PLoS ONE: Genome Wide Kortlægning afslører PDE4B- som en IL-2 induceret STAT5 Target Gene i aktiverede humane PBMC’er og lymfoide Cancer Cells

abstrakt

IL-2 er den primære vækstfaktor til fremme overlevelse og proliferation af aktiverede T-celler, som forekommer efter indgreb af Janus kinase (JAK) 1-3 /og Signal Transducer og aktivator af transkription ( STAT) 5 signalvej. STAT5 har to isoformer: STAT5A og STAT5B (almindeligvis benævnt STAT5), der, i T-celler, spiller redundante roller omskriver cellecyklus og overlevelse gener. Som sådan kan inhiberingen af ​​STAT5 ved en række forskellige mekanismer hurtigt inducere apoptose i visse lymfoide tumorceller, hvilket antyder, at den og dens målgener repræsenterer terapeutiske mål til bekæmpelse af visse lymfesygdomme. At søge efter disse molekyler vi tilpasset IL-2 regulerede gener påvises ved Affymetrix genekspression microarrays med STAT5 cistrome identificeret ved chip-on-chip-analyse i en IL-2-afhængig human leukæmi cellelinje, KIT225. Vælg overlappende gener blev derefter valideret ved hjælp QRT

2PCR medium gennemløb arrays i humane PHA-aktiverede PBMC’er. 19 formodede gener, en nøgle regulator af T-cellereceptor signalering, PDE4B, blev identificeret som en ny mål, som var let opreguleret på proteinniveauet (3 h) i IL-2 stimulerede aktiverede humane PBMC’er. Overraskende, kun oprenset CD8 + primære T-celler udtrykte PDE4B, men ikke CD4 + celler. Desuden PDE4B blev fundet at være højt udtrykt i CD4 + lymfoide cancerceller, hvilket antyder, at det kan repræsentere en fysiologisk rolle unik for CD8 + og lymfoide cancerceller og således kan udgøre et mål for farmaceutisk indgriben for visse lymfesygdomme.

Henvisning: Nagy ZS, Ross JA, Rodriguez G, Balint BL, széles L, Nagy L, et al. (2013) Genom Wide Mapping afslører PDE4B- som en IL-2 induceret STAT5 Target Gene i aktiverede humane PBMC’er og lymfoide kræftceller. PLoS ONE 8 (2): e57326. doi: 10,1371 /journal.pone.0057326

Redaktør: Ramin Homayouni, University of Memphis, USA

Modtaget: September 6, 2012; Accepteret: 21 januar 2013; Publiceret: 25 feb 2013

Copyright: © 2013 Nagy et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud nummer AI053566 til Rak og et pilotprojekt tilskud til ZSN (NIGMS SCORE programmet, indrømmer S06 GM008012-37), og muliggjort af Grant nummer 5G12RR008124 fra National center for Research Resources, en komponent af NIH. ZSN er modtageren af ​​János Bolyai Research Felowship fra det ungarske videnskabsakademi og er støttet af NKTH-OTKA-EU 7KP (Marie Curie aktioner) reintegrationsstipendium (OTKA MB08C 84.630). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

pattedyr Signal Transducer og aktivator af transkription (STAT) familien er sammensat af 7 medlemmer (1-4, 5a, 5b og 6). STAT molekyler udøver kritiske roller i celledeling, differentiering og overlevelse (revideret i [1]). Oprindeligt var STAT’er menes at være latente faktorer bosiddende i cytosolen og kun aktiveret, når cytokiner binder til deres beslægtede receptor efter aktivering af Janus tyrosinkinaser (JAK). Faktisk den centrale model antyder, at Jaks phosphorylerer tyrosinrester på receptoren tjener som docking sites for SH2 domæne-holdige signalmolekyler såsom STAT’er. Efter docking via phosphotyrosin-SH2 interaktioner, STAT’er selv bliver tyrosin phosphoryleret af Jaks, frigøre sig fra receptoren og danner dimerer via gensidige phosphotyrosin-SH2 domæne interaktioner. STAT dimer derefter translokeres til kernen for at initiere gentranskription [2] – [3]. Men vi ved nu, at STATISTIK kan dimerisere og danne tetramerer i fravær af tyrosin phosphorylering og være nukleare lokaliseret til at styre genregulering på mange unikke måder, der er mindre forstået [4] – [5].

Det er klart er, at STAT’er 1, 3, 5A og 5B er almindeligt anvendt af forskellige cytokiner og er vigtige for regulering af cellevækst, proliferation og død, mens STAT’er 2, 4 og 6 fremme viral forsvar og Th1 versus Th2 differentiering, hhv. Desuden STAT3 og STAT5 har vist sig at være nært beslægtede og relevante for tumorigenese (revideret i [1]). Faktisk er konstitutivt tyrosin phosphorylerede former af STAT5 let observeret i en række af cancerøse celler og væv af forskellige oprindelser som følge af kromosomal translokation, deregulerede tyrosinkinaser og viral transformation (gennemgået i [1]).

fysiologiske rolle STAT5A og B er i vid udstrækning stammer fra

in vivo

undersøgelser af STAT5A og B knockout dyr. Ud fra disse undersøgelser fremgår det, klart, at STAT5A er hovedsageligt involveret i mælkekirtlerne udvikling [6] og STAT5B er ansvarlig for at regulere vækst via væksthormon signalering [7]. I T-lymfocytter, men de har kompenserende funktioner: undersøgelser fra STAT5A /B dobbelt deficiente mus viste, at de har redundante roller i mediering cellecyklusprogression af aktiverede T-celler [8], [9]. Desuden undersøgelser under anvendelse STAT5A /B null mus viser, at disse molekyler er vigtige for lymfeorganudvikling som en mangel i disse proteiner kan resultere i svær kombineret immundefekt fænotype [10]. Desuden STAT5 synes at fungere som en kritisk overlevelsesfaktor for T-celler, eftersom konstitutivt aktiv (dvs. tyrosinphosphoryleret) STAT5 er ofte til stede i lymfoide og leukæmiske cancerceller blandt andre typer tumorer sammenlignet med normale, ikke-transformerede celler (revideret i [1]). Endvidere blokerer STAT5 ekspression i humane perifere mononukleære blodceller samt lymfoide og leukæmiske cancerceller alvorlige farer cellelevedygtighed og inducere apoptotisk celledød [11]. Evidens fra mange grupper viser, at STAT3 spiller en lignende onkogen rolle STAT5 og afhængig af den celletype, kan man være dominerede [12]. Nye resultater for denne familie af proteiner foreslår også, at deres celle overlevelsesfremmende karakteristika, når un-phosphoryleret kan spille et gen regulatorisk rolle og [4]. Disse data bidrage til at give spændende nye modeller, der tyder på, at farmakologisk afkobling af aktivt samt un-aktiverede STAT5 kan være nødvendigt at afbryde deres målgener at fremkalde kræft celledød. Således identificerer celle overlevelse og tumor relevant STAT5 målgener er et vigtigt mål for udviklingen af ​​nye anti-behandlinger mod kræft.

En metode, der har vist sig gode til at identificere nye målgener er chromatin immunoprecipitation som kan afsløre direkte transskription factor-DNA interaktioner [13] og muliggør identifikation af ukendt transkriptionsfaktor bindingssteder i hidtil ukendte målgener ved at generere et genom-dækkende bibliotek, som kan være (i) sekventeret og placeret i det humane genom, eller (ii) hybridiseret til microarrays repræsenterer ikke-kodende regioner af genomet. Genom-dækkende kortlægning af cytokin-induceret Stat5 target gener er blevet udført og offentliggjort i forskellige celletyper (T-, præ-B-, human NK-lignende tumor og brystkræftceller) ved hjælp af chip-klon eller chip-Seq teknologier [4] [14] – [18]. Især kortlægning IL-2 inducerbare STAT5 bindende begivenheder og transkriptionelle ændringer i primære T-celler ved hjælp af chip-Seq, genekspression microarrays eller RNA-Seq teknologi er udført og offentliggjort for både mus [5], [16], [19 ], [20] og menneskelige [16], [] 19 modeller. Disse vigtige undersøgelser primært fokuseret på den rolle, STAT5 i T-hjælper celle differentiering og fysiologiske immunreaktioner.

Den nuværende arbejde søgt at identificere centrale celle overlevelse og tumor relevante STAT5 målgener i IL-2-afhængige humane leukæmiceller hjælp genekspression og promotor microarray studier. De resultater blev justeret og en udvalgt pulje af kandidat mål blev derefter valideret i normale menneskelige aktiverede PBMC’er. Phosphodiesterase (PDE) 4B, en regulator af cyklisk AMP-signalering i T-celler blev vist at være IL-2 reguleres på primede humane PBMC’er og CD8 + oprensede T-celler. Interessant dette molekyle var stærkt over-udtrykt i lymfoide tumor, men ikke primet primære CD4 + T-celler.

Resultater og Diskussion

En genom-dækkende tilgang til at identificere Stat5 Specifikke IL-2-medierede gener

STAT5 er en potent regulator af T-celle overlevelse som dens udtynding resulterer i massiv celledød af aktiverede T og lymfoide tumorceller [11] – [12]. Til dato har genom-dækkende undersøgelser blevet anvendt til at identificere og lokalisere IL-2 regulerede STAT5 bindende begivenheder og målgener i normal mus [5], [16], [19], [20] og humane T-celler [16], [19] revideret i [21]. I den foreliggende undersøgelse har vi forsøgt at identificere genome-wide IL-2-medieret STAT5 genmål fra lymfoide tumorceller (fig S1). At systematisk kortlægge Stat5 bindingssteder på den genomiske skala, som vi definerer som STAT5 cistrome [22] og IL-2 medierede genekspression ændringer, vi beskæftigede microarrays. Til disse undersøgelser vi først bestemmes STAT5 cistrome hjælp chip-on-chip i IL-2-afhængig KIT225-celler, der enten var venstre un-stimuleret eller stimuleret med IL-2 i 30 minutter, efterfulgt af efterfølgende genekspression analyse til påvisning af IL-2 medieret mRNA ændrer på 3 timer. De fremkomne data pools blev derefter statistisk analyseret og justeret og en udvalgt sæt af gener, der nærede STAT5 bindingssteder inden for deres promotorregioner valideret ved anvendelse medium gennemløb QRT

2PCR arrays.

Generering et bibliotek af IL-2 regulerede Stat5 bindende steder i

​​først blev tre biologiske replikater af chIP udført under anvendelse af en blanding af antistoffer rettet mod den C-terminale ende af STAT5A og STAT5B i KIT225-celler stimuleret med IL-2 i 30 min. Assayet blev valideret ved måling af IL-2 induceret berigelse af IL2RA enhancer [23] element navngivet Positive regulatoriske region (PRR) III (figur 1A) via Stat5 antistoffer sammenlignet med kontrolserummet. Dernæst blev det indfangede DNA amplificeret som beskrevet i Materialer og metoder under anvendelse af en tilfældig amplifikationsprotokol. For at bekræfte, at bibliotekerne forblev beriget for den positive kontrol PRR III element post-amplifikation blev PRR III målt under anvendelse qPCR (figur 1B) fra alle de gentagne eksperimenter. Dernæst blev microarray analyse under anvendelse Affymetrix GeneChip Humant Promoter 1.0R arrays udført under anvendelse input genomisk DNA (som en kontrol) og IL-2 stimulerede prøver i tre replikater biologiske som beskrevet ovenfor. De resulterende “.cel filer” blev derefter analyseret ved hjælp af MAT (Modelbaseret analyse af Fliselægning array, [24]), der gav “.bed filer” med kromosomale koordinater på alle chip-regioner, herunder p-værdier, MAT scores (til tillade berigelse i forskellige regioner af forskellig længde, der skal sammenlignes direkte), FDR (falsk opdagelse sats) beregninger og gentagne flag. Gentagne og segmentale dobbeltarbejde elementer blev fjernet, og de resterende 1581 hits blev kortlagt med det fælles europæiske asylsystem (Cis-regulerende Element Annotation System) [25] inden for 300 kb kommenterede genomiske regioner. Som vist i figur 2A kun omkring 17% af kandidatgener ligge inden for nærliggende promotorer, mens omkring 25% og 42% er placeret i enhancere og introner, hhv. Disse resultater er i god overensstemmelse med andres data, der indikerer, at størstedelen af ​​den TF bindingssteder findes i intron og intergeniske regioner [26]. At sammenligne vores resultater med tidligere offentliggjorte chip-Seq datasæt, STAT5A og STAT5B bindingssteder afledt af primære humane CD4 + T-celler blev re-analyseret (GSE27158, [16] ved hjælp af en chip-Seq analyse pipeline af Barta et al, [27 ]) og de resulterende toppe udsat for det fælles europæiske asylsystem analyse. De resulterende resultater for STAT5A og STAT5B sites fordeling var som følger: promotor-bundet 21% og 19%, intron 34% og 35%, enhancer-bundet 38% og 39%, hvilket angiver, at det genomiske STAT5 bindende mønster fra den aktuelle chip-on-chip datasæt tæt op chippen-Seq resultater efter Liao og kolleger [16]. Interessant kun omkring 20% ​​af de Stat5 bindingssteder var begrænset til promotorer. Dernæst berigelsen af ​​TF bindende motiver blev også analyseret baseret på det fælles europæiske asylsystem tildelte fold ændring som repræsenterer væsentligt beriget motiver med 2 fold-ændring inden chippen regioner over hele genomet. Figur 2B øverste bord og panel viser, at TF motiver med de højeste fold ændringer omfatter de klassiske STAT bindende motiver TTCNNNGAA i forskellige former. Den Interferon Sensitive respons Element (RS) var også signifikant beriget som tyder på, at i visse celler kan STAT5 også muligvis binder til disse motiver: enten direkte eller ved hjælp af en anden TF, der binder ISRE. Figur 2B nedre bord og panelet repræsenterer den mest markant beriget TF binding sites. Interessant er disse TTC STAT halve sites. Måske i disse typer af celler STAT5 kan binde halve sites direkte eller indirekte, hvilket tyder på en unormal regulering som denne type DNA-binding er ikke blevet observeret

in vitro

[28].

(A ) KIT225 IL-2-afhængige humane leukæmiceller blev gjort hvilende og derefter stimuleret med medium (-) eller IL-2 (+) i 30 minutter ved 37 ° C, fikseret med 1% formaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur og derefter kromatin immunpræcipiteret med antistoffer mod C-terminal STAT5A /B mix eller kontrol IgG. Det eluerede DNA blev amplificeret med primere svarende til den humane IL2RA PRR III. Repræsentative data fra tre uafhængige eksperimenter er vist. Input materiale udgør 5% af immunpræcipiteret kromatin. Perler kontrol repræsenterer prøver, hvor immunfældning blev udført uden antistoffer, men ellers blev håndteret ens. (B) Celler blev behandlet som beskrevet ovenfor og derefter til microarray eksperimenter chippen-ed DNA blev tilfældigt amplificeret efter ligering af linkere som beskrevet i materialer og fremgangsmåder fra tre uafhængige forsøg. Det forstærkede DNA blev derefter anvendt som skabelon i qPCR reaktioner til at måle berigelse af IL2RA PRR III.

(A) Genom-bred fordeling af STAT5 bindingssteder (procent af samlet antal lokaliteter). Chippen-on-chip identificerede elementer, der faldt inden for 300 kb fra kodende områder blev analyseret på grundlag af deres afstand fra nærmeste gener ved hjælp af fælles europæiske asylsystem. Den lagkagediagram repræsenterer “%” distribution. (B) Beriget transskriptionsfaktorbindende motiver med højeste fold-ændring (øverste panel) og højest signifikans (nederste panel). Beriget TF bindingssteder og deres matricer i chip-on-chip identificeret, CEAS analyserede regulatoriske elementer er vist.

Identifikation IL-2 regulerede gener i KIT225 Celler Brug Gene Expression Analysis

for at identificere IL-2-medierede gener i KIT225-celler blev celler udtømt for IL-2 behandlet med IL-2 eller kontrol køretøj i 3 timer og underkastet genekspression microarray analyse i to biologiske replikater. Fra denne analyse, 469 gener ændret mere end 2-fold, med 129 down- og 340 opregulerede gener herunder flere IL-2-medierede mål som CISH, SOCS1, OSM, PIM-1, BCL6 og BCL2. Dette gen liste blev analyseret med opfindsomheden Pathway Analyse web-baseret software, som yderligere bekræftet STAT5A og STAT5B aktivering status efter IL-2 behandling (figur S2) og identificerede mobilnetværk relevante for immunsystemets funktion, herunder Cellular Development Cell Cycle, Hæmatologisk System Development Funktion, reproduktive system Development Funktion samt Cellular Movement, Vækst Proliferation markant overrepræsenterede (Figur S3).

Identifikation IL-2 regulerede gener i STAT5 Cistrome

Vores mål var at opdage en pulje af IL-2 responsive gener, der indeholder Stat5 regulatoriske sites. Derfor skabte vi skærer af STAT5 cistrome og IL-2 responsive gener ved hjælp af UCSC Tabel Browser. Først blev Affymetrix id’er af genekspression pool omdannet til genomiske placeringer (.bed filer), blev derefter justeret med resultaterne chip-on-chip. Disse puljer blev visualiseret på den genomiske skala ved anvendelse af “.bed filer” og den Integrative Genomics Viewer (IGV, figur 3). Fra Intersect pulje bestod af 106 gener, en liste over 57 gener, der indeholdt de regulatoriske sites Stat5 inden for deres proximale promotor (30 gener), direkte downstream segmenter af genet (7 gener), enhancer (14 gener) eller første exon (6 gener) blev valgt til validering i humane primede PBMC’er (figur 3 og tabel S1) på mRNA niveau ved hjælp af medium gennemløb QRT

2PCR genekspression arrays (beskrevet i Materialer og metoder og statistisk signifikante resultater (p-værdi 0,05) vist i tabel 1). De kendte IL-2 målgener (angivet med en asterisk i tabel 1) BCL2 blev BCL6, CDK6 og IL2RA identificeret som IL-2 inducerbare gener med Stat5 bindingssteder. Andre kendte IL-2 målgener såsom CISH, IFNg og foxp3 blev også identificeret ved GEA, og derfor blev medtaget som positive kontroller på arrays. Selv om disse gener er kendt for at være reguleret af STAT5, i KIT225 celler deres Stat5 bindingssteder ikke blev identificeret ved chip-on-chip-analyse, som vi ikke kan udelukke en celletype specifik effekt. For at tydeliggøre disse resultater, blev IGV brugt til at visualisere de genomiske placeringer af kendt (SOCS2, SOCS3, IL2RA, CISH, Bcl2, BCL6 og CDK6 (figur 4A) understreget er dem identificeret i vores skærm) og 18 ukendte IL-2 /STAT5 mål gener (figur 4B). Blandt disse for eksempel CD69 (op 2,3 gange) er blevet vist at påvirke Th17 differentiering, som er et kendt STAT5-afhængig proces [29]. CDKN2C, ellers kaldet som p18 (INK) 4c, er en kendt inhibitor af G1 cellecyklus indledning, som her er nedreguleret ca. 2 gange ved IL-2. Lymfocyt cytosolprotein (LCP) 2 (1,7-fold op) er et mål for Zap70 kinase i T-lymfocytter og dens mangel er kendt for at inducere et fravær af dobbelt-positive CD4 + CD8 + thymocyter og perifere T-celler [30]. RAFTLIN (raft-linking protein) blev også vist at påvirke T-celle-medierede immunreaktioner og Th17 differentiering [31]. STK17B er en serin-kinase også kendt som Drak (DAP kinase-relateret apoptoseinducerende kinase) 2, som er kendt for at mediere apoptose induceret af IL-2 og regulere T-celle-receptor følsomhed i udviklingslandene thymocytter [32] – [33]. Phosphodiesterase (PDE) 4 B er en type 4 PDE (op ca. 2 gange), der regulerer TCR signalering ved temperering den negative virkning af cAMP [34] og i CD4 + humane T-celler faldt PDE4B ekspression medfører reduceret IL-2-produktion ved anti -CD3 /CD28 co-stimulation [35]. Chippen-on-chip identificeret STAT5 bindingssted inden for PDE4B er vist i figur 4B, fremkaldes ved IGV. Interessant IL-2 forøgede niveauet af PDE4B, der indeholder flere intronisk Stat5 bindingssteder, baseret på murine T-celle-undersøgelser [5].

Visualisering af de opnåede resultater fra hele genomet identifikation af IL-2 inducerede gener og Stat5 bindingssteder (som beskrevet i fig. 1) ved hjælp af IGV.

(A) Vist er kendt Stat5 målgener herunder SOCS2, SOCS3, CISH og dem også identificeret ved chip-on -ChIP (IL2RA, BCL2, BCL6 og CDK6) og (B) 18 nyligt identificerede promoter placeret gener visualiseret ved IGV hjælp hg19.

STAT5 Fylder en formodet IL-2 Responsive GAS site inden for PDE4B Gene

in vivo

i human PBMC’er

for at bekræfte, at STAT5 er i stand til at binde et formodet GAS sted inden i PDE4B- genet (placeret på kromosom 1, hg18 positionerne 66.567.898-66.573.077) i en IL-2-inducerbar måde, udtrykker vi CHIP eksperimenter i hvilende humane PBMC’er ubehandlet (-) eller behandlet med IL-2 i 30 minutter (+) isoleret fra tre uafhængige donorer. Som følge heraf vi observeret, at STAT5 bundet PDE4B i en IL-2-afhængige og væsentligt (p 0,05) med en omtrent 1,7 gange forøgelse i sammenligning med de ubehandlede celler (figur 5A). Den IL2RA PRR III blev anvendt som en positiv kontrol (figur 5B). Interessant, PDE4B- genet indeholdt både STAT5A og STAT5B IL-2 responsive bindingssteder undersøges inden for den primære humane T-celler [16], der overlappede med vores chip-on-chip region. Desuden er den øgede STAT5 DNA-bindingsaktivitet efter IL-2 behandling korrelerede godt med den observerede 2-fold stigning i mRNA-niveauer (tabel 1).

chip assays udført med Stat5 antistoffer eller kontrolsera (IgG) blev udført i hvilende (-) eller IL-2 stimulerede (30 min, +) hPBMCs isoleret fra tre uafhængige donorer til at måle berigelse af PDE4B- formodede STAT5 reguleret region (A) eller IL2RA enhancer PRR III (B) identificeret ved spån- on-chip. Indgange repræsenterer 1% af kromatin anvendes i chip assays og fejlsøjler repræsenterer standardafvigelser. * Repræsenterer statistisk signifikante forskelle (p 0,05)

Short Term IL-2 behandling (3 h) Fremkalde PDE4B- Protein Expression i PHA-aktiverede Menneskelige PBMC’er og CD8 +, men ikke CD4 + celler

For yderligere at validere, at PDE4B reguleres af IL-2, vi også undersøgt protein niveauændringer i naive (N), PHA-aktiverede (A), hvilende (Q) og IL-2 stimulerede humane PBMC’er ved 3 timer (+) i to uafhængige donorer (figur 6A). Niveauet af PDE4B protein steg ca. 2 gange (figur S4, densitometrianalyse), som korrelerer med ~1.7-fold stigning i DNA-bindingsaktivitet af STAT5 og 2-fold stigning i mRNA-niveauer (figur 5A og tabel 1 hhv) . Primære humane CD4 + eller CD8 + -T-celler blev også testet (figur 6B). YT NK-lignende celler tjente som positiv kontrol og ß-actin som et loading kontrol. Både PHA-aktivering (72 h) og kort- IL-2-behandling inducerede PDE4B proteinekspression i PBMC’er og CD8 +, men ikke CD4 + -T-celler. Baseret på disse data er det interessant at spekulere, at PDE4B- kan være den første “forsvarslinje” i PBMC’er og CD8 + T-celler mod den forhøjede cAMP signalering, der opstår med T-celle stimulation [36]. Det er kendt, at en anden type 4 isoform, er PDE4D også udtrykkes i CD4 + T-celler [35], hvilket fører os til at spekulere en mulig model hvor der er konstant temperering af cAMP induceret veje i forhold til CD8 + -celler. En anden mulighed kunne være, at de forsinkede opregulering af PDE4B i CD4 + -celler er at nedregulere cAMP i disse celler ved en distal tidspunkt. Test af CD4 + vs CD8 + celler blev udført fra en enkelt donor, og vi tror giver nye muligheder for at undersøge den mulige rolle PDE4B i disse typer af T-celle delmængder.

Normale humane PBMC’er fra tre uafhængige donorer (vist er 2 repræsentative resultater) blev efterladt un-aktiveret (N, naive) eller blev aktiveret med PHA (A, Q, +) derefter gjort hvilende efter 72 timer PHA aktivering af CO

2 stripning som beskrevet i Materialer og fremgangsmåder sektion (Q ), derefter stimuleret med IL-2 i 3 timer (+). Celler blev høstet og derefter Western blottet med antistoffer mod PDE4B eller ß-actin som angivet til højre. Molekylvægtmarkører er vist til venstre. I det nedre panel umiddelbart efter PBMC isolering CD4 + (bane fi) eller CD8 + (bane være) celler blev negativt udvalgt som beskrevet i materialer og fremgangsmåder under anvendelse af magnetiske perler, og derefter aktiveret med PHA, gjort hvilende, stimuleret med IL-2 og Western blottet for PDE4B og ß-actin som beskrevet ovenfor. YT-celler tjente som positive kontroller for PDE4B udtryk. (C) PDE4B udtrykkes i CD4 + lymfoide tumorcellelinjer. KIT225, H9, Molt3, MT2, Hut102 CD4 + og YT NK-lignende lymfoide cellelinier blev lyseret og lige mængder protein vestlige blottes for PDE4B og ß-actin som beskrevet for figur 6A. Repræsentative data fra to uafhængige forsøg er præsenteret.

PDE4B- udtrykkes i CD4 + Lymfoide tumorcellelinier

Da PDE4B blev fundet unormalt udtrykt i diffuse store B-celle lymfom prøver [35] opstod spørgsmålet, hvad der kunne være status PDE4B udtryk i forskellige CD4 + og andre lymfoide cancer cellelinjer. Derfor blev et sæt humant CD4 + lymfoide tumorcellelinjer samt en NK-lignende cellelinie, YT, undersøgt ved Western blotting, der viste højt udtrykt PDE4B protein til stede i disse celler (figur 6C). STAT5 signalvej er relevant for flere af disse cellelinier: human MT2 og Hut102 og vise hyperaktive STAT5 pathway [37], mens YT og KIT225-celler undergår apoptose, når STAT5 er opbrugt [11], [38]. Interessant PDE4B blev fundet overudtrykt i den del af diffuse store B-celle lymfom prøver, der var refraktære over for kemoterapi [39]. Det ville derfor være interessant at undersøge celle skæbne, hvis PDE4B kunne effektivt fjerner og om døden kan resultere.

Samlet set er det plausibelt at postulere at overekspression af PDE4B kan være resultatet af unormal genomisk DNA binding af STAT5 som efterfølgende kan bidrage til tumorigen fænotype af disse cellelinier. Test af denne hypotese kræver yderligere undersøgelser.

Konklusioner

Det kan konkluderes, at udnytte en systematisk tilgang, der kombineres bestemmelsen af ​​IL-2-induceret STAT5 cistrome og genekspression analyse inden for en menneskelig leukæmi celle model ; og med opfølgende gen ontologi samt medium gennemløb udskrift udtryk validering i primære humane PBMC’er har vi identificeret 19 nye STAT5 målgener, nogle med funktioner endnu-til-skal bestemmes, og nogle med relevans for immunceller. Vi valideret også en hidtil ukendt kandidat målgen, PDE4B på proteinniveauet i PBMC’er og fundet det overudtrykkes i CD4 + lymfoide tumorlinjer. Disse data antyder også, at tumorceller af lymfoid oprindelse kan have skæve genomiske Stat5 bindingssteder og dermed målrette gener sammenlignet med normale lymfoide celler (som foreslået af sammenligningen af ​​vores data med allerede eksisterende data i litteraturen af ​​Liao og kolleger [16] ); derfor, finde specifikke mål at udrydde dem kan kræve genom-dækkende kortlægning af større sæt primære tumor prøver af samme oprindelse. Hvorvidt lymfoide celler med en overaktiv STAT5 vej kan være følsomme over for PDE4B inhibitorer og en mekanisme til at styre visse tumorer vil blive genstand for fremtidige undersøgelser.

Materialer og metoder

Cell Kultur og behandling

Den humane lymfom cellelinie YT [40], CD4 + humane T-cellelinier Hut-102 [41] og MT-2 [42], thymus-afledte CD4 + T-lymfocyt-cellelinie Molt-3 [43], CD4 + T-cellelinje H9 [44] og human CD4 + IL-2-afhængig leukæmicellelinje KIT225 [45] (venligst stillet til rådighed af Dr. J. Johnston, Queens University, UK) blev dyrket som beskrevet [4], [38]. IL-2 blev opnået fra NCI Prækliniske Repository. Humane mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) blev isoleret, aktiveret med PHA og opretholdt som beskrevet [46]. CD4 + eller CD8 + T-celler blev isoleret ved negativ selektion under anvendelse af Dynabeads® uberørt ™ humane CD4 T-celler (Kat. Nr. 113.46D) eller humant CD8 T-celler (Kat. Nr. 113.48D) kits, henholdsvis.

kromatin Immunpræcipitation

Chromatin immunpræcipiteringer blev udført fra ca. 5 × 10

7 KIT225 celler som beskrevet [4] med anti-STAT5A /B-antistoffer (blanding sc-1081 og sc-835 (C-terminal STAT5A og STAT5B antistoffer, henholdsvis)) eller normalt kaninserum (IgG kontrol) i 3 timer ved 4 ° C. For at bekræfte, at analyserne var vellykkede, PCR-amplifikation af de kendte STAT5 bindingssted placeret 5 ’til det humane IL2RA genet i den positive regulatoriske region III [23] (Forward: 5′-ACG TCT AGA AAG AAA GTG GTC-3′ Reverse : 5′- CTG TCC CTG GAT GAA CCT AGT-3 ‘) blev udført under anvendelse kvantitativ realtids-PCR. [4] Værdier for transkripter i ukendte prøver blev opnået ved at interpolere Ct (PCR-cykler til tærskel) værdier på en standardkurve. Standardkurver blev fremstillet ud fra kendte mængder af oprenset, PCR-amplificeret DNA. Chip qPCR primer assays til PDE4B chip validering blev bestilt fra SABiosciences, en Qiagen selskab (Cat # GPH900044 (-) 01A), ved at give kromosomale positioner for 250 bp omkring formodede GAS stedet (chr1:66569949-66570198, hg18). PCR reaktioner blev udført under anvendelse af 2 × SYBR Green Mastermix fra BioRad og en BioRad iQ5 thermocycler i triplikater. Arbitrære enheder, der er defineret som “DNA-binding, (Db)” blev opnået ved 2∧ (-averageCt) og standardafvigelse SD ≈ ln (2) * STDEV (averageCt) * Db.

Random Forstærkning af kromatin immunopræcipiteret DNA

for at generere biblioteker fra chip-ed-DNA, blev tilfældigt amplifikation udført som beskrevet på https://research.stowers-institute.org/gertonlab/protocols/RandomPCRamplification.pdf af DeRisi laboratoriet på UC San Francisco. Kort fortalt blev chip-ed DNA-prøver amplificeret med en modificeret version af en tilfældig PCR-protokol [47]. DNA blev annealet til primer A (5′-GTTTCCCAGTAGGTCTCNNNNNNNN), og anden-streng-DNA-syntese blev udført med Sequenase (US Biochemical). Dette materiale blev derefter anvendt som template for 35 cykler af PCR med primer B (5′-GTTTCCCAGTAGGTCTC) ved følgende profil: 30 s ved 94 ° C, 30 s ved 40 ° C, 30 sekunder ved 50 ° C, 60 s ved 72 ° C og en dNTP-blanding indeholdende dUTP. Produkterne blev renset med QIAGEN PCR rensning kit, kvantificeres og kørt på en 1% agarose gel for at kontrollere for fragment størrelse, derefter testet for berigelse af den positive regulering Region III, som beskrevet ovenfor.

I Silico

Analyse

Chip-on-chip resultater blev analyseret med MAT (Modelbaseret analyse af Fliselægning array, [24] https://liulab.dfci.harvard.edu/MAT/) af Liu Lab ved Institut for Biostatistik og Computational Biology på Dana-Farber Cancer Institute, Harvard School of Public Health. Proksimal gen kortlægning af de genomiske sekvenser op til 300 kb blev udført ved hjælp af Cis-Regulatory Element Annotation System (CEAS https://liulab.dfci.harvard.edu/CEAS/). Resultaterne blev visualiseret ved den IGV. Omdannelsen af ​​genom koordinater og genom annotation filer af forskellige versioner af det menneskelige genom forsamlinger blev udført ved hjælp af UCSC Genome Liftover værktøj på https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgLiftOver.

RNA Isolation og cDNA Synthesis

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse af RNeasy kittet (QIAGEN). cDNA blev syntetiseret med BioRad s iScript cDNA Synthesis Kit ifølge producentens anvisninger.

microarray analyse

Gene Expression Analysis hjælp Affymetrix Human Genome U133 Plus 2,0 mikroarrays blev udført på Microarray Core Facility, Baylor College of Medicine, Houston, TX. Statistisk analyse blev udført ved hjælp GeneSpring GX ved University of Debrecen. Affymetrix GeneChip Menneskelig Promoter 1.0R arrays afhøre regioner proksimale til transcription start sites og indeholder prober for cirka 59 procent af CpG øer. Disse arrays indeholder 4,6 millioner sonder flisebelagt gennem mere end 25.500 menneskelige promotorområder til en gennemsnitlig opløsning på 35 bp.