PLoS ONE: A Novel Funktionel TagSNP Rs7560488 i DNMT3A1 arrangøren er forbundet med modtagelighed for Gastric Cancer af Modulerende Promoter Activity

Abstrakt

DNA-methyltransferase (DNMT) -3a der indeholder

DNMT3A1

og

DNMT3A2

isoformer er blevet foreslået at spille en afgørende rolle i carcinogenese og viste afvigende ekspression i de fleste kræftformer. Akkumulerede beviser oplyste også, at enkelte nukleotid polymorfier (SNP) i DNMT gener var forbundet med følsomhed over for forskellige tumorer. Vi antager, at genetiske varianter i

DNMT3A1

promoter region er forbundet med gastrisk kræftrisiko. Vi valgte de tagSNPs fra databasen HapMap for kineserne og genotypebestemmes i en case-kontrol undersøgelse for at vurdere sammenhængen med mavekræft (GC) i et kinesiske befolkning. Vi identificerede, at de funktionelle tagSNP rs7560488 T C associeret med en signifikant øget risiko for GC.

In vitro

funktionel analyse af luciferase reporter assay og EMSA anførte, at tagSNP rs7560488 T C ændres væsentligt transkriptionel aktivitet af

DNMT3A1

gen via påvirke bindingen af ​​nogle transkriptionelle faktorer, selv om en konkret transkriptionel faktor mangler at blive etableret. Sammenlignet med TT homozygote, forsøgspersoner, som var TC heterozygoter og CC homozygote udstillet en reduceret ekspression af

DNMT3A1

. Desuden viste lagdelt analyse, at personer, der huser TC eller CC genotyper mindre end 60 år var mere modtagelige for GC. Vores resultater tyder på, at de genetiske variationer i

DNMT3A1

promotor bidrager til modtagelighed for GC og også give et indblik, at tagSNP rs7560488 T C kan være en lovende biomarkør til forudsigelse af GC genetisk modtagelighed og en værdifuld information i GC patogenese

Henvisning:. Wu H, Zhang K, Gong P, Qiao F, Wang L, Cui H, et al. (2014) A Novel Funktionel TagSNP Rs7560488 i DNMT3A1 arrangøren er forbundet med modtagelighed for Gastric Cancer af Modulerende Promotor Activity. PLoS ONE 9 (3): e92911. doi: 10,1371 /journal.pone.0092911

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: December 22, 2013; Accepteret: 27 februar 2014; Udgivet: 25 Mar 2014

Copyright: © 2014 Wu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant nr 81.171.915 og nr 91.229.107) og videnskabelig forskning og innovation Plan for College Kandidater fra Jiangsu-provinsen, Kina (Grant nr CXZZ13_0082). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er en af ​​de mest almindelige ondartede tumorer i Kina, især i Jiangsu-provinsen med en høj forekomst og dødelighed [1], [2]. Det kan spredes i hele maven og til andre organer, herunder spiserøret, lunger, lymfeknuder eller leveren. Derfor mavekræft er den næststørste årsag til kræft dødsfald i verden [3]. I betragtning af den terapeutiske effektivitet, kan kirurgisk resektion være en primær kurativ behandling for tidligere fase af GC patienter [4]. Desværre er de fleste gastriske kræftpatienter påvist i fremskredent stadium, i hvilket tidsrum tumoren er inoperabel længere. Desuden tilbagefald efter operation er en anden frygtelig begivenhed for en fattig 5-årige overlevelsesrate. I betragtning af de patienter med fremskreden eller recidiverende mavekræft, er det ingen tvivl om, at opdagelsen af ​​biomarkører og deres anvendelse ledsaget med traditionel diagnose kan være en værdifuld indikation og en omfattende hjælp til at formulere strategi for forebyggelse og behandling. Men hidtil, er blevet identificeret få målelige biomarkører til forudsigelse GC gentagelse.

tumorigenese er kendt for at være en flertrinsproces, som er resultatet af ikke blot genetiske ændringer, men også epigenetiske ændringer [5]. DNA-methylering er en vigtig indgang til epigenetisk modifikation og spiller en afgørende rolle i udvikling, differentiering, genomisk stabilitet, X-inaktivering, og prægning ved specifik regulering af genekspression. Den mest almindeligt studerede epigenetisk fænomen er DNA-methylering, en væsentlig regulator af transkription og chromatin struktur. Afvigende methylering af DNA mønstre i en genetisk modtagelige baggrund kan være forbundet med øget risiko for en række humane lidelser [6], [7], herunder GC [8].

DNMT3A

som indeholder

DNMT3A1

og

DNMT3A2

er to

de novo

DNA methyltransferaser spiller en afgørende rolle i fosterudviklingen og afvigende DNA methylering i carcinogenese. Nogle polymorfier af

DNMT3A

gen kan regulere genekspression, påvirke dens enzymatiske aktivitet og kan bidrage til modtagelighed for kræft. Akkumulerede beviser i molekylær genetik indikerer, at SNP i

DNMT

gener er forbundet med modtagelighed for cancer [9], [10]. Nylige fremskridt inden for genom-dækkende sammenslutning undersøgelse (GWAS) også er blevet identificeret nye modtagelighed SNPs for GC, som er nyttigt at forstå den underliggende mekanisme af genetiske variationer i udviklingen af ​​GC [11] – [14]. Vores tidligere undersøgelse viste en funktionel SNP rs1550117 i

DNMT3A

promotor, der kan øge sin transkriptionsaktivitet og bidrage til den genetiske modtagelighed for mavekræft i en kinesisk befolkning [15], [16].

GWAS har givet talrige SNPs forbundet med mange kræftformer. I nogle tilfælde, snesevis af SNP’er, kan kaldes tagSNPs som repræsenterer SNP’er i et område af genomet med høj koblingsuligevægt identificere genetisk variation uden genotype hvert SNP’er i en kromosomal region, så tagSNPs er nyttige i hel-genom SNP associationsstudier, såsom prostata-, bryst-, ovarie-, colorektale og hjerne cancere [17] – [19]. I den foreliggende undersøgelse, valgte vi en tagSNP rs7560488 fra HapMap database for kinesiske patienter for at vurdere sammenhængen mellem de genetiske varianter i

DNMT3A1

promotor og gastrisk kræftrisiko i en kinesisk befolkning. Vi identificerede en risiko-associeret rs7560488 T . C polymorfi i

DNMT3A1

promotor, og vores videre arbejde foreslået, at denne variant kunne ændre promotoraktiviteten og ødelægge bindende evne transkriptionelle faktorer

Materialer og metoder

undersøgelse emner

i alt 405 patienter med histologisk bekræftet mavekræft og 408 kræft-fri kontroller blev rekrutteret i denne case-kontrol undersøgelse, og de særlige kendetegn ved de sager og kontroller er beskrevet i Tabel 1. sager og kontroller blev modsvaret af alder, køn og blev udvalgt fra First Affiliated Hospital i Nanjing Medical University. Alle prøverne blev opnået med skriftlig tilladelse og analyseret anonymt. Denne undersøgelse blev udført med godkendelse af medicinsk Etisk Komité Medical School of Southeast University.

TagSNP Valg og TF bindingssted Prediction

Den vigtigste hypotese bag dette eksperiment var, at der er en eller flere SNP’er i

DNMT3A1

promotorregioner der er forbundet med risikoen for mavekræft. Afhængig af bindingsuligevægt (LD) struktur ved en bestemt locus, kan tagSNPs være surrogater for mange tusinde andre SNP’er. Vi postulerer, at sådanne tagSNPs sandsynligvis også mærke nogen hidtil identificerede SNPs i

DNMT3A1

promotor. Således valgte vi de SNPs i

DNMT3A1

promotor-regionen med en mindre allel frekvens (MAF) af 5% fra både HapMap og dbSNPs databaser. At gennemføre potentielt funktionel tagSNP udvælgelse, bruger vi data fra den internationale HapMap og frit webbaserede tagSNP udvælgelse værktøjer til at vælge tagSNPs, og bruge TF-søgealgoritme (https://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH .html) til at forudsige rs7560488 transskription faktor (TF) bindingssted.

DNA Udvinding og HRM Genotypning

for at undersøge

DNMT3A1

promoter tagSNP rs7560488, genomisk DNA blev isoleret fra 1 ml perifert blod fra patienter og raske individer og blev ekstraheret fra hvide blodceller inden for en uge efter prøvetagning ved proteinase K-fordøjelse som beskrevet tidligere [20]. TagSNP rs7560488 blev genotypebestemmes bruge dsDNA farvestof LC Green i kombination med High Resolution Melting (HRM) analyse. I detaljer blev PCR-primere udformet af LightScanner primer design software (Idaho Technology) (fremadrettet primer: 5′-AGGCAGACACAAATGCATAAAT-3 ‘; revers primer: 5′-GTCATAAGTACAACCACCACCG-3’), hvilket produkt en enkelt 208 bp fragment. Hver PCR-reaktion blev indledningsvis udføres i et endeligt reaktionsvolumen på 10 pi, anvendelse af 25 ng af genomisk DNA, 0,2 pmol af hver primer, 0,8 pi 2,5 mM dNTP’er, 1 pi 25 mM MgCl

2, 1 pi 10 x Taq buffer med (NH4)

2SO

4, 0,4 U Taq DNA Polymerase (Fermentas), 1 pi 1X LC Green PLUS (Idaho Technology) og 0,4 pi dimethylsulfoxid (DMSO). Reaktionsblandingen blev inkuberet ved 95 ° C i 5 min og derefter udsat for 40 cykler af 95 ° C i 30 sek, 57 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sek, efterfulgt af 72 ° C i 7 min ved anvendelse en PTC-200 thermal cycler (Bio-Rad). PCR reaktioner blev overført til 96-brønds plader (Bio-Rad) og analyseret på Light Scanner (Idaho Technology). Fluorescensdata blev opsamlet over et temperaturområde på 70-97 ° C, og smeltekurveanalyse blev udført ifølge producentens software. HRM kunne direkte diskriminere den heterozygote (TC) og homozygot (CC eller TT) genotyper tagSNP rs7560488 T C gennem smelte scanning. Efter blanding homozygot DNA med et tilsvarende beløb af kendte PCR-produkter (fx, CC), det yderligere skelnes mellem CC og TT genotyper. For yderligere bekræftelse, blev 5% af prøver fra hver gruppe opdaget af HRM tilfældigt udvalgt og udsat for DNA-sekventering for at sikre pålidelighed og reproducerbarhed.

Konstruktion af luciferasereporterplasmid

For at konstruere DNMT3A1 tagSNP rs7560488 reporterplasmid, vi amplificerede det 948 bp fragment fra 25422345 til 25422345 af

DNMT3A1

promotorregion, som indeholder T og C allel af SNP ved PCR fra genomisk DNA. De anvendte primere til PCR-amplifikationer var: (Fremad: 5′-TACGCTAGCATACCAAGTCCCCATTCCCC-3 ‘, omvendt: 5′-GTATAAGCTTTCGGCTTCTACACCCCTCAC-3’). PCR-produkterne blev subklonet ind Nhel- og Hindlll-restriktionssteder i pGL3-Basic Vector (Promega, Madison, WI). Vi kontrollerede alle rekombinante kloner ved DNA-sekventering.

transient transfektion og Dual Luciferase Reporter Assay

Humant mavekræft AGS og BGC-823-celler (ATCC) blev dyrket i RPMI-1640 medium suppleret med 10 % kalvefosterserum (FBS) og 1% penicillin /streptomycin-opløsning (10 000 U /ml og 10 mg /mL). AGS og BGC-823-celler (1 x 10

5) blev podet i 24-brønds dyrkningsplader. Efter 24 timers dyrkning blev AGS, BGC-823-celler transficeret ved Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) med 0,8 mg af hvert konstrueret vektor, enten med T-allel eller C-allel. Samtidig blev 10 ng pRL-TK plasmider (Promega) per brønd også transficeret som en intern kontrol til at korrigere transfektion effektivitet. Før det blev celler podet på plader med 24 brønde natten over for at sikre 90% -95% konfluens på tidspunktet for transfektion. Fireogtyve timer efter transfektion blev luciferaseaktivitet målt ved Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA) og udtrykt som forholdet mellem Firefly luciferase til Renilla luciferaseaktiviteter. Alle celler blev udført tre gange med de samme betingelser. blev udført tre uafhængige transfektionsforsøg, og hver luciferase assay blev udført in triplo.

Shift elektroforetisk mobilitet assay (EMSA)

5′-biotinylerede oligoer 25 bp i længde blev indhentet fra Beijing Genomics Institute (BGI). Oligo-sekvenser var rs7560488 [T] Forward: 5′-TAGTCAGACTCATAGAGACAGAAG-3 ‘, rs7560488 [T] Reverse: 5′-CTTCTGTCTCTATGAGTCTGACTA-3’. rs7560488 [C] Fremad: 5′-TAGTCAGACTCACAGAGACAGAAG-3 ‘, rs7560488 [C] Reverse: 5′-CTTCTGTCTCTGTGAGTCTGACTA-3’. Til annealing, koncentreret komplementære oligonukleotider blev blandet i et 01:01 molforhold og inkuberet ved 95 ° C i 5 minutter og derefter gradvist reduceres over timer, indtil oligonucleotiderne nået stuetemperatur. Annealede oligoer blev fortyndet til en slutkoncentration på 10 fmol. Kerneproteiner blev ekstraheret fra BGC-823 celler under anvendelse af NE-PERTM nukleare og cytoplasmiske Ekstraktion Reagenser (Pierce, Rock-ford, IL, USA) ifølge producentens anvisninger. Den LightShift Chemiluminescent EMSA kit (Pierce /Thermo Fisher Scientific) blev anvendt ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev bindingsreaktioner udført som følger: kerneekstrakter (8 ug protein) og 1 × bindingsbuffer med 2,5% glycerol, 5 mM MgCI2, 50 ng /pl poly (dI-dC), 0,05% NP-40, og 60 fmol biotinmærkede rs7560488 T /rs7560488 C prober blev inkuberet på is i 30 minutter i et volumen på 20 pi. Af konkurrence- undersøgelser blev kerneekstrakter inkuberet med umærket oligonukleotid i 30 min før tilsætning af mærket oligonukleotid. For et supershift blev AP-1-antistof tilsat (BOSTER, Kina). Komplekser blev adskilt ved elektroforese på indfødte 6% PAGE i 0,5 × TBE buffer ved 110 V. Gels blev overført til Biodyne B forskårne modificerede nylon-membraner (Pierce /Thermo Fisher Scientific) ved hjælp af en Trans-Blot SD halvtørre transfer celle ( Bio-Rad Laboratories). Membraner blev tværbundne (UVC-508 UV krydsbinder, Ultra LUM) og signalet blev detekteret med et kemiluminescerende påvisningssystem (Pierce /Thermo Fisher Scientific) ifølge producentens instruktioner. Salg

PÅVISNING AF DNMT3A1 transskriptioner ved kvantitativ RT-PCR (Q-PCR)

for yderligere at påvise sammenhængen mellem DNMT3A1 mRNA niveauer og rs7560488 polymorfi blev de 44 mavekræft væv med forskellige genotyper underkastet ekstraktion af det totale RNA ved anvendelse af Trizol Reagent ( Invitrogen, Inc.). Den DNMT3A1 mRNA-niveau blev målt ved kvantitativ realtids-PCR efter revers transkription på en Prism 7900 Real-Time PCR maskine (Applied Biosystems, Foster City, CA). β-actin blev anvendt som en intern kvantitativ kontrol for hver prøve. Primerne anvendt til DNMT3A1 amplifikation var F: 5′-GAACAGAAGGAGACCAACATCGAA-3 ‘og R: 5′-GCGCTTGCTGATGTAGTAGGG-3′; primerne til β-actin var F: 5’-GACCTCTATGCCAACACAGT-3 ‘og R: 5′-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3’. Relativ kvantificering af DNMT3A1 mRNA blev beregnet ved hjælp af 2-ΔΔCT metode, og hver analyse blev udført tre gange.

Statistiske Analyser

Alle data blev analyseret med

SPSS

udgave 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Patienter og kontroller blev sammenlignet ved hjælp af Students

t

-test for kontinuerlige variable og chi-square (χ2) test for kategoriske variable. Allel og genotypefrekvenser mellem kontrol- og GC individer blev opnået under anvendelse af chi-square test, og standarden goodness-of-fit test blev anvendt til at teste Hardy-Weinberg ligevægt. En

P

værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Karakteristik af forsøgspersonerne

De hyppighedsfordeling af de tilfælde og kontroller er fremgår af tabel 1, var der ingen signifikant forskel i hyppigheden fordelinger mellem de tilfælde og kontroller (P = 0,243 for alder og P = 0,355 for sex). Gennemsnittet af patienter og kontrolpersoner var 59,8 år (spændvidde 20~93 år) og 60,6 år (spændvidde 25~90 år), hhv. Ingen signifikant forskel blev fundet i gennemsnit alder og køn, tyder på, at matching baseret på disse to variable var passende.

Kandidat tagSNP Valg og Genotypning

Blandt kandidatlandene SNPs i

DNMT3A1

har vi fokuseret på de tagSNPs i promotoren for

DNMT3A1

og forudsagde deres potentielle funktion på bindende transkriptionsfaktorer, som påvirker den kvalitative og kvantitative udtryk for

DNMT3A1

. Vi anvendte en LD-baserede tagSNP udvælgelse algoritme (r

2≥0.80, MAF≥5%), som identificerede to tagSNPs repræsenterer fælles genetisk variation i CHB befolkningen, herunder kandidaten tagSNPsrs7560488 og rs1550117 der er en funktionel polymorfi, der ændrer modtagelighed i mavekræft vi bekræftet før [15], [16]. TFSEARCH algoritme forudsagde, at rs7560488 T skaber et bindingssted for AP-1 (figur 1). Prøverne til genotypning ved HRM og sekventering af ABI 3730 automatiseret sequencer (figur 2).

(A) HRM direkte diskrimineret heterozygoter (TC) og homozygote (TT eller CC), homozygote PCR-produkter (TT eller CC) blev målt ved LightScanner efter at være blevet blandet med et tilsvarende beløb af en kendt produkt (TT), der adskiller de vilde homozygote prøver (TT) fra variant dem (CC), som de mutationsmønstre homozygoter (CC) blev konverteret i heterozygoter (TC). (B) Tilfældige prøver fra rs7560488 T C test blev sekventeret for at bekræfte, Den sorte pil angiver nukleotid polymorfi ved rs7560488 loci

TagSNP rs7560488 Variant T . C i DNMT3A1 Promotor Markant øger risikoen GC

de genotype fordelinger og allelfrekvenserne af rs7560488 er vist i tabel 2. genotypefrekvenser i kontrollerne var efter aftale med Hardy-Weinberg model (P = 0,274). Som vist i tabel 2, genotypefrekvenserne af rs7560488 var 68,9%, 27,4% og 3,7% for TT, TC, og CC genotyper blandt tilfældene og 79,9%, 18,4% og 1,7% blandt kontrollerne henholdsvis forskellen mellem de sager og kontroller var statistisk signifikant (P 0,05). Desuden er T allelen frekvens var signifikant lavere blandt tilfælde end kontroller (82,6% versus 89,2%, P = 0,000). Hertil kommer, at kombinerede TC /CC genotype frekvens var højere blandt tilfælde end kontroller (31,1% versus 20,1%, p = 0,002). Når du tager TT genotype og T-allel som reference, fandt vi, at de variante genotyper (TC og CC) blev forbundet med en øget risiko for GC (OR = 1.653, 95% CI = 1,194-2,287; P = 0,002). Ligeledes observerede vi også, at C allelfrekvenserne var statistisk signifikant højere end kontroller (OR = 1,744, 95% CI = 1.310-2.321; P = 0,000). Taget sammen foreslår disse data, at TC og CC genotyper blev associeret med den genetiske modtagelighed for GC;

DNMT3A

en rs7560488 T allel kan være en formodet beskyttende allel. Der var ingen signifikante forskellige frekvenser af rs7560488 i GC på aldersgruppe 60 år versus ≤60 år (P = 0,756) og mandlige versus kvindelige (P = 0,459) (tabel 3)

.

Personer Mindre end 60 år var mere modtagelige for mavekræft med tagSNP rs7560488 Variant T C

Alder og køn var vigtige faktorer i tumor carcinogenese herunder mavekræft. Når analyserne blev stratificeret efter alder og køn af patienterne, fandt vi, at signifikant sammenhæng blev observeret, individer bærer TC /CC genotyper var associeret med den genetiske modtagelighed for GC både mandlige og kvindelige gruppe. Derfor rs7560488 C allel var en signifikant forøget risikofaktor sammenlignet med T-allel (tabel 4). Yderligere lagdeling evaluerede sammenslutning af rs7560488 T C med mavekræft i forskellige aldre. TC /CC genotyper var associeret med den genetiske modtagelighed for GC på aldersgruppen ≤60 år (OR = 1,794, 95% CI = 1,118-2,877; P = 0,015) end ældre end 60, på samme måde, vi bemærkede også, at C allelfrekvenserne var statistisk signifikant højere end kontroller (OR = 1,720, 95% CI = 1.127-2.622; P = 0,011). Disse resultater foreslog, at TC og CC genotyper var forbundet med den genetiske modtagelighed for GC, især i individer ikke mere end 60 år (tabel 4)

Den rs7560488 T . C Variant Påvirker DNMT3A1 transkriptionsaktivitet

for at vurdere den biologiske funktionelle effekt af rs7560488 polymorfi på DNMT3A1 transskription, vi konstrueret luciferase reporter vektorer (pGL3), der spænder over 4.389.823 til 4.390.770 base

DNMT3A1

promotor, med enten vildtype (T allel) eller mutant type (C-allel) og transficeret dem i BGC-823, AGS celler (figur 3A). Som vist i fig. 3B, fandt vi, at transkriptionen aktivitet af T-allelen var højere end C-allel med en ca. 2 gange i over to cellelinier, hvilket antyder at rs7560488 T allel arbejdede som forsvarer for mavecancer ved at øge transkriptionen af ​​

DNMT3A1

.

(A) Skematisk repræsentation af reporter plasmider, der indeholder rs7560488 T eller rs7560488 C-allel, som blev indsat opstrøms for luciferasereportergenet i pGL3 basic plasmid. (B) De to konstruktioner blev forbigående transficeret ind i AGS og BGC-823 celler hhv. Luciferaseaktiviteten af ​​hver konstruktion blev normaliseret mod den interne kontrol af Renilla luciferase. Kolonner betyder fra tre uafhængige forsøg; barer, SD. *, P 0,01 sammenlignet med konstruktionen modstykke

Den rs7560488 T . C Variant Dæmper Transskription Factor Affinity

I betragtning af tagSNP rs7560488 er placeret i

DNMT3A1

promotorregion; vi antager, at det kan ændre binding af transkriptionsfaktor (TF). Faktisk, ved hjælp af TF-søgealgoritme (www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html), vi forudsagde, at rs7560488 T skaber en TF bindingssted for AP-1. For at bestemme om denne polymorfi har en effekt på bindingsevne af transkriptionsfaktoren, gennemførte vi den elektroforetiske mobilitet (EMSA) at analysere binding af oligo-prober indeholdende enten T eller C-allel til kerneproteiner ekstraheret fra AGS celle. Som vist i fig. 4A, en specifik forskudt DNA /kerneprotein komplekst bånd blev dannet ved både C og T allel prober (fig. 4 A bane 2, 5). Imidlertid T allelen stadig ikke fuldt ud blevet kompetitivt inhiberet (fig. 4A bane 4), selvom det forskudte bånd blev ophævet ved 50-fold umærkede C prober (fig. 4A bane 1), hvilket antyder, at bindingsaktiviteten af ​​sekvensen indeholdende rs7560488 T-allelen var stærkere sammenlignet med C-allel og transkriptionsfaktoren kan fortrinsvis at binde til T-allelen snarere end C-allel. Endvidere super EMSA hjælp AP-1-antistof ikke forårsagede en supershift af biotin-mærket probe /kerneprotein (fig. 4 B bane 2, 5) angiver, at AP-1, kan ikke transskriptionsfaktoren, der binder til promotorområdet indeholdende T eller C-allel. Disse resultater indikerede, at rs7560488 C allel kan mindske kerneprotein bindingsaktivitet selv om virkningen ikke påvirkes af transkriptionsfaktoren AP-1. Salg

(A) kerneproteiner bindende aktivitet af forskellige alleler af DNMT3A1 rs7560488 polymorfi. biotinylerede prober (60 fmol) blev inkuberet med kerneekstrakter fra BGC-823 celler. I konkurrenceforsøg, 50-fold molært overskud af umærket T eller C-prober blev anvendt til at påvise specificiteten af ​​hvert bindingsreaktion. (B) Den super-shift assay udført under anvendelse af 20 ng anti-AP-1-antistof (bane 2, 5).

associering mellem DNMT3A1rs7560488 Polymorfi og ekspressionsniveauerne af

DNMT3A1

mRNA

Fyrre-fire mavekræft væv med forskellige genotyper af DNMT3A1 rs7560488 var tilgængelige i vores nuværende undersøgelse. På grund af den lave frekvens af CC genotype, tilføjede vi det i prøverne med TC genotype til analyse. Som vist i fig. 5, ekspressionsniveauerne af DNMT3A1 mRNA var lavere i individer med TC eller CC genotype end hos dem med TT genotypen (P 0,05)..

TT versus TC /CC genotyper

Discussion

genom-dækkende hypometylering og promotor hypermethylering er kendetegnende for et stort udvalg af kræft, der bidrager til tumorigenese og DNA methylering spiller vigtige roller i reguleringen af ​​genekspression og opretholdelse af genomisk stabilitet [21], [22]. DNA methylering udføres af DNA methyltransferaser (DNMTs)

DNMT1

,

DNMT3B

og

DNMT3A

[23], [24].

de novo

methyltransferaser

DNMT3A

er stærkt udtrykt i den tidlige fosterudvikling og nedreguleret i de fleste differentierede somatiske celler [25]. Rolle

DNMT3A

i human cancer blev fremhævet af rapporter om

DNMT3A

mutationer i ca. 20% af patienter med akut myeloid leukæmi [26], [27]. Forekomsten af ​​disse mutationer korrelerede med reduceret enzymatisk aktivitet og genomiske regioner med nedsat methylering.

DNMT3A

mutationer blev også identificeret i 8% af patienter med myelodysplastisk syndrom [28].

DNMT3A

også spiller en afgørende rolle i den epigenetisk inaktivering af hæmatopoietisk stamcelle (HSC) regulatoriske gener og muliggøre effektiv differentiering [29].

DNMT3A

genomisk locus producerer to udskrifter giver anledning til to proteiner, jo længere

DNMT3A1

og kortere

DNMT3A2

, der adskiller sig i, at en 219-amino-syre-amino (N) terminal hale er kun til stede i

DNMT3A1

[30], [31]. Den N-terminale domæne af

DNMT3A1

kaldes en “regulerende” domæne, fordi det ikke har enzymatisk DNA methyltransferase aktivitet. Dette domæne deler ikke signifikant homologi med noget andet kendt protein.

DNMT3A1

koncentreres i heterochromatin, som anses for at være transkriptionelt tavs, og fungerer primært som en transkriptionel repression [30]. Men andre undersøgelser viste, at

DNMT3A1

blev effektivt rekrutteret til tavshed Oct3 /4 og aktiveret vitronectin (VTN) genpromotorer via sin unikke N-terminale domæne [32].

Det er blevet rapporteret at genetiske variationer i

DNMT3A

gen bidrager til carcinogenese især forbundet med GC [15], [33] – [36]. Derefter foreslås yderligere udforskning af forholdet mellem SNPs og translationel regulering til sit mål gener. Men, konstatere biologisk funktion for hver SNP kræver ofte tidskrævende, molekylærbiologiske eksperimenter. Således analysere det store antal SNPs knyttet til nogen bestemt locus i praksis kræver en systematisk bioinformatik evaluering og prioritering at indsnævre sæt sandsynlige funktionelle kandidat varianter. Fordi det meste af SNP’er er i LD, er haplotype-baserede associationsstudier betragtes mere kraftfuld end den indre SNP analyse for at identificere kausale genetiske varianter underliggende ætiologi komplekse sygdomme, såsom cancer [37], i øvrigt anvendelsen af ​​tagSNPs at fange de fleste af de haplotypisk mangfoldighed i forbindelsesundersøgelser er blevet foreslået [38]. Selvom GWAS har givet talrige SNPs eller tagSNPs signifikant forbundet med kræft, er de fleste af de tagSNPs fundet i ikke-protein kodende regioner (intergeniske og intronregionerne), identificere deres funktionelle og /eller kausale varianter har en vigtig begrænsning af GWAS datafortolkning trods af tildele formodet funktionalitet til mange andre GWAS tagSNPs har kun været en succes, når fine kortlægning omkring en kendt risiko region blev udført [39] – [41].

i den foreliggende undersøgelse, vi udvalgte en formodet funktionelle tagSNP rs7560488 som kan repræsentere SNP’er af

DNMT3A1

promotor med høj koblingsuligevægt, er det muligt at identificere genetisk variation uden genotype hver SNP i

DNMT3A1

promoter regionen og forbedre effektiviteten af ​​foreningen. Vi observerede, at emner, der bærer tagSNP rs7560488 TT genotyper udstillet væsentligt reduceret mavekræft risiko sammenlignet med personer med TC eller CC genotype, hvilket indikerer, at allel T er en beskyttende virkning potentielt udstillet af denne tagSNP. Desuden analyserne vi udførte fremlagt yderligere dokumentation for, at TC og CC genotype forbundet med nedsat ekspressionsniveauer af

DNMT3A1

mRNA i gastrisk kræft væv, resultaterne tyder på, at

DNMT3A1

tagSNP rs7560488 T C polymorfi kan regulere ekspressionen af ​​

DNMT3A1

og dermed bidrage til GC modtagelighed. Disse data viste også, at DNMT3A1 kan spille en rolle i progressionen af ​​gastrisk cancer, men dette fund skal bekræftes af en større population undersøgelse. Til vores viden, dette er den første rapport, og viser, at

DNMT3A1

transskription påvirkes direkte af funktionelle tagSNP rs7560488 af

DNMT3A1

promoter regionen og tagSNP rs7560488T C var forbundet med en signifikant øget risiko for GC. Dernæst udførte vi en EMSA eksperiment for at analysere de biologiske konsekvenser af tagSNP rs7560488 polymorfi i BGC-823 celler. Både T-allel og C-allel prober viste to gel-shift-bånd, men konkurrenceforsøg viste bindingsaffinitet til kerneproteinerne fra T-allelen probe variant var større end den, der ses med C allel probe modstykke. Så den forbedrede DNA-proteinbinding evne T-allelen kan være ansvarlig for den øgede

DNMT3A1

promoter aktivitet, som vi observerede i vores promoter analyser. Super-EMSA eksperiment brugte AP-1-antistoffer ikke fået en super-gel shift indikerede, at transkriptionsfaktorer AP-1, må ikke i dannelsen af ​​transskriptionelle komplekser på tagSNP rs7560488 site. En anden roman resultat kommer fra sammenhængen mellem alder og rs7560488 T C polymorfi i stratificeret analyse indebar, at mindre end 60 år var mere modtagelige for mavekræft med tagSNP rs7560488 T C. Det er sandsynligt, at

DNMT3A1

påvirker transkription af specifikke gener især og ændringer i visse gener øger risikoen for GC. Disse resultater viser også, at jo stærkere risikofaktor for GC er tagSNP rs7560488 T C, især i ung alder

Tilsammen denne undersøgelse giver den første mekanistisk indsigt i, hvordan denne nye funktionelle tagSNP rs7560488 T . C-varianten er signifikant associeret med risiko for gastrisk cancer hos en kinesisk population. Vi fandt, at T til C ændrer sig mærkbart ændret transkriptionel aktivitet af

DNMT3A1

gen via påvirke bindingen af ​​nogle transkriptionelle faktorer og så at ændre DNMT3A1 udtryk niveau, selv om en konkret transkriptionelle faktorer er endnu ikke fastslået. Vores resultater giver en indsigt,

DNMT3A1

promotor rs7560488 T . C variation er en lovende biomarkør for at evaluere befolkningen modtagelig for GC og give værdifulde oplysninger mod fremtidig forskning i gastrisk kræft patogenese

Tak

Vi takker professor Yaping Wang, Dr. Zhenming Cai, Lili Cao (Nanjing Universitet, Nanjing, Kina) og Zhenghao Zhang (Southeast University, Nanjing, Kina) for HRM genotypning.