PLoS ONE: Merkel Cell Polyomavirus Lille T Antigen inducerer Kræft og Embryonale Merkel Cell Proliferation i en transgen mus Model

Abstrakt

Merkel celle polyomavirus (MCV) forårsager størstedelen af humane Merkel celle carcinomer (MCC) og koder et lille T (ST) antigen, der forvandler udødeliggjort gnaverfibroblaster

in vitro

. At udvikle en musemodel for MCV sT-induceret carcinogenese, genereret vi transgene mus med en flox-stop-flox MCV sT sekvens homologt rekombineret på

ROSA

locus (

ROSA

), så Cre-medieret, betingede MCV sT udtryk. Standard tamoxifen (TMX) indgivelse til voksne

UBC

CreERT2

;

ROSA

mus, hvor

Cre

udtrykkes ubikvitært, resulterede i MCV sT udtryk i flere organer, der var ensartet dødelig inden for 5 dage. Omvendt er de fleste voksne

UBC

CreERT2

;

ROSA

mus overlevede lavdosis tamoxifen administration, men udviklet øreflippen dermal hyperkeratose og hypergranulosis. Samtidig MCV sT udtryk og betinget homozygot p53 sletning genereret multi-fokale, dårligt differentierede, meget anaplastisk tumorer i milt og lever fra mus efter 60 dage TMX behandling. Mouse embryonale fibroblaster fra disse mus induceret til at udtrykke MCV sT udstillet forankringsuafhængig cellevækst. For at undersøge Merkel celle patologi, blev MCV sT udtryk også induceret i midten af embryogenese i Merkel celler

Atoh1

CreERT2 /+

;

ROSA

mus, som fører til signifikant forøget Merkel celle numre i touch-domes på sene embryonale aldre, der normaliserede postnatalt. Tamoxifen administration til voksne

Atoh1

CreERT2 /+

;

ROSA

Atoh1

CreERT2 /+

;

ROSA

;

p53f

lox /flox

mus havde ingen effekt på Merkel celle tal og inducerede ikke tumordannelse. Tilsammen viser disse resultater, at MCV sT stimulerer stamfader Merkel celle proliferation i embryonale mus og er en bona fide viral oncoprotein der inducerer fuld kræftcelle transformation i

p53

-null indstilling.

Henvisning : Shuda M, Guastafierro A, Geng X, Shuda Y, Ostrowski SM, Lukianov S, et al. (2015) Merkel Cell Polyomavirus Lille T Antigen inducerer Kræft og Embryonale Merkel Cell Proliferation i en transgen musemodel. PLoS ONE 10 (11): e0142329. doi: 10,1371 /journal.pone.0142329

Redaktør: Suzie Chen, Rutgers University, UNITED STATES

Modtaget: Juni 24, 2015; Accepteret: 19 okt 2015; Udgivet: November 6, 2015

Copyright: © 2015 Shuda et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NIH NCI R01CA136806, CA136363, CA170354, og American Cancer Society Professorships til PSM og YC. MS blev delvist understøttet af University of Pittsburgh Hudkræft SPORE CA12197305. SMM blev støttet af NIH NIAMS R01AR05114, Richard Kong Mellon Institut for Pediatric Research. SMO blev støttet af Dermatology Foundation og NIH NIAMS T32-AR007569. Dette projekt brugte University of Pittsburgh Cancer Institute core faciliteter, der understøttes delvist af award P30CA047904

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Merkel celle polyomavirus (MCV) er klonalt integreret i ~ 80% af Merkel celle karcinomer (MCC) og er i øjeblikket den eneste menneskelige polyomavirus kendt for at være onkogene [1, 2]. Denne virus blev det første menneske patogen opdaget af en nondirected RNAseq metode kaldet digital transkriptom subtraktion [3], en tilgang, der er nu almindeligt anvendt til at opdage og karakterisere menneskelige virus [4]. MCV T-antigen-locus koder to store overlappende transkripter for store T (LT) og lille T (ST) antigen oncoproteiner [5, 6]. Alle MCV-MCC tumorer undersøgt til dato ikke kun bære klonalt integrerede virus, men også besidder klonale tumorspecifikke LT mutationer, trunkere C-terminalen og forstyrre helicase funktioner af LT-proteinet [5, 7, 8]. p53 målretning gennem et tosidede interaktion domæne af LT-antigenet af nært beslægtede Simian vakuolerende 40 (SV40) virus er afgørende for SV40 LT transformation aktivitet. Der er imidlertid ikke analog p53 målretningsdomæne blevet identificeret for enten MCV LT eller ST oncoproteiner [9-11].

MCV sT er en promiskuøs E3 ligase inhibitor [12, 13], og alene er tilstrækkeligt til at omdanne gnaver fibroblast cellelinier [14]. MCV sT transformation gnaver celle kræver ikke aktiv proteinphosphatase 2A (PP2A) -bindingssite aktivitet [14]. I stedet en region kaldet store T stabilisering domæne (LSD) binder og hæmmer forskellige E3 ligase anerkendelse proteiner, herunder Fbw7, CDC20 og CDH1 [12, 13]. De to sidstnævnte proteiner er anerkendelse underenheder til anafase-promoverende kompleks /cyclosom (APC /C) og ST-ekspression fremmer mitotisk prometafasen standsning [13]. Det forøger CDK1-rettet phosphorylering af 4E-BP1 og aktivering af mitose-associeret cap-afhængig translation (MACT) [14]. Mutationer til MCV sT LSD eliminere MCV sT-induceret transformation, og knockdown af enten LT eller sT initierer celledød eller cellecyklusstop af MCV-positive MCC celler [15, 16].

For nylig Spurgeon et al viste, at transgen, keratin 14 promoter-drevet MCC-afledte genomiske T-antigen ekspression i musehud inducerer papillomatose [17]. Tilsvarende Verhaegen et al viste, at transgen MCV sT ekspression i mus ved anvendelse af en keratin 5 (K5) promotor inducerer hyperproliferative læsioner, der efterligner human pladecellecarcinom

in situ

[18]. Denne hyperplasi er afhængig af et intakt MCV sT LSD region. Til dato har dog ingen musemodeller vist, at transgene MCV T-antigen udtryk inducerer fuld neoplasi.

Vi genereret transgene mus, der betinget udtrykke MCV sT fra

ROSA26

locus at måle onkogent potentiale af denne viralt protein. Vi bekræfter, at MCV sT ekspression inducerer en hyperplastisk respons i hudvæv som tidligere beskrevet. Vi demonstrerer endvidere, at kun forlænget MCV sT udtryk i en p53-nul-sammenhæng producerer meget anaplastisk, dårligt differentierede maligniteter i indre organer. Dette krav om flere onkogene bidrag for fuld transformation ligner den, der ses for c-Myc, Wnt-1 og SV40 LT [19-21]. Vi fandt også, at MCV sT induktion i Merkel celler embryonale mus medførte forbigående stigninger i Merkel celle tal, men var utilstrækkelig til at forårsage proliferation eller tumorigenese i voksne Merkel cellepopulationer uanset p53 status.

Resultater

Generering af MCV sT transgene mus

Et transgen musemodel med inducerbar MCV sT udtryk,

ROSA

, blev genereret i C57BL /6 genetiske baggrund. At betinget udtrykke MCV sT protein, codon-optimeret MCV sT (sTco) cDNA blev vektor klonet nedstrøms for en

loxP-

flankeret neomycinphosphotransferase cDNA-sekvens med en 5 ‘sekvens homolog med musen

ROSA26

locus for at generere

ROSA26-CAG-LNL-MCVsTco Hotel (fig 1A).

ROSA26-CAG-LNL-MCVsTco

blev leveret af homolog rekombination i ROSA26 locus af mus embryonale stamceller (ES) celler (se detaljer i materialer og metoder).

(A) Design af

ROSA26-CAG-LNL-MCVsTco

, en ROSA26 knock-i konstruktion kodning codon-optimeret MCV sT med flankerende loxP-STOP-Neo-loxP (LNL) sekvens, rekombineret med ROSA26 genomiske locus.

ROSA26-CAG-LNL-MCVsTco

krydset med

UBC

CreERT2

eller

Atoh1

CreERT2

mus muliggør TMX-induceret Cre-rekombinase udskæring af loxP-STOP-Neo-loxP sekvens, der resulterer i MCV sT ekspression under CAG-promotoren. (B) MCV sT udtryk er dødelig i

UBC

CreERT2

; ROSA

transgene mus. Kaplan-Meier-kurve af høj dosis (0,2 mg /g) og lav dosis (0,02 mg /g) TMX injicerede mus. Høj dosis TMX injektion forårsagede hurtigt vægttab og mus nåede eutanasi kriterium (20% tab af kropsvægt) inden for 5 dage efter injektion (n = 4, fast orange). Overlevelse af kontrollen

UBC

CreERT2

mus (n = 7, prikket orange) blev ikke påvirket af TMX injektion.

UBC

CreERT2

; ROSA

mus injiceret med lavere dosis TMX udviste signifikant forlænget overlevelse sammenlignet med høj dosis TMX (n = 18, solid rød) og kontrolmus var upåvirket (n = 10, punkteret rød) (C) Multi-væv MCV sT proteinekspression i

UBC

CreERT2

; ROSA

mus, der døde umiddelbart efter højdosis TMX injektion ( 5 dage). Lavere dosis TMX injektion inducerer mindre MCV sT proteinekspression i en mus, der døde på dag 7 efter injektionen som detekteret ved immunoblotting under anvendelse af et antistof dannet mod MCV sT, CM8E6 [22]. MCV sT vektor eller tom vektor transficerede HEK293-celler blev anvendt som en positiv og en negativ kontrol, hhv. Lige store mængder af sT-transficerede HEK293 cellelysater blev indlæst til normalisering på tværs af forskellige blots. Hsp70 /Hsc70 blev detekteret som et protein kvalitetskontrol. (D) MCV sT proteinekspression blev opretholdt i væv af

UBC

CreERT2

; ROSA

mus, der overlevede over 70 dage efter lav dosis TMX injektion. Immunoblots blev udført som i (C). Tissue lysater fra

ROSA

blev brugt som en negativ kontrol.

High Level Ekspression af MCV sT i væv er dødelig for mus

for at betinget fremkalde cre-loxP rekombination og sT udtryk i flere organer,

ROSA

mus blev parret med

UBC

CreERT2

mus koder for humant ubiquitin C-promotor-drevet Cre-rekombinase fusioneret til en tredobbelt mutant form af den humane østrogen-receptor aktiveres af tamoxifen (TMX). Vi undersøgte sT ekspression ved to forskellige TMX doseringsniveauer: højdosis TMX aktivering at fremme udbredt sT ekspression og lav dosis TMX aktivering, i hvilken en stokastisk brøkdel af celler i de fleste væv ville undergå rekombination og sT ekspression

høj-dosis CreERT2 aktivering af en enkelt intraperitoneal (ip) TMX injektion (0,2 mg per gram mus kropsvægt) til voksne

UBC

CreERT2

;

ROSA

mus inducerede hurtigt vægttab i alle testede mus (n = 4). Disse mus blev dehydreret, mindre aktive på dag 3 efter injektion og nåede 20% vægttab eutanasi endepunkt inden for 5 dage. Ingen af kontrolmusene negative for

UBC

CreERT2

transgen viste mærkbar vægttab efter TMX injektion (Fig 1B).

UBC

CreERT2

; ROSA

mus viste ikke vægttab i fravær af TMX injektion, og deres overlevelse var sammenlignelig med

UBC

CreERT2

ROSA

kontrol mus.

Low-dosis TMX, til 10% af den høje dosis (0,02 mg /g), markant reduceret dødelighed, med 72% (13/18) af mus overlevende 10 dage eller mere (n = 18) (fig 1B og 2B) på trods af en stabil vægttab i løbet af forsøget. En sådan mus overlevede 144 dage efter TMX injektion, før de når vægttab eutanasi kriteriet på 20%, og dette var da overvejet endepunktet for den undersøgte periode.

(A) hyperplastiske fænotype i øre hud fra

UBC

CreERT2

; ROSA

mus. Ear hud væv fra

UBC

CreERT2

; ROSA

mus blev udsat for H ROSA

mus. H E farvede øre hud sektioner fra lavdosis TMX injicerede

UBC

CreERT2

; ROSA

ROSA

mus blev randomiseret og evalueret i et blindet måde af to patologer for hyperkeratose /hypergranulosis i epidermis og øgede cellularitet /vedhæng abnormiteter. N /A: ikke tilgængelig siden øre væv var normal og ikke høstes. . NT: ikke testet

Uanset TMX dosis væv immunoblotting af

UBC

CreERT2

;

ROSA

mus afslørede udbredt MCV sT udtryk i muskel, milt, lunger, lever, nyre, tarm, hjerte og hjernevæv fra mus, der døde inden for 10 dage efter TMX injektion henviser lavdosis TMX inducerede mindre sT protein vævsekspression (fig 1C og S1A fig). Ingen sT ekspression blev påvist i

ROSA

kuldsøster kontrol mus. For mus injiceret med lavdosis TMX og overleve 10 dage, dog MCV sT proteinekspression i forskellige væv var reduceret sammenlignet med de, der overlever 10 dage, med sT protein påvist kun i øre, hud, muskler og hjernevæv ved immunoblotting (figur 1D). MCV sT udtryk var ikke påviselig undtagen i musklen for

UBC

CreERT2

;

ROSA

mus aflivet på dag 144 efter lavdosis TMX injektion. Øget antal af TUNEL-positive epitelceller blev påvist i tarmen fra

UBC

CreERT2

;

ROSA

mus modtager flere højdosis TMX (én gang dagligt i 3 dage), i forhold til

ROSA

sT Salg kontrolmus (S1 Fig). Andre organer, herunder milt, lunge og nyre viste lignende resultater (data ikke vist).

Low Dose MCV sT Expression Fremkalde Dermal og epidermal Hyperplasi i Øre Væv

Af de

UBC

CreERT2

;

ROSA

mus, der overlevede over 42 dage efter TMX injektion (n = 12), viste brutto ekstern prøve slående bilaterale og diffus fortykkelse af bladflige. MCV sT protein blev påvist ved immunoblotting af øres væv i 77,8% af mus (7/9 blev tre øres væv høstes ikke), og sT induktion var forbundet med hyperproliferation af dermis og epidermis ved mikroskopi i 61,1% (11/18) af

UBC

CreERT2

;

ROSA

mus (Fig 2A). MCV ST protein ekspressionsniveauer blev imidlertid ikke forbundet med denne fænotype. To mus overlevende i mere end 117 dage (9F og 9M) udviste en hyperplastisk øre fænotype trods mangel på detekterbar sT proteinekspression i ørerne. Hverken

ROSA

heller

UBC

CreERT2

kontrol mus demonstrerede dette øre fænotype. Hematoxylin eosin (H

ROSA

embryoner.

In vitro

behandling med 500 nM 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHTMX) inducerede MCV sT udtryk i

UBC

CreERT2

;

ROSA

MEF (n = 8 embryoner), men ikke

ROSA

MEF (n = 2 embryoner) (fig 3A). Nogle MEF’er viste utætte MCV sT udtryk selv i fravær af 4-OHTMX behandling (S2A Fig). c-myc-ekspression, som er blevet vist at stabiliseres ved MCV sT [12], blev også forøget med MCV sT ekspression (figur 3 og S2B Fig). WST-1 celleproliferationsassay viste, at accelereret vækst fandt sted i

UBC

CreERT2

;

ROSA

men ikke

ROSA

MEF (figur 3 og S2B Fig).

(A) Induktion af MCV sT i flere mus embryonale fibroblast (MEF) celler fra kuld med 4-OHTMX. MEF’er udvundet fra

UBC

CreERT2

; ROSA

ROSA

embryoner blev dyrket i nærvær eller fravær af 500 nM 4-OHTMX i 7 dage. MCV sT og c-myc-protein-ekspression blev detekteret ved immunoblot. Hsp /Hsc70 proteinekspression blev påvist som en loading kontrol. (B) MCV sT ekspression accelererer celleproliferation i MEF celler. Proliferation af MEF celler behandlet med eller uden 4-OHTMX blev evalueret ved Wst1 analyser.

MCV sT Expression i p53 Null Mus Producerer anaplastisk, dårligt-opdelte Neoplasi Udtrykker Blandet Lineage Markers i milt og lever

for at omgå dødelighed produceret af MCV sT udtryk, som afspejles af høje TUNEL indekser i væv og hurtig død fra vægttab af eksperimentelle mus, krydsede vi

UBC

CreERT2

;

ROSA

mus med

p53

flox /flox

mus til at generere

UBC

CreERT2

;

ROSA

;

p53

flox /flox

mus. I disse mus, TMX administration samtidigt induceret MCV sT udtryk og

p53

gen sletning. Men når høj dosis (0,2 mg /g) TMX blev leveret ip, blev MCV sT ekspression påvist i flere væv og alle mus døde inden for 5 dage (n = 9), hvilket antyder, at

p53

deletion ikke redde letalitet induceret af høje niveauer af sT udtryk (S3A fig). Som med p53 vildtype mus, kortsigtede overlevelsesrater for

UBC

CreERT2

;

ROSA

;

p53

flox /flox

mus var større for lav dosis sammenlignet med højdosis TMX behandlede mus (S3A Fig) og 42,3% (11/26) mus døde inden for 10 dage af lav dosis TMX injektion. Udbredt MCV sT proteinekspression blev også påvist i flere væv fra disse mus, der døde inden for 10 dage med lav dosis TMX injektion (S3B Fig).

UBC

CreERT2

;

ROSA

;

p53

flox /flox

mus også udstillet hyperkeratose /hypergranulosis øre hud fænotype set i p53 vildtype, sT-udtrykkende mus (S4 Fig).

Ca. 19% af

UBC

CreERT2

;

ROSA

;

p53

flox /flox

mus (5/26) overlevede 60 eller flere dage efter lavdosis TMX behandling (Fig 4A). Fire af disse fem (80%) mus udviklede high-grade tumorer i indre organer synlige ved obduktion; tre mus havde tumorer i både milt og lever, og en havde groft detekterbare tumorknuder alene i milten (Fig 4B). Ved lysmikroskopi, tumorcellerne havde meget pleomorfe kerner, der varierede dramatisk i størrelse og form med flere nucleoli og hyperchromatism. Mitose var talrige og cellerne havde utydelige cytoplasmatiske grænser. En immunoblotting undersøgelse af væv (Fig 4C og S5 Fig) viste, at sT var stærkt til udtryk i disse tumorer mens sT udtryk ikke var generelt påvises i milten og lever fra langlivet

UBC

CreERT2

;

ROSA

mus eller tumor-negative

UBC

CreERT2

;

ROSA

;

p53

flox /flox

mus (Fig 1D og S5 Fig). sT proteinekspression i milt-tumorer var påviselig i 75% (3/4) af tumorbærende mus (S5 Fig). sT ekspression blev også påvist ved immunoblotting af en repræsentativ liver knude taget fra en påvirket mus (p53.7F, fig 4C). For nogle af disse mus (2/5), blev MCV sT også til udtryk i nyre væv og histopatologisk undersøgelse viste markeret proliferative forandringer i rørformede epitel spænder fra

situ

læsioner i for fuldt maligne læsioner med invasion gennem basalmembraner. Trods mikroskopisk bevis for nedsat neoplasi, diskrete nyre tumorer var ikke påvises ved grov undersøgelse ved obduktion. Immunhistokemi viste kraftig ekspression af MCV sT lokalisering til de maligne læsioner fra leveren og milten, og hyperproliferative og maligne epitellæsioner i nyrerne (Fig 4D). Disse resultater blev reproduceret ved 1/2 lavdosis TMX (0,01 mg /g) injektion. Mus overlevelse blev omvendt relateret til TMX dosering ved 0,01, 0,02 og 0,2 mg /g (S3 Fig). 87,5% (7/8) af

UBC

CreERT2

; ROSA

; p53

flox /flox

mus, der overlevede i løbet af 60 dage med 0,01 mg /g TMX også udviklet høj kvalitet tumorer i milten og /eller lever væv (data ikke vist). Vi har ikke observere tumorigenese ved p53 gendeletion alene i

UBC

CreERT2

; p53

flox /flox

mus op til 140 dage efter 0,02 mg /g TMX behandling (Fig 4A). Mens kønsceller deletion af p53 i denne musemodel fremmer tumordannelse så tidligt som 50 dage, er det blevet vist, at postnatal p53 gendeletion fører til en tumor forekomst af kun 3% endda 600 dage efter Cre-rekombinase transduktion, hvilket indikerer, at timingen af p53 tab er en kritisk faktor for tumorincidensen [23, 24].

(a) p53 ablation ikke redde mus fra MCV sT-induceret dødelighed. Kaplan-Meier kurve af lav dosis (0,02 mg /g) TMX injiceret

UBC

CreERT2

; ROSA

; p53

flox /flox

mus (Solid blå linje, n = 26) og

UBC

CreERT2

; p53

flox /flox

mus (stiplede blå linje, n = 10). Pink linjer angiver overlevelse

UBC

CreERT2

; ROSA

(fuldt optrukket linie)

UBC

CreERT2

(stiplet linje) mus med vildtype p53 som vist i fig 1B til sammenligning med p53 knockout baggrund (blå linjer). (B) MCV sT udtryk producerer tumorer

in vivo

p53

null indstilling. 80% (4/5) af mus, der overlevede mere end 60 dage efter TMX injektion udvikle groft synlig tumor i milten og leveren. Repræsentative milt og lever væv med tumorknuder fra p53.7F er vist med tilsvarende normale væv fra en C57BL /6 kontrol mus. (C) Immunoblotting af MCV sT proteinekspression i lever og milt væv fra mus p53.7F) med makroskopiske tumorer. Milt, muskler og øres væv tiden fastholdt sT ekspression i løbet af 60 dage efter TMX injektion. sT udtryk var påviselig i levervæv ved kun at immunoblotting fra leveren med synlige knuder (mus p53.7F). MCV sT protein blev detekteret ved anvendelse CM8E6 antistof og Hsp /Hsc70 udtryk blev anvendt som en loading kontrol. (D) Det øverste panel viser anaplastisk neoplasi i milten og leveren. En række proliferative ændringer blev observeret i nyrerne, hvor distale rørformede epitel er hårdest ramt, men glomeruli (sort pilespids), proksimal tubulær epiteler (*), og interstitielle væv er relativt forskånet for proliferative forandringer. Det midterste panel viser et repræsentativt immunhistokemisk farvning af sT proteinekspression i lever tumor, milt tumor og nyrevæv fra

UBC

CreERT2

; ROSA

; p53

flox /flox

mus. Vævsprøver blev immunfarvet med MCV sT (CM5E1) antistof. (E) Det øverste panel viser en sT-induceret lever tumor med immunoreaktivitet til a-glatmuskelactin (ASMA) og nederste panel viser K14 positivitet i spredte tumorceller.

For at bestemme Histogenesen af sT -induceret neoplasi, tumorer fra

UBC

CreERT2

;

ROSA

;

p53

flox /flox

mus blev immunfarvet med markører for forskellige slægter: CD45 (pan-lymfocyt), CD68 (makrofag), α-glatmuskelactin (ASMA-glat muskulatur ), cytokeratin 14 (epithelial), cytokeratin 8 (epithelial), neural adhæsionsmolekyle (NCAM). Tumorceller var ensartet ASMA positive. Spredte tumorceller viste positivitet til CK14 og NCAM (Fig 4E). Vi så ingen farvning med de andre markører, herunder CD68 og CD45 (S6 Fig).

p53 ablation er nødvendig for fuld Transformation af MEF’er af MCV sT

Da MCV sT er en transformerende oncoproteinet i p53-null mus, vi udførte transformation analyser ved hjælp isolerede MEF’er fra

UBC

CreERT2

;

ROSA

UBC

CreERT2

;

ROSA

;

p53

flox /FLOX

UBC

CreERT2

;

p53

flox /flox

ROSA

mus. Ved 4-OHTMX behandling, kloner af MEF’er isoleret fra to uafhængige

UBC

CreERT2

;

ROSA

;

p53

flox /flox

mus dannede kolonier 4 uger efter enkelt celle såning i blød agar kultur (fig 5A-5C). Hverken MCV sT udtryk alene (

UBC

CreERT2

;

ROSA

) eller p53 knockout alene (

UBC

CreERT2

;

p53

flox /flox

) induceret kolonidannelse (fig 6B). Disse resultater er i overensstemmelse med vores

in vivo

tumorgenese resultater.

(A) MCV sT inducerer blød agar koloni dannelse i fraværet af p53 i MEF celler. MEF celler isoleret formular

UBC

CreERT2

; ROSA

ROSA

UBC

CreERT2

; p53

flox /flox

UBC

CreERT2

; ROSA

; p53

flox /flox

embryoner fra kuld blev behandlet med 500 nM 4OHTMX over 7 dage, og cellerne blev udsat for blød agar kolonidannelse assay. Stjerner (*) angiver statistisk signifikans

s. 0

. (B) blød agar kolonier induceret af p53 ablation. p53 ablation alene førte ikke til kolonidannelse. (C) Ekspression af MCV sT i MEF’er fra

UBC

CreERT2

; ROSA

; p53

flox /flox

wholemount, K8-immunfarvet hud viser touch-kupler fra kontrol kuld (A, C, F, H, K),

Atoh1

CreERT2 /+

;

ROSA

(B, D, G, I) og

Atoh1

CreERT2 /+

;

ROSA

;

p53

flox /flox Salg (L) mus, der fik TMX på P28 (A-D) eller E14.5 (F-I, K, L). Alder ved væv høst er vist for hvert par af paneler. (E, J, M) Grafer viser Merkel celletal pr touch-kuppel til medfølgende paneler. * P 0,05, *** p 0,001. Målestok:. 10 um

MCV sT Expression Øger Embryonale Merkel Cell Precursor Proliferation men påvirker ikke Voksen Merkel Cell Numbers eller Årsag tumorigenese

MCC udtrykker fænotypiske markører mest ligner dem udtrykt af normal, bosiddende hud Merkel celler. For at undersøge effekten af sT i dette specifikke celletype, vi målrettet ST til Merkel celler ved avl

ROSA

mus til

Atoh1

CreERT2 /+

mus [25]. Atoh1 er en atonal gruppe proneural basisk helix-loop-helix transcription faktor med anti-onkogen funktion [26], der spiller en kritisk rolle i Merkel celleudvikling [27].

Atoh1

CreERT2 /+

;

ROSA

mus og kontrol

ROSA

søskende fik en enkelt dosis af tamoxifen (0,25 mg /g ) via oral gavage i postnatal dag 28 (P28) for at aktivere sT ekspression specifikt i Merkel celler [28]. Tilbage hud blev høstet 7 dage eller 12 måneder senere og immunfarvet for Merkel celle markør keratin 8 (K8). På begge tidspunkter, antallet af Merkels celler pr touch-dome var lavere i

Atoh1

CreERT2 /+

;

ROSA

mus sammenlignet med

Atoh1

+ /+

;

ROSA

kontrol mus, i overensstemmelse med tidligere rapporterede effekter af heterozygositet på

Atoh1

locus [28] (Fig 6A-6E). På intet tidspunkt gjorde vi finde touch-kupler med usædvanligt høje Merkel celle numre, ektopiske Merkel celler eller tegn på tumordannelse. Disse data tyder på, at sT udtryk alene i voksne Merkel celler ikke inducerer celledeling eller carcinogenese.

Mitotisk

Atoh1

+ stamceller producere modne Merkel celler under sen embryogenese [28]. For at undersøge virkningerne af sT udtryk på denne population, vi administrerede tamoxifen til gravide dæmninger på E14.5 og høstet embryoner ved E18.5 eller 5 måneders alderen. Vi fandt, at E18.5

Atoh1

CreERT2 /+

;

ROSA

mus havde ~ 50% mere Merkel celler end kuld kontroller, mens fem måneder gammel

Atoh1

CreERT2 /+

;

ROSA

mus havde ~ 30% færre Merkel celler end deres kuld kontroller (Fig 6F-6J). Ingen tumorer blev fundet ved hver alder. Disse data er i overensstemmelse med sT udtryk fremme mitose i aktivt delende cellepopulationer, og vise, at touch-dome Merkel celle tal reguleres selv i lyset af denne øgede division. Som hos voksne dyr, betyder MCV sT udtryk ikke transformere disse celler.

For at bestemme, om kombineret sT udtryk og tab af p53 vil fremme Merkel celleproliferation, vi administreret TMX til E14.5

Atoh1

CreERT2 /+

;

ROSA

;

p53

flox /flox

mus og høstet huden på P28. Vi fandt ingen stigninger i Merkel celleantal og ingen tegn på tumorigenese (fig 6K-6M). I modsætning til i St-induceret lever og milt neoplasi, antyder disse data, at sT udtryk kombineret med

p53

sletning er utilstrækkelige til at fremme vedvarende Merkel celledeling eller tumorigenese.

Diskussion

MCV sT forvandler udødeliggjort gnaverfibroblaster såsom Rat1 og NIH3T3 [14] og viral sT ekspression er nødvendig for vækst af MCV-positive MCC cancercellelinier [15, 16]. Vores nuværende data antyder, at MCV ekspression i forbindelse med p53 tab fremmer fuldt neoplastiske læsioner hos mus. Vi finder, at MCV sT inducerer embryonale Merkel celledeling, men er utilstrækkelig til fuldt ud rekapitulere Merkel celle karcinom uanset p53 status.

For nylig Verhaegen et al viste, at epitel-specifikke sT udtryk ved hjælp af en K5 promotor i C57BL /6 mus induceret hyperplastiske læsioner ligner pladecellecarcinom

in situ

[18]. Denne proliferative virkning blev medieret gennem MCV sT LSD domæne, som har vist sig at målrette multiple E3 ligase tumor suppressor proteiner [12, 13]. I modsætning hertil fandt vi, at allestedsnærværende postnatal induktion af MCV sT ekspression var ensartet dødelig for mus efter højdosis TMX injektion. Vores transgen musemodel anvender en codon-optimeret MCV sT cDNA, hvilket resulterer i højere proteinekspression end den naturlige sT cDNA-sekvensen (data ikke vist), og cytotoksiske virkninger fra forøgede niveauer af MCV sT ekspression kan forklare denne forskel. Øre, hud, muskler og hjerne væv bevares sT udtryk længe efter lavdosis TMX injektion, hvilket tyder på, at mus kan tåle kimære udtryk for MCV sT.

Spurgeon et al. også rapporteret, at når tumor-afledte genomiske T-antigen (både sT og MCC-afledt trunkeret LT) udtrykkes under en konstitutiv K14 promotor i FVB /N baggrund mus (

K14-MCPyV168

), to tredjedele af mus er levedygtige, mens resten af musene døde eller blev aflivet ved tidlig alder på grund af fejlernæring [17].

Kronisk sygdom

PLoS ONE: Merkel Cell Polyomavirus Lille T Antigen inducerer Kræft og Embryonale Merkel Cell Proliferation i en transgen mus Model

Be the first to comment

Leave a Reply Annuller svar