terapeutiske mål for at overvinde EGFR og c-Met Inhibitor Modstand i ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Brugen af ​​tyrosinkinasehæmmere (TKI’er) mod EGFR /c- mødtes i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) har vist sig at være effektiv til at øge patient progressionsfri overlevelse (PFS), men deres effektivitet er begrænset på grund af udvikling af resistens og tumortilbagevenden. Derfor forstå de molekylære mekanismer der ligger til grund udvikling af resistens i NSCLC er nødvendig for at udvikle nye og effektive terapeutiske tilgange til at forbedre patientens udfald. Denne undersøgelse har til formål at forstå mekanismen af ​​EGFR /c-Met-tyrosinkinaseinhibitoren (TKI) resistens i NSCLC. H2170 og H358 cellelinjer blev gjort resistente over for SU11274, en c-Met inhibitor og erlotinib, en EGFR-inhibitor, gennem trinvise stigninger i TKI eksponering. IC

50 koncentrationer af resistente linjer udviste en 4-5 og 11-22 gange stigning for SU11274 og erlotinib, når det blev sammenlignet med parentale linier. Endvidere blev mTOR og Wnt-signalering undersøgt i begge cellelinier for at bestemme deres roller i mediering TKI modstand. Vi observerede en 2-4-fold opregulering af mTOR signalproteiner og en 2- til 8-fold opregulering af Wnt signaling proteiner i H2170 erlotinib og SU11274 resistente celler. H2170 og H358 celler blev yderligere behandlet med den mTOR inhibitor everolimus og Wnt-inhibitoren XAV939. H358 resistente celler blev hæmmet med 95% i en tredobbelt kombination af everolimus, erlotinib og SU11274 sammenlignet med 34% af en dobbelt kombination af disse lægemidler. Forældrekontrol H2170 celler viste ingen følsomhed over for XAV939, mens resistente celler blev hæmmet betydeligt (39%) af XAV939 som et enkelt middel, såvel som i kombination med SU11274 og erlotinib. Lignende resultater blev opnået med H358 resistente celler. Denne undersøgelse tyder på en ny molekylær mekanisme af resistens i lungekræft

Henvisning:. Fong JT, Jacobs RJ, Moravec DN, Uppada SB, Botting GM, Nlend M, et al. (2013) Alternative signalveje som potentielle terapeutiske mål for at overvinde EGFR og c-Met Inhibitor Modstand i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 8 (11): e78398. doi: 10,1371 /journal.pone.0078398

Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA

Modtaget: April 3, 2013; Accepteret: September 11, 2013; Udgivet: November 4, 2013 |

Copyright: © 2013 Fong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Cancer Institute of National Institutes of Health under award nummer R21CA158965-01A1 https://www.nih.gov til Neelu Puri. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: Dr. Marie Nlend er ansat af Thermo Fisher Scientific . Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

EGFR og c-Met er begge meget udtrykt i NSCLC tumorer og har fælles signalveje [1] – [3]. Mens TKI’er mod EGFR og c-Met er på forkant af kræftbehandling, er deres individuelle effektiviteter begrænset [4] på grund af udviklingen af ​​resistens [5]. c-Met forstærkning står for mere end 20% af erhvervet resistens til EGFR TKI’er i NSCLC både

in vitro

in vivo

[6], [7]. Desuden udvikling af sekundære “gatekeeper” mutation T790M udgør 50% af alle erhvervet resistens til EGFR TKI’er både

in vitro

og

in vivo

[8]. Også dens tilstedeværelse før behandling med TKI’er resulterer i primær resistens mod EGFR TKI-behandling [9]. Derfor, for at udforske resistensmekanismer er det vigtigt at foretage yderligere

in vitro

undersøgelser til bestemmelse af målproteiner ansvarlige for TKI modstand i NSCLC.

SU11274 er en ATP-konkurrencedygtig lille molekyle hæmmer af katalytiske aktivitet af c-Met [10] og er effektiv mod NSCLC [11]. Tivantinib, en c-Met TKI som hæmmer tumorvækst i mus [12], er i øjeblikket i kliniske fase III forsøg, og har vist sig at øge PFS fra 9,7 til 16,1 uger, når det gives i kombination med erlotinib [13], [14]. I disse forsøg, kun visse patient delmængder (KRAS mutanter, ikke-pladecellekræft histologi og EGFR vildtype status) udviste signifikant øget progressionsfri overlevelse [14], hvilket tyder på, at nye TKI’er skal tilføjes til denne kombination. Derudover behandling med en kombination af MetMab (anti c-Met mAb) og erlotinib reducerede risikoen for dødsfald med 3-fold i kun en delmængde af patienter positive for c-Met-ekspression [15]. Mens brugen af ​​kombinerede terapi modaliteter kan begrænse muligheden af ​​tumorer til at udvikle resistens [7], forstå resistensmekanisme er den bedste fremgangsmåde for at forbedre målrettet terapi [16].

Undersøgelser foretaget af vores gruppe og andre angiver at c-Met og EGFR har betydelig krydstale som øger effektiviteten for TKI kombinationer

in vitro

[1], [17]. Dette skyldes det faktum, at HGF kan transaktivere EGFR og phosphorylering af EGFR kan aktivere c-Met resulterer i synergistiske virkninger på tumorvækst [18] – [20]. Derfor undersøgte vi en ny behandlingsmetode for at overvinde modstand mod EGFR, c-Met og EGFR /c-Met TKI kombinationsbehandlinger i NSCLC. For yderligere at forstå hvordan celler udvikler denne modstand vi udviklet H2170 og H358 NSCLC cellelinier med erhvervet resistens over for TKI’er af c-Met, EGFR og en kombination af begge. Disse cellelinier blev valgt, fordi de udtrykker høje niveauer af EGFR og c-Met, er synergistisk inhiberes af EGFR /c-Met TKI’er og ikke har eksisterende EGFR eller c-Met resistens mutationer.

Tidligere undersøgelser har vist forbedret effekt med kombinationsterapier sammenlignet med monoterapier [13], [14], [21] – [24]. Den mTOR-hæmmer rapamycin er i stand til at samarbejde med c-Met inhibitor PHA665752 i NSCLC [25]. Yderligere, ved anvendelse af erlotinib og rapamycin eller everolimus (en oralt indgivet derivat af rapamycin) i kombination har vist synergistiske virkninger på cellelevedygtighed, proliferation og autofagi [26], [27]. Denne kombination viste sig også at genoprette gefitinib følsomhed [28]. Men disse undersøgelser kun administreret EGFR og mTOR inhibitorer i kombination. I vores undersøgelser har vi fundet, at mTOR-hæmmere kan øge effektiviteten af ​​EGFR /c-Met TKI kombinationsbehandling mod NSCLC

in vitro

. Endvidere er det blevet foreslået, at krydstale mellem EGFR og Wnt-vejen kan deltage i indtræden og progression af tumorigenese og krydstale mellem ligander af separate RTK medierede pathways kan lette modstand mod TKI’er [29]. Hyperaktivitet af Wnt i brystcancer har vist sig at transaktivere EGFR og omvendt kan aktiveres EGFR bidrage til øget effekt af den kanoniske Wnt-vejen [30] – [33]. Derudover har undersøgelser af patientens tumor sektioner vist en positiv sammenhæng mellem EGFR aktiverende mutationer og nuklear ophobning af β-catenin i primær NSCLC [34]. Det har også vist sig, at Wnt /β-catenin pathway har en væsentlig rolle i celle vedligeholdelse, patogenese og resistens efter EGFR inhibering i NSCLC [35].

Vores data viser, at tilsætning af Wnt-inhibitorer til TKI’er SU11274 og erlotinib resulterer i signifikant nedsat levedygtighed i cellelinjer med erhvervet resistens over for kombinationen EGFR /c-Met TKI-terapi. Vi foreslår, at aktivering af alternative signalveje er en mulig molekylær mekanisme af resistens i NSCLC, udnytte c-Met, EGFR, mTOR og Wnt-hæmmere kan i høj grad forbedre lungekræft patient prognose og være grundlag for nye kliniske forsøg.

Materialer og metoder

Reagenser og antistoffer

SU11274: [(3Z) -N- (3-chlorphenyl) -3 – ({3,5-dimethyl-4 – [(4 -methylpiperazin-1-yl) carbonyl] 1H-pyrrol-2-yl} methylen) -N-methyl-2-oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonamid] og XAV939: [3,5, 7,8-tetrahydro-2- [4- (trifluormethyl) phenyl] -4H-thiopyrano [4,3-d] pyrimidin-4-on] blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Erlotinib og Everolimus blev opnået fra LC Laboratories (Woburn, MA). Tivantinib blev opnået fra Chemietek (Indianapolis, IN). Alle inhibitorer blev suspenderet i DMSO og opbevaret i 0,1 ml alikvoter ved -20 ° C. HGF blev opnået fra Peprotech (Rocky Hill, NJ) og EGF opnåedes fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Phosphospecifikt kanin mAb’er for p-EGFR (Tyr1068, Clone D7A5) blev p-mTOR (Ser2448, Clone D9C2) og p-4E-BP1 (Thr37 /46, klon 2855) opnået fra Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA) . Phosphospecifikt kanin polyklonale antistoffer rettet mod p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, 2532) og p-p70S6K (Tyr421 /Ser424, 9208) blev opnået fra Cell Signaling Technology. En kanin polyklonalt antistof til p-c-Met (Tyr 1003 44882G) blev opnået fra Invitrogen (Carlsbad, CA). En muse-mAb til aktiv β-catenin (klon 8E7, 05-665) blev opnået fra Millipore (Billerica, MA). For Wnt signalering undersøgelser blev alle antistoffer opnået fra Wnt signalering antistof prøveudtager kit fra Cell Signaling Technology (2915). Phosphoryleret kanin mAbs for p70S6K (2708) og mTOR (2983) blev opnået fra Cell Signaling Technology. Ikke-phosphoryleret c-Met (C-12, SC-10) og EGFR (1005 sc-03) blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). En muse-mAb til β-actin (A5441) blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Mus (7076) og kanin (7074) IgG sekundære antistoffer blev opnået fra Cell Signaling Technology. Alle antistoffer blev anvendt som beskrevet i fabrikantens instruktioner.

cellelinier og Cell Culture

H358 og H2170 NSCLC cellelinjer blev opnået fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, CRL-5807 og CRL-5928, henholdsvis) og dyrkes i henhold til deres anvisninger. Cellelinier blev inkuberet ved 37 ° C og 7% CO

2 og blev opretholdt i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium (Thermo Fisher Scientific, Pittsburg, PA, Cat No: SH3002701) suppleret med 10% (v /v) føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA) og 1% (v /v) antibiotikum /antimykotiske (Invitrogen, Cat No: 15240). Til undersøgelse af virkningerne af erlotinib og SU11274 som enkelte terapeutiske midler, såvel som i kombination, blev H358 og H2170-celler udpladet i plader med 6 brønde og behandlet efter 24 timer. Derefter blev MTT levedygtighed assays og western blots udført som beskrevet nedenfor. IC

50 værdier for hver cellelinje blev beregnet under anvendelse Sigma Plot V12.0 (SYSTAT Software, San Jose, CA).

MTT cellelevedygtighed Assays Salg

Cellelevedygtighed blev målt ved en MTT kolorimetrisk farvestof reduktion assay (Sigma, St. Louis, MO) under anvendelse af 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) ifølge producentens instruktioner. Hvert forsøg blev udført i plader med 96 brønde i replikater af seks for hver behandlingsgruppe tilstand og gentaget tre gange. Celler blev udpladet med 5000 celler /brønd og behandlet med inhibitorer efter 24 timers vækst. På 96 timer efter galvanisering blev procent cellelevedygtighed beregnet i forhold til at styre ved at måle absorbansen ved en bølgelængde på 570 nm. Celler behandlet med tivantinib blev eksponeret kun i 24 timer, hvorefter lægemidlet blev fjernet. Celler blev derefter vasket og inkuberet i yderligere 72 timer som beskrevet af tidligere forskere [12].

Fremstilling af cellelysater og Western Blotting

Celler blev dyrket og lyseret som beskrevet tidligere [36] , [37] i puffer indeholdende 20 mM Tris (pH, 8,0), 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1% NP-40, 0,42% NaF, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mM natriumorthovanadat og 10 mM protease inhibitor cocktail (Sigma- Aldrich). Cellelysater blev adskilt ved 7,5% eller 10% SDS-PAGE under reducerende betingelser. Proteiner blev derefter overført til immobilisering membraner (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Membranerne blev derefter probet med de førnævnte antistoffer. Blots blev visualiseret under anvendelse af et forøget kemiluminescens-kit (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) og kvantificering af modulation af forskellige proteiner blev udført under anvendelse af NIH ImageJ software.

Specifik phosphorylering af c-Met /EGFR og andre signalveje via HGF /EGF og deres hæmning

Celler blev frataget vækstfaktorer ved inkubering i 24 timer i serum-frit medium indeholdende 0,5% BSA med eller uden inhibitorer. Efter behandling blev celler stimuleret med 40 ng /ml HGF i 7,5 minutter eller 5 ng /ml EGF i 5 minutter ved 37 ° C. Efter fremstilling lysater blev Western-blotting udført som beskrevet ovenfor.

Immunofluorescens

10.000 celler blev udpladet på glas kammerobjektglas (Lab-Tek, Scotts Valley, CA) og fik lov til at klæbe i 24 timer i serumfrit medium med 0,5% BSA. Celler blev derefter behandlet med EGF i 15 minutter, fikseret med 1:01 acetone: methanol og visualiseret med p-EGFR (Y1068) primært antistof, anti-kanin DyLight 488 (grøn) sekundært antistof (Thermo Fisher Scientific) og Hoechst farvestof for nuklear farvning (blå) anvendelse af et Zeiss Axio Observer Z1 fluorescerende mikroskop. NIH ImageJ software blev anvendt til at måle den samlede celle-fluorescensintensitet over 8 mikroskopiske felter pr tilstand og værdier blev beregnet.

DNA Sequencing

5 millioner celler blev udpladet på skåle med en diameter på 150 mm og fik lov til at klæbe og vokse i medier som beskrevet ovenfor. DNA blev ekstraheret under anvendelse af Qiagen DNeasy® Blood Tissue kit (kat. Nr. 69.504) efter producentens instruktioner. PCR blev derefter udført for at amplificere exoner 18-21 af EGFR anvendelse af primere beskrevet af Paez et al [38], under anvendelse af AmpliTaq Gold® PCR Master Mix (Applied Biosystems, kat. Nr. 4.327.058). PCR-produkterne blev oprenset ved anvendelse af GeneJET ™ PCR Purification Kit (kat. Nr. K0701) og blev derefter sekventeret ved University of Illinois DNA Services Facility.

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført under anvendelse af SPSS 17.0 software. Gentagne målinger af ANOVA med flere parvise sammenligninger og brugerdefinerede kontrast til Bonferroni justeringer blev udført. Statistisk signifikans blev bestemt med α ved 0,05. For at bekræfte forskellene mellem behandlingerne en parret to-tailed Students

t

-test blev også anvendt. For alle analyser blev en p-værdi på mindre end 0,05 anses for at være statistisk signifikant.

Resultater

Etablering af lægemiddelresistente cellelinier

For at identificere passende koncentrationer af SU11274 , erlotinib og en kombination af begge TKI’er for udvikling af resistente cellelinier blev H2170 og H358 cellelinier behandlet med progressivt stigende koncentrationer af SU11274 (2,5-17 uM) [1], erlotinib (0. 5-14 pM) [39 ], eller begge SU11274 (1,25-13,5 um) og erlotinib (0,25-9 uM) i 96 timer. H2170 og H358 cellelinjer blev valgt, fordi de ikke har EGFR TK eller c-Met mutationer. IC

50 værdier for individuelle TKI’er eller en kombination blev bestemt for hver cellelinje (tabel 1). Celler blev derefter behandlet med stigende koncentrationer af SU11274 [1], erlotinib [39] eller en kombination i flere uger, hvorefter fem individuelle resistente kloner blev isoleret fra enkelte celler, ekspanderet og derefter kontrolleres for stabil modstand efter hver seriel passage (en gang om ugen ) [40]. Resistente celler blev dyrket i fravær af TKI’er til 12 passager (12 uger) og blev fundet at bibeholde resistens. Resistente kloner fra cellelinier beskrevet i tabel 1, med IC

50 koncentrationer (bestemt som beskrevet i materialer og fremgangsmåder afsnit) 4-5 gange højere for SU11274, 11-22 gange højere for erlotinib, og 6-8- fold højere for SU11274 og 15-30 gange højere for erlotinib i kombination, blev isoleret og udvalgt til yderligere undersøgelser. Lavere koncentrationer var nødvendige for kombination modstand, da vi observerede forbedrede virkning af erlotinib og SU11274 når de blev anvendt i kombination. Lignende resultater blev opnået med andre resistente kloner (data ikke vist).

SU11274 resistente (SR) celler udviser nedsat følsomhed ved den orale c-Met inhibitor, tivantinib

Virkningen af tivantinib, en oral c-Met TKI øjeblikket i kliniske forsøg [12], [14], på inhibering af cellevækst i parentale og resistente celler blev undersøgt. Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af tivantinib i 24 timer, hvorefter lægemidlet blev fjernet [12]. Celler blev derefter vasket og inkuberet i yderligere 72 timer og til slut en MTT levedygtighed blev udført. Som vist i fig. 1, ved 0,1 uM tivantinib blev H2170 parentale celler inhiberes med 32% i sammenligning med ubehandlede parentale celler, mens resistente celler kun blev inhiberet med 10% i sammenligning med ubehandlede resistente celler (p 0,01). Munshi et al har også vist følsomhed over for mikromolære koncentrationer af tivantinib i NSCLC som observeret i vores studier [12]. En 3-fold fald i inhibering blev observeret i H2170-resistente celler sammenlignet med parentale celler (n = 6, p 0,01). I SR H358 celler behandlet med 0,2 uM tivantinib blev en 3,7-fold reduktion i inhibering ses i resistente celler sammenlignet med parentale celler (n = 6, p 0,01) (Fig1B). Disse data antyder, at SR-celler er også modstandsdygtige over for tivantinib.

H2170 og H358-celler blev behandlet med tivantinib (0,01-0,4 uM) i 24 timer blev tivantinib fjernet, og cellerne blev inkuberet i 72 timer, hvorefter MTT levedygtighed blev udført. SR H2170 celler viste en 3,2 gange formindskelse i følsomhed over for anti-proliferative effekt af tivantinib ved 0,1 uM tivantinib sammenlignet med parentale celler. En 3,7 gange formindskelse i vækstinhibering blev også observeret i SR H358-celler med 0,2 uM tivantinib sammenlignet med parentale celler. De viste data er repræsentative for tre uafhængige forsøg, der viser lignende resultater (n = 6, p 0,01).

Den T790M sekundære mutation er ikke nødvendigt for erlotinib modstand

Resultater af DNA Sanger sekventering af PCR-produkter fra exon 18-21 fra H2170 og H358 forældre- og resistente celler viste ingen sekundære erlotinib /gefitinib T790M eller D761Y modstand punktmutationer [41]. Disse resultater bekræfter, at vores celler ikke har kendt sekundære mutationer, der ville forårsage resistens. Således kan den mekanisme, som de er resistente skyldes alternativ signalering gennem andre receptorer end EGFR.

Effekt af EGF og erlotinib på EGFR phosphorylering og signalanlæg proteiner i to resistente NSCLC modeller

I for at forstå den mekanisme af erlotinib modstand, sammenlignede vi to forskellige erlotinib resistente cellelinier, H2170 ER og H358 ER, med deres respektive parentale cellelinjer. Celler blev behandlet med enten fortyndingsmiddel, EGF, erlotinib eller EGF + erlotinib. Erlotinib resistente (ER) H2170 celler syntes at udstille konstitutivt autophosphoryleret EGFR (Y1068) i fravær af dens ligand, EGF (19-dobling), mens ER H358 celler udviste en 6-fold fald i p-EGFR (Y1068) i tilstedeværelse af EGF (fig 2A). Disse resultater blev bekræftet af immunfluorescens som viste en minimal effekt af EGF på EGFR fosforylering i ER H2170 celler. Efter behandling på +/- EGF blev H2170 forældre- og H2170-ER celler farves ved hjælp af en specifik primær anti-phospho EGFR (Y1068) antistof og DyLight 488-konjugeret gede anti-mus sekundært antistof phosphoryleret EGFR (grøn) og kerner blev farvet blå med Hoechst farvestof. Dette tyder autophosphorylering af EGFR (fig 2B). Når de samlede fluorescensenheder blev målt, blev en 3.8- og 1,7 gange stigning i fluorescens observeret i nærvær og fravær af EGF henholdsvis i resistente celler sammenlignet med parentale celler (n = 8, p 0,01). Interessant var der ingen signifikant forskel i fluorescens i H2170 ER celler i nærvær og fravær af EGF (p 0,01).

A. EGFR autophosphoryleret i ER H2170 og nedreguleret i H358-E4 resistente cellelinier. p-mTOR (S2448) og dens nedstrøms signalering protein phospho-p70S6K (T389) opreguleres i begge resistente cellelinier. H2170 og H358 parentale og resistente cellelinier blev sultet natten over i 0,5% BSA og derefter behandlet med eller uden 7,0 uM af erlotinib i 24 timer og celler blev stimuleret med 10 ng /ml EGF i 2,5 minutter. Højere koncentrationer af erlotinib anvendtes da disse NSCLC cellelinjer har ingen EGFR TK mutation. Autophosphorylering af EGFR på Y1068 blev set i fravær af EGF i ER H2170 celler, som ikke blev set i ER H358-E4-celler. Opregulering af p-mTOR og dens downstream protein phosho-p70S6K (T389) ses i H2170 resistente linier +/- erlotinib. ER H2170 celler viser øget EGFR fosforylering +/- EGF. Opregulering af p-ERK (2-5 gange) blev også set i ER H2170 og H358 celler i +/- erlotinib B. For at bekræfte autophosphorylering af EGFR blev celler udpladet på kammerskiver, fik lov til at klæbe i 24 timer og derefter udsultet natten over. Celler blev derefter behandlet med +/- EGF i 15 minutter, fikseret med acetone: methanol og visualiseret med p-EGFR (Y1068) primært antistof og anti kanin DyLight sekundært antistof (Thermo Fisher Scientific) (grøn) eller Hoechst farvestof for nuklear farvning ( blå) på et Zeiss Axio Observer Z1 fluorescerende mikroskop. Graf, der viser relative gennemsnitlige samlede celle fluorescens enheder pr 8 mikroskopiske felter. Der var en 3,8 gange stigning i fluorescens, når man sammenligner forældrenes til resistente celler i fravær af EGF i H2170 celler.

Vi studerede yderligere effekten af ​​erlotinib modstand på mTOR pathway, en vigtig regulator af cancercellevækst [42], ved at måle p-mTOR og dets nedstrøms substrat p-p70S6K. I ER H358 og H2170-celler, opregulering (2-4 gange) af p-mTOR blev observeret i nærvær af erlotinib (Fig 2A). Endvidere blev opregulering (2 gange) p-p70S6K også observeret i ER H2170 og H358 celler i tilstedeværelsen af ​​erlotinib. Yderligere blev p-ERK også opreguleret (2-5 gange) i ER H2170 og H358 celler i nærvær og fravær af erlotinib (Fig 2A). Ingen graduering af total mTOR, EGFR, p70S6K eller ERK blev observeret (Fig S1). Vores resultater viser, at mTOR pathway og andre receptorer kunne opregulere p-p70S6K derved at mediere resistens gennem to særskilte mekanismer i H2170 og H358 NSCLC modeller. Salg

Virkning af HGF og SU11274 på c-Met phosphorylering og signalproteiner i to NSCLC modeller

for at forstå modstanden mekanisme til at c-Met-hæmmere, vi etableret SR H2170 og SR H358 cellelinjer og behandlet dem med fortynder, HGF, SU11274 og HGF + SU11274. SR H2170 og SR H358 celler udviste en 4- og 1,5 gange nedregulering af p-c-Met (Y1003) henholdsvis med ingen ændringer i de samlede c-Met-niveauer som analyseret ved Western blotting (fig 3). Nedregulering synes at være fuldstændig uafhængig af enhver SU11274 behandling siden blev observeret nedreguleringen efter seks passager i fravær af lægemidlet. Dette kunne indikere, at SR H2170 og H358 ikke udnytter p-c-Met som et middel til modstand, som vil foreslå en separat mekanisme. Svarende til ER-celler, i ubehandlede SR H2170 celler, fandt vi en markant opregulering (20 gange) p-p70S6K, et protein nedstrøms for mTOR, der er involveret i cancer celleoverlevelse [42], og en opregulering blev set i celler behandlet med HGF og SU11274 (figur 3). En 2-fold opregulering i p-4E-BP1, protein nedstrøms for mTOR, der fremmer tumorgenicitet, blev observeret i både SR H2170 og H358-celler (Fig 3). Ingen graduering af total mTOR, blev EGFR, p70S6K eller ERK observeret i enten cellelinje (Fig S1). Disse resultater indikerer, at mTOR pathway kan være involveret i at mediere resistens. Salg

Celler blev sultet natten over og derefter behandlet med eller uden 8,0 uM SU11274 i 24 timer. Celler blev stimuleret med 40 ng /ml HGF i 2,5 minutter, hvorefter western blot-analyse blev udført. Nedregulering af p-c-Met (Y1003) sås i begge cellelinier. Opregulering af p-p70S6kinase (S371) blev observeret i SR H2170 celler. Opregulering af p-4E-BP1 (T37 /46) blev også observeret i begge cellelinier +/- SU11274.

Aktivering af Wnt-vejen bidrager til EGFR /c-Met TKI resistens

Wnt vej regulerer cellulær proliferation og spiller en central rolle i udviklingen af ​​lungecancer [43], [44]. Da β-catenin signalering blev vist at aktivere ERK signalvejen [45], undersøgte vi p-ERK (T202 /Y204) og aktiv β-catenin som reaktion på HGF over tid i SR H2170 celler. Vi fandt, at p-ERK forblev forhøjede i mere end 120 minutter i SR H2170 celler, men kun i 30 minutter i parentale celler (Fig 4A). Interessant i ikke-stimulerede celler, basale niveauer af aktiv β-catenin (2 gange) og p-ERK (5,6 gange) var højere og forblev forhøjede i 120 minutter efter HGF behandling i SR H2170 celler sammenlignet med parentale celler efter en 60 minutters inkubation (n = 3, p 0,01) (fig 4A), hvilket tyder krydstale af c-Met, mTOR og Wnt-vejen. Efter behandling med SU11274 og HGF, observerede vi en 3-8 gange forøgelse i aktiv β-catenin i nærvær og fravær af SU11274 i SR H2170 celler (Fig 4B). En 2-3-fold opregulering af p-LRP6 i nærvær og fravær af SU11274 blev også set. Opregulering af proteiner associeret med Wnt-vejen blev bekræftet i ER H2170 celler. Vi observerede en 2-4 gange stigning og 3-5 gange forøgelse af p-LRP6 i fravær eller nærvær af erlotinib hhv. LRP6 phosphorylering kan indikere aktiveringen af ​​Wnt-vejen [46]. Vi har også observeret en 2-3,5 gange forøgelse i ekspressionen af ​​Axin1, en regulator af LRP6, og efterfølgende Wnt vej [31] (Fig 4C).

A. I SR H2170 celler, HGF inducerede udtales p-ERK-signalering sammenlignet med parentale celler. Celler blev sultet i 48 timer og derefter stimuleret med 40 ng /ml HGF. Western blotting i SR H2170 anført, at HGF aktiverede p-ERK (T202 /Y204) fortsat høj i 120 minutter i forhold til forældrenes linjer. Basale niveauer af aktiv β-catenin var også 2 gange højere og forblev høj (3,6 gange) i 120 minutter efter HGF behandling i SR H2170 celler sammenlignet med dem i parentale celler over 60 minutters inkubation. Disse forsøg blev udført tre gange. Relativ densitometri af p-ERK /β-actin i SR H2170 celler blev afbildet som er et gennemsnit af tre uafhængige forsøg (n = 3, p 0,01). B. Regulering af proteiner i Wnt signalvejen efter behandling af H2170 med SU11274. Opregulering af pLRP6 (2 til 3.0 gange) og β-catenin (3 til 8.0 gange) blev set hos resistente H2170 celler i nærvær eller fravær af SU11274. C. forordning af proteiner i Wnt signalvejen efter behandling af ER H2170-celler med erlotinib. Opregulering af LRP6 (2 til 5 gange), og Axin1 (2 til 3,5 gange) blev set hos resistente H2170 celler i nærvær eller fravær af erlotinib.

Væksten af ​​H2170 og H358 kombination resistente (CR) celler inhiberes af everolimus og XAV939

Da mTOR pathway er involveret i anticancerlægemiddel resistens [47], følsomhed over for mTOR inhibering i CR H2170 og H358 cellelinjer blev testet. Behandling med 1 um everolimus inhiberede H358 parentale celler ved 40% og resistente celler ved kun 20%. Interessant, den samme koncentration af everolimus hæmmede væksten af ​​parentale celler fuldstændigt og resistente celler med 95% ved anvendelse i kombination med enten SU11274 (8 uM) eller erlotinib (8 uM) (Fig 5A). Lignende resultater blev fundet i CR H2170 celler (99% inhibering af vækst, data ikke vist). Vi derefter testet effekten af ​​Wnt inhibering i resistente celler. H2170 parentale og CR cellelinjer blev behandlet med stigende koncentrationer af XAV939 og en MTT levedygtighed blev udført. Interessant nok viste parentale celler lille eller ingen respons på XAV939 imidlertid CR-celler blev inhiberet på en dosis reagerende måde (Fig 5B). Når endvidere XAV939 blev kombineret med SU11274 (8 uM) og erlotinib (8 uM), blev en 85% fald i levedygtighed observeret i CR-celler. Dette antyder, at Wnt signalering har en stor rolle i resistente celler. Salg

Celler blev behandlet i 96% vækstinhibering blev observeret, når everolimus blev anvendt med både SU11274 og erlotinib. B. Parental H2170 celler viser ringe eller ingen inhibering, når det gives stigende koncentrationer af XAV939. Omvendt CR H2170-celler, når de behandles med XAV939, blev inhiberet på en dosis reagerende måde. H2170 CR celler viser 40% hæmning til Wnt antagonist XAV939 (10 uM) alene, viste en 85% hæmning med tredobbelt kombination af XAV939, SU11274 og erlotinib (p 0,01). Hvert forsøg for hver behandling tilstand blev gentaget tre gange.

Diskussion

molekylært målrettet TKI’er blevet en integreret del af behandlingen, der anvendes af klinikere til at bekæmpe tidligere uhelbredelige NSCLC. Imidlertid har erhvervet resistens over for TKI’er alvorligt begrænset, i hvilket omfang denne behandling kan anvendes effektivt. I modsætning til tidligere undersøgelser, som har fokuseret på EGFR-mutationer [8], [48], undersøgte vi muligt alternativ signaleringsveje i lægemiddelresistente cellelinier. Vi studerede to NSCLC model cellelinjer, som udviste enten opregulering (H2170) eller nedregulering (H358) p-EGFR og nedregulering p-c-Met (H2170 og H358). Resistente celler udviste ikke hverken T790M eller D761Y mutationer, hvilket antyder anvendelsen af ​​en alternativ signalering mekanisme til at overvinde erlotinib modtagelighed. Interessant både H2170 og H358 resistente celler viser opregulering af mTOR pathway. Desuden viste H2170 resistente cellelinier modulation af både mTOR og Wnt veje hvilket tyder deres roller i den mekanisme af resistens.

I øjeblikket er etableret nogen forbindelse mellem c-Met TKI-modstand og mTOR i NSCLC. tidligere undersøgelser tyder imidlertid på, at inhibering af c-Met-kinaseaktivitet medfører reduceret aktivering af PI3K /AKT /mTOR pathway i transformerede celler [25]. Men i den foreliggende undersøgelse, observerede vi ingen phosphorylering af c-Met i H2170 og H358 resistente cellelinier, når de behandles med SU11274. Dette antyder, at SU11274, mens en effektiv inhibitor af c-Met-phosphorylering, har ringe effekt på inhiberingen af ​​mTOR og dets nedstrøms signalveje nødvendige for cellevækst og overlevelse hos resistente linjer [25]. Da resistente cellelinier har vist sig at proliferere i nærvær af SU11274, foreslår vi alternative veje har en vigtig rolle i at overvinde c-Met-inhibering og yderligere molekylær målretning kan være nødvendig for at inhibere cellevækst. Rolle mTOR pathway i resistensmekanismer erkendes ved en 2-4 gange forøgelse af p-mTOR hos resistente H2170 og H358 celler sammenlignet med parentale celler som respons på erlotinib behandling.