PLoS ONE: Lysstofrør-antistof Målretning af Insulin-lignende vækstfaktor-1 receptor visualiserer Metastatisk Menneskelig tyktarmskræft i ortotopisk musemodeller

Abstrakt

Fluorescerende-antistof målretning af metastatisk cancer er blevet påvist ved vores laboratorium for at aktivere tumor visualisering og effektiv fluorescens-vejledt kirurgi. Målet med den foreliggende undersøgelse var at bestemme, hvorvidt insulin-lignende vækstfaktor-1-receptor (IGF-1R) antistoffer, konjugeret med lyse fluoroforer, kunne muliggøre visualisering af metastatisk tyktarmskræft i ortotopisk nøgne musemodeller. IGF-1R antistof (klon 24-31) blev konjugeret med 550 nm, 650 nm eller PEGylerede 650 nm fluoroforer. Subkutane, ortotopisk, og levermetastaser coloncancer-modeller i nøgne mus blev målrettet med de fluorescerende IGF-1R-antistoffer. Western blotting bekræftede ekspressionen af ​​IGF-1R i HT-29 og HCT 116 humane coloncancer-cellelinjer, både udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP). Mærkning med fluorophor-konjugeret IGF-1R antistof demonstrerede fluorescerende foci på membranen af ​​tyktarmskræft celler. Subcutaneously- og orthotopisk-transplanterede HT-29-GFP og HCT 116-GFP tumorer lyst fluorescerede ved længere bølgelængder efter intravenøs indgift af fluorescerende IGF-1R-antistoffer. Orthotopisk-transplanterede HCT 116-GFP tumorer blev lyst mærket ved fluorescerende IGF-1R-antistoffer, således at de kunne afbildes ikke-invasivt ved længere bølgelængder. I en eksperimentel levermetastaser model, IGF-1R-antistoffer konjugeret med PEGylerede 650 nm fluorophorer selektivt fremhævet levermetastaser, som derefter kunne non-invasivt afbildet. IGF-1R fluorescerende-antistof mærket levermetastaser var meget lyse i forhold til den normale lever og det fluorescerende-antistof label placeres sammen med grønt fluorescerende protein (GFP) ekspression af colon cancerceller. Nærværende undersøgelse viser således, at fluoroforen-konjugerede IGF-1R-antistoffer selektivt visualisere metastatisk tyktarmskræft og har klinisk potentiale for forbedret diagnosticering og fluorescens-vejledt kirurgi

Henvisning:. Park JY, Murakami T, Lee JY, Zhang Y , Hoffman RM, Bouvet M (2016) Fluorescerende-Antibody Målretning af Insulin-lignende vækstfaktor-1 receptor visualiserer Metastatisk Menneskelig tyktarmskræft i ortotopisk musemodeller. PLoS ONE 11 (1): e0146504. doi: 10,1371 /journal.pone.0146504

Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: Maj 26, 2015; Accepteret: 17. december 2015; Udgivet: 5 jan 2016

Copyright: © 2016 Park et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Cancer Institute CA142669 og CA132971, til MB og AntiCancer, Inc., og en bevilling fra Korea Research Foundation under grundforskning fond til fremme af af Undervisningsministeriet og Health Resources Development Korea 2010-0022990 til JYP. The National Cancer Institute ydet støtte i form af løn til forfatteren MB, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse data, beslutning om at offentliggøre, eller udarbejdelse af manuskript. De specifikke roller denne forfatter artikuleres i »forfatter bidrag« sektion

Konkurrerende interesser:. JYP, TM, og RMH er nonsalaried datterselskaber af AntiCancer, Inc. YZ er ansat i AntiCancer, Inc. AntiCancer, Inc., markedsfører dyremodeller for kræft. Der er ikke andre konkurrerende interesser. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Tyktarmskræft er den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i de vestlige lande [1 ]. Udvikling af koloskopi muliggør tidlig påvisning og fjernelse af præcancerøse adenomatøs polypose [2,3]. Komplet kirurgisk resektion kan helbrede godt udvalgte patienter med levermetastaser [4,5]. Forbedret billeddannelse af metastatisk tyktarmskræft bør øge overlevelsen ved at gøre koloskopi og kirurgi mere effektiv. Vi har tidligere vist, at målrette ortotopisk metastatisk tyktarmskræft, herunder patient-afledte ortotopisk xenografter (PDOX) modeller, med fluorescerende anti-carcinoembyronic antigen (CEA) antistoffer aktiveret forbedret tumor visualisering og effektiv fluorescens-vejledt kirurgi (FGS) [6]. Målretning af den epidermale vækstfaktor receptor med fluorescerende antistoffer forbedrede koloskopi [7].

type I insulin-lignende vækstfaktor-receptor (IGF-1R) er en transmembran tyrosinkinasereceptor omfatter to α og to p-kæder og er den største receptor for IGF-i og IGF-II. IGF-1R udtrykkes i 51 ~ 100% af coloncancere afhængigt af undersøgelsen [8-10]. Den høje frekvens af ekspression i colon cancer og membran subcellulære lokalisering gør IGF-1R et potentielt mål for fluorescerende antistoffer for at muliggøre kræft visualisering, diagnose, og FGS [11]. Brug IGF-1R har også yderligere klinisk potentiale, da overekspression af IGF-1R korrelerer med kortere median overlevelse tyktarmskræft patienter, der gennemgår kirurgi og adjuverende kemoterapi [10].

Denne rapport viser gennemførligheden af ​​IGF 1R målrettet fluoroforen-konjugerede antistoffer til at visualisere metastatisk tyktarmskræft i passende musemodeller.

Materialer og metoder

tyktarmskræft cellelinjer

Den menneskelige tyktarmskræft cellelinjer HT-29 [12] og HCT 116 [13] blev opretholdt i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT), penicillin /streptomycin (Gibco-BRL, Carlsbad, CA), natriumpyruvat (Gibco-BRL) , natriumbicarbonat (Cellgro, Manassas, VA), L-glutamin (Gibco-BRL), og minimalt essentielt medium ikke-essentielle aminosyrer (Gibco-BRL). Alle celler blev dyrket ved 37 ° C i en CO 5%

2 incubator.

Konstruktion af GFP-udtrykkende coloncancercellelinie

Konstruktionen af ​​grønt fluorescerende protein (GFP), der udtrykker HCT 116 er tidligere beskrevet [14-16]. For GFP-genet transduktion, 20% konfluente HCT 116 celler [17] blev inkuberet med en 1: 1 blanding af retrovirale supernatanter af de PT67 pakkeceller og RPMI 1640 (Gibco-BRL, Life Technologies, Inc.) i 72 timer. Cellerne blev høstet ved trypsin /EDTA 72 timer efter inkubation med GFP retrovirale supernatanter og subdyrket i et forhold på 1:15 i selektivt medium, der indeholdt 200 ug /ml G418. Niveauet af G418 blev forøget til 800 ug /ml trinvis. Kloner udtrykker GFP blev isoleret med kloning cylindre (Bel-Art Products, Pequannock, NJ) ved trypsin /EDTA og blev forstærket og overført ved konventionelle dyrkningsmetoder. Høj GFP udtryk kloner blev derefter isoleret i fravær af G418 for 10 passager for at vælge til stabil ekspression af GFP [14-16].

Mus

athymiske nu /nu nøgne mus (AntiCancer Inc., San Diego, CA), 4-6 uger gamle , blev anvendt i denne undersøgelse. Mus blev holdt i en barriere facilitet under HEPA filtrering. Mus blev fodret med en autoklaveret laboratorium gnaver kost. Alle mus kirurgiske procedurer og billeddannelse blev udført med dyrene bedøvet ved intramuskulær injektion af 50% ketamin, 38% xylazin, og 12% acepromazinmaleat (0,02 ml). Dyrene modtog buprenorphin (0,10 mg /kg ip) umiddelbart før kirurgi og en gang om dagen i løbet af de næste 3 dage til at lindre smerte. Betingelsen af ​​dyrene blev overvåget hver dag. Tumorer blev målt med passere hver anden dag. Når tumorer blev større end 2 cm eller en dyb sår blev dannet, blev eutanasi udført. Dyrene blev alle aflivet 2-3 uger efter operationen. CO

2 inhalation blev brugt til eutanasi. For at sikre død efter CO

2 kvælning, blev cervikal dislokation udført. Alle dyreforsøg blev godkendt af AntiCancer, Inc. Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) i overensstemmelse med de principper og procedurer, der er beskrevet i National Institute of Health Guide for pasning og anvendelse af dyr under Assurance Number A3873-1.

antistof-dye konjugation

mus monoklonale antistoffer mod IGF-1R (klon 24-31, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) blev konjugeret med DyLight 650, Dylight 550, eller PEGyleret Dylight 650 farvestoffer (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) ifølge producentens specifikationer, der sikrer et minimum af mindst 4: 1 farvestof: protein-forhold [18]. Protein: dye koncentrationer blev bekræftet ved hjælp af en NanoDrop spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts) [18]

Western blotting

Cellelysater blev udvundet i lysis buffer indeholdende 70 mM β-glycerophosphat. , 0,6 mM natriumorthovanadat, 2 mM MgC

2, 1 mM ethylenglycol-tetraeddikesyre, 1 mM DTT (Invitrogen, Grand Island, NY, USA), 0,5% Triton-X100, 0,2 mM phenylmethylsulfonylfluorid og 1% protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Lysater blev adskilt ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til polyvinylidenfluorid membraner (Millipore, Billerica, MA, USA). Membranerne blev blokeret i 5% (vægt /volumen) fedtfrit tørmælk og probet med anti-IGF-1Rα (SC-712, Santa Cruz, Dallas, TX, USA). De immunreaktive proteiner blev visualiseret under anvendelse af SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

Mærkning af levende celler in vitro under anvendelse af fluorescerende IGF-1R-antistoffer

HT-29 og HCT 116 celler (2 x 10

5) blev dyrket natten over. IGF-1R-antistof (klon 24-31) konjugeret med DyLight 550 farvestof blev fortyndet til 4 ug /ml i phosphatbufret saltvand (PBS, Corning Cellgro, Manassas, VA). Blev dyrkningsmediet aspireret fra cellerne og den fortyndede antistof blev sat til de levende celler. Celler blev inkuberet med antistof i 1 time ved stuetemperatur. Cellerne blev vasket forsigtigt 2 gange med PBS efter antistoffet blev aspireret. Cellerne blev observeret under en FV1000 konfokal mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) med hvidt lys og 559 nm laser [19].

Immunhistokemi

Anti-IGF-1R (klon 24-31 ) konjugeret med DyLight 650 blev brugt til farvning tumor afsnittene om dias. Objektglassene blev inkuberet med 10% normalt donkey serum i 1 time ved stuetemperatur og inkuberet med det konjugerede antistof ved stuetemperatur i 1 time ved en fortynding på 1: 100. Væv blev tørret og observeret med en IV-100 scanning laser mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) med en 633 nm laser [20]. Alternative dias fra den samme frosne tumorvæv blev farvet med hæmatoxylin og eosin og observeret under lysmikroskopi.

Subkutan og ortotopisk tumor musemodeller

HT-29-GFP og HCT 116-GFP menneskelige kolon cancerceller (2 × 10

6) injiceret subkutant i flankerne af nøgne mus. Når de subkutane tumorer voksede mellem 10 og 20 mm i diameter, blev de høstet og opsplittet i små fragmenter. De tumorfragmenter blev implanteret orthotopisk i colon hos nøgne mus, som beskrevet tidligere [6,21,22]. Kort fortalt blev en enkelt 3-mm

3 tumor fragment, der var egnet til suturering og også resulteret i reproducerbar tumorvækst, fastgjort til den mesenteriske grænse cecal væg med 8-0 nylon kirurgiske suturer (Ethilon ™; Ethicon Inc ., Somerville, NJ). Ved afslutningen blev coecum returneres til abdomen, og snittet blev lukket i et lag under anvendelse af 6-0 nylon kirurgiske suturer (Ethilon).

levermetastaser model

HCT116-GFP coloncancer celler (2 x 10

6), med matrigel, blev injiceret i milten af ​​nøgne mus som beskrevet tidligere [17]. Levermetastaser forekom over en periode på 2-3 uger.

Imaging

I begge subkutane og ortotopisk tumormodeller, blev musene injiceret med IGF-1R-antistof, konjugeret med fluorofor i halen vene, og derefter hele kroppen non-invasiv billeddannelse blev udført ved anvendelse af OV100 Small Animal Imaging System (Olympus, Tokyo, Japan) som beskrevet ovenfor [23]. Den optimale dosis af fluorofor-konjugeret IGF-1R-antistof blev bestemt ved dosis, der frembragte billeder med den bedste tumor-til-baggrund-forholdet i det subkutane tumor-modellen som visualiseres direkte med OV100. Efter hele kroppen non-invasiv billeddannelse i ortotopisk tumormodel, blev ex vivo-billeddannelse af tumoren med OV-100 udføres ved afslutningen af ​​forsøget. I leveren ortotopisk-transplantation model, efter sikring af tilstedeværelsen af ​​levermetastaser ved ikke-invasiv hele kroppen billeddannelse med OV100, blev musene injiceret med anti-IGF-1R (klon 24-31) konjugeret til PEGyleret DyLight 650. Musene blev aflivet 24 timer efter injektion og en ventral lodret snit fra brystbenet til underlivet blev foretaget og derefter leveren blev afbildet under anvendelse af OV-100. Hele lever med metastaser blev taget ud og ex vivo imaging med OV-100 blev gentaget. Baggrundssignalet i nativ leveren blev reduceret med valget af excitationsfiltre. GFP blev ophidset af en 460-490 nm filter og det fluorescerende antistof var begejstret med en 595-635 nm filter.

Billedanalyse

Billedbehandling blev gjort med Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems Inc ., San Jose, Californien).

Resultater

Angivelse af IGF-1R i kolon kræftceller in vitro

Både HT-29-GFP og HCT 116-GFP kolon cancercellelinier udtrykte pro-IGF-1R og IGF-1R, som bestemt med Western blotting. HT-29-GFP udtrykt IGF-1R stærkere end HCT-116-GFP (Fig 1A). The Western blotting blev gentaget tre gange, og vi observeret de samme resultater hver gang. Efter inkubation med fluorescerende konjugeret IGF-1R-antistof, uden gennemtrængning blev multiple fluorescerende foci visualiseres på HT-29 og HCT 116 celler i monolagskultur, som observeret under fluorescensmikroskopi (fig 1B). Differential interferens kontrast mikroskopi bekræftede, at det konjugerede antistof omsættes med IGF-1R på overfladen af ​​cancercellerne (Fig 1B).

(A) Western blot-analyse viser pro-IGF-1R og IGF-1Rα ekspression ved 200 og 130 kDa i tyktarmskræft cellelinjer, henholdsvis (HT-29 og HCT 116). (B) Mærkning af levende HCT 116 og HT-29-celler med 550 nm fluorofor-konjugerede antistoffer viser multiple fluorescerende foci på overfladen. Repræsentative fluorescens billeder fusioneret med tilsvarende DIC (differential interferens kontrast) billeder (x60 nedsænkning i vand mål med FV1000, ved hjælp af 559 nm laser).

Målretning subkutane colon tumorer i nøgne mus med fluorescerende IGF-1R antistoffer

Når HT-29-GFP eller HCT 116-GFP subkutane tumorer nået ca. 10 mm i diameter, dyrene fik hver en enkelt 10, 30 og 50 ug dosis DyLight 650-konjugeret anti-IGF -1R (klon 24-31) i 150 pi PBS via halevenen. Subkutan tumor-billeddannelse blev udført når tumoren diameter var ca. 10 mm. Musene blev afbildet af både lysfeltsbillede og fluorescensbelysning hjælp af OV100 efter 48 timer. Med 30 ug dosis af konjugeret anti-IGF-1R, der gav de bedste kontrast billeder begge til HT-29 og HCT 116 subkutane tumorer havde stærkere fluorescens sammenlignet med baggrunden (fig 2A). Fluorescens immunfarvning blev udført på frosne tumorprøver fra HCT 116-tumorer og bekræftede tilstedeværelsen af ​​IGF-1R på cancer cellemembraner (Fig 2B).

(A) Musen, der afbildes under både hvidt lys og fluorescens belysning. Intensiteten af ​​fluorescens fra HCT 116 og HT-29 subkutane tumorer er meget større end baggrunden. (B) Hematoxylin eosin-farvning (x200, venstre). Fluorescens immunfarvning for IGF-1R (x20 regelmæssig mål, IV-100 scanning laser mikroskop (Olympus) med en 633 nm laser, til højre) af frosne HCT 116 tumorprøver viser fluorescens på membranen af ​​kræftcellerne.

Målretning ortotopisk colontumorer i nøgne mus med fluorescerende IGF-1R-antistoffer

mus med tumorer orthotopisk-implanteret i musen coecum blev injiceret med DyLight 650-konjugeret anti-IGF-1R (klon 24-31) antistof med en enkelt dosis 30 ug via halevenen 14 dage efter tumorimplantation. Billeddannelse blev udført før og efter åbning af abdomen af ​​musene. Tumorstørrelse var ca. 10 mm. Den OV100 detekterede tumor fluorescens non-invasivt ved intravital åben billeddannelse samt ex-vivo (figur 3). Fluorescens blev observeret i huden, blæren, og tarmindholdet, men ved lav intensitet.

Fluorescens fra orthotopisk transplanterede colontumorer på coecum blev påvist før og efter abdominal laparotomi. Desuden blev detekteret fluorescens fra resekterede tumor. Svag fluorescens blev også påvist fra huden og, blære og tarmindholdet, men ved meget lavere intensitet end tumoren. Hvide pile angiver kolon tumor.

Målretning af colon-cancer levermetastaser i nøgne mus med fluorescerende IGF-1R antistof

Tre uger efter injektion HCT 116-GFP celler injiceret i mus milt, blev tilstedeværelsen af ​​levermetastaser observeret af ikke-invasiv hele kroppen billeddannelse. Musene blev derefter behandlet med pegyleret DyLight 650-konjugeret anti-IGF-1R (klon 24-31) med en enkelt 90 ug dosis via halevenen og aflivet 24 timer efter antistof injektionen. Vi gjorde billeddannelse inden for 24 timer i levermetastaser model, fordi vores tidligere erfaringer har vist, at konjugeret antistof løsrevet fra tumoren hurtigere i leveren metastase sammenlignet med de subkutane og ortotopisk tumormodeller [24]. Ventrale abdominale laparotomi af musene demonstrerede multiple metastatiske tumorer i leveren. GFP og 650 nm fluorescens stammer fra metastatiske tumorer, med normal lever kun viser et meget svagt signal (Fig 4A). Selvom det ikke var muligt at tælle alle de meget små tumorer, ex vivo-billeddannelse viste også, at 650 nm signal co-lokaliseret med GFP og afgrænses omfanget af tumoren mere nøjagtigt sammenlignet med skarpt lys billeddannelse. Hematoxylin eosin-farvning af vævsprøver udtrykker fluorescens bekræftede tilstedeværelsen af ​​metastatiske tumorer i museleveren (Fig 4B).

Anti-IGF-1R konjugeret til PEGylerede 650 nm farvestof selektivt mærket HCT 116-GFP metastatiske tumorer. Både in vivo (A) og ex vivo (B) afbildning viser, at 650 nm fluorofor-konjugeret IGF-1R-antistoffer co-lokaliseret med HCT 116-GFP-fluorescens og mere præcist demarkerede tumoren sammenlignet med skarpt lys billeddannelse (hvide pilespidser). H & E-farvning af vævsprøve (x200) ekspression fluorescens bekræfter tilstedeværelsen af ​​metastatisk tumor i mus leveren.

Discussion

Målretning IGF-1R i sarkom med radioaktivt mærket antistof og brystcancer med fluorofor-konjugeret antistof er blevet rapporteret [11,25]. I den foreliggende undersøgelse blev antistof rettet mod alfa-underenheden af ​​IGF-1R anvendes. In vitro bekræftede imaging at det konjugerede antistof bundet til IGF-1R på den ydre membran af colon cancerceller. Fluorescerende-konjugerede anti-IGF-1R-antistoffer fremstillet tumoren mere fluorescerende end baggrund, let at skelne tumor fra omgivende normale organer. Denne rapport viser, at fluorescens billeddannelse med fluorophor-konjugeret IGF-1R antistof kunne kombineres med endoskopi og FGS for bedre diagnosticering og behandling af tyktarmskræft.

IGF-1R målrettet billedbehandling kan være i stand til at opdage høj risiko polypper som foreslået af vores resultater og af tidligere rapporter om, at IGF-1R-ekspression blev påvist i kolon adenomer og blev stærkere som graden af ​​carcinogenese skred frem. Ikke-neoplastiske hyperplastiske polypper ikke udtrykke IGF-1R [26]. Forudsigelse den kræftfremkaldende risiko ved præmaligne polypper med fluorescerende IGF-1R-antistoffer kan aktivere individualiseret behandling for kolon polypper, selv uden væv prøvetagning og kan hjælpe med at undgå unødvendige invasive procedurer eller gentagen behandling.

IGF-1R målrettet terapi udvikles og afprøvet i kliniske forsøg [27]. Bestemmelse af ekspressionen af ​​IGF-1R i tumorer med fluorescens billeddannelse inden eller under behandlingen kan være i stand til at guide behandling eller forudsige behandlingsrespons. Fluorescens imaging har fordele, da det ikke kræver invasive tumor prøvetagning og kan gentages nemt [28].

Vi har tidligere demonstreret effektive FGS af tyktarmskræft i musemodeller bruger fluorescerende anti-CEA-antistoffer [6,29, 30]. Fluorescensimagografi har vist sig at detektere små levermetastaser og fjerne dem senere ved operation hos patienter [31]. Især med tyktarmskræft, afsløre levermetastaser med fluorescens billeddannelse er vigtigt, da det kan øge komplet resektion. Vores resultater viste, at med IGF-1R-antistof konjugeret med en PEGyleret fluorofor, metastaserne blev meget mere fluorescerende i forhold til normal lever baggrund, og blev mere præcist påvist [24]. Vi har tidligere vist, at PEGylerede farvestoffer konjugeret til tumorspecifikke antistoffer reducerede ikke-specifik optagelse af normalt lever [24]. Målet med den nuværende manuskriptet var at påvise, at en fluorescerende antistof til IGF-1R kunne identificere omfanget af levermetastaser i ortotopisk coloncancer-modeller bedre end standard lys visualisering, og vi nået dette mål. Fluorescensimagografi ved anvendelse fluorofor-konjugeret IGF-1R-antistof af levermetastaser bør være effektive til FGS.

Som konklusion har vi vist, at fluorofor-konjugeret IGF-1R-antistof er meget effektiv i mærkning coloncancer i musemodeller. Der er behov for formel biodistribution analyse og yderligere undersøgelser med tyktarmskræft PDOX modeller til at bekræfte, at IGF-1R målrettet billeddannelse kan anvendes i kliniske miljøer. Vores tidligere undersøgelser med anvendelse af fluorofor konjugeret antistoffer mod CEA, CA 19-9, Kit, og MUC-1 har vist deres evne til lyst mærkning gastrointestinale tumorer in vivo [6,24,30,32-40]. Billedområde biomarkører vil have vigtig klinisk potentiale for diagnose og behandlingsformer såsom FGS.