PLoS ONE: Visualisering af Sialidase aktivitet i pattedyrvæv og Kræft Detection med en roman Fluorescent Sialidase Substrate

Abstrakte

Sialidase fjerner sialsyre fra sialoglycoconjugates og spiller afgørende roller i mange fysiologiske og patologiske processer. Forskellige menneskelige kræftformer udtrykker et unormalt højt niveau af plasmamembranen-associerede sialidase isoform.Visualization af sialidase aktivitet i levende pattedyr væv ville være nyttigt, ikke kun for at forstå sialidase funktioner, men også for kræft diagnose. Men da enzymaktivitet af pattedyr sialidase er bemærkelsesværdigt svag sammenlignet med den for bakterielle og virale sialidaser, har det været vanskeligt at påvise sialidase aktivitet i pattedyrvæv. Vi syntetiserede en hidtil ukendt benzothiazolylphenol-baserede sialinsyre derivat (BTP-Neu5Ac) som et fluorescerende sialidase substrat. BTP-Neu5Ac kan visualisere sialidase aktiviteter følsomt og selektivt i akutte rottehjerne skiver. Kræftceller implanteret orthotopisk i muse koloner og menneskelig tyktarmskræft (iscenesætter T3-T4) blev også tydeligt påvist med BTP-Neu5Ac. Resultaterne antyder, at BTP-Neu5Ac er nyttig til histokemisk billeddannelse af sialidase aktiviteter

Henvisning:. Minami A, Otsubo T, Ieno D, Ikeda K, Kanazawa H, Shimizu K, et al. (2014) Visualisering af Sialidase aktivitet i pattedyrvæv og Cancer Detection med en Novel Fluorescent Sialidase Substrat. PLoS ONE 9 (1): e81941. doi: 10,1371 /journal.pone.0081941

Redaktør: Alberto G. Passi, University of Insubria, Italien

Modtaget: Juli 25, 2013; Accepteret: 17 oktober 2013; Udgivet: 10. januar, 2014

Copyright: © 2014 Minami et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Grant-in-Aid for Unge Forskere (B) (KAKENHI;. nr 24.790.080), The Sasakawa Scientific Research Grant fra Japan Science Society og The Naito Foundation Tilskud til fremme af specifikke forskningsprojekter. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Sialidase (EF 3.2.1.18) fjerner sialinsyre fra sialoglycoconjugates, såsom glycoproteiner og glycolipider. Pattedyr sialidase er kendt for at have 4 isoformer (NEU1, NEU2, NEU3 og NEU4) og spiller mange roller i cellefunktioner herunder differentiering, vækst, apoptose og migration og i overlevelse og spredning af kræftceller [1], [2]. Visualisere den detaljerede fordeling af sialidase aktivitet i pattedyrvæv kan hjælpe os til at forstå de fysiologiske og patologiske roller sialidase. Derudover, da ekspressionsniveauet af NEU3, et plasmamembran-associeret sialidase, er bemærkelsesværdigt forøget i forskellige humane cancere, såsom colon-, nyre-, prostata- og ovariecancer [1], [2], [3], påvisning af membran sialidase aktiviteter i levedygtige væv kræft vil også være nyttige til cancerdiagnose og realtidsovervågning af cancer under en kirurgisk operation.

X-Neu5Ac (5-brom-4-chlorindol-3-yl-α-DN-acetylneuraminsyre syre) er en meget anvendt kunstig sialidase substrat for cytokemiske og histokemisk billeddannelse af sialidase aktivitet. Forbindelse X (5-brom-4-chlor-3-hydroxyindol) frigøres fra X-Neu5Ac med sialidase og oxideres til en vanduopløselig synlig indigo blå. For at øge specificiteten af ​​farvning, er indigogenic substrater anvendes ofte med en ækvimolær blanding af K

3 [Fe (CN)

6] og K

4 [Fe (CN)

6] som en oxidationskatalysator. Men følsomheden er ikke tilstrækkelig til at observere den detaljerede fordeling af sialidase aktivitet i pattedyrvæv [4]. Enzymaktivitet af pattedyr sialidase er bemærkelsesværdigt lavt sammenlignet med den for bakterier og virus [5], [6]. For at øge følsomheden af ​​X-Neu5Ac, sensibiliserende såsom Fast Red Violet LB (FRV LB) som en kobling til at danne et azofarvestof bruges med X-Neu5Ac [6], [7], [8]. Men da der er behov for en to-trins reaktion til farvning med FRV LB, uspecifik farvning forårsaget af sensibilisatoren er uundgåelig, og gør det vanskeligt at anvende, især i kliniske områder. I den foreliggende undersøgelse har vi udviklet hidtil ukendte fluorescerende sialidase substrater, benzothiazolylphenol-baserede sialinsyrederivater (BTP-Neu5Ac), for yderst følsom og specifik visualisering af sialidase aktivitet i levende pattedyrvæv ved et enkelt trin reaktion.

i den foreliggende undersøgelse fandt vi, at BTP-Neu5Ac kan visualisere sialidase aktiviteter følsomt og selektivt i akutte rottehjerne skiver. BTP-Neu5Ac kan også klart detektere cancerceller implanteret orthotopisk i muse koloner og humane coloncancerformer.

Materialer og metoder Salg

Syntetiske procedurer

syntese af forbindelser er beskrevet i detaljer i File S1

Materialer

følgende produkter blev købt fra kreditorer anført:.. sialidase fra

Arthrobacter bacter ureafaciens

(AUSA, rekombinant udtrykt i

Escherichia coli

, Calbiochem, San Diego, CA, USA), X-Neu5Ac (Peptide Institute, Osaka, Japan), halothan (Takeda Pharmaceutical Company, Osaka, Japan), Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan), penicillin og streptomycin (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA), føtalt bovint serum (FBS, AusGeneX, Molendinar, QLD, Australia), phycoerythrin (PE) -konjugeret gede-anti-kanin IgG (Santa Cruz Biotechnology, Dallas , TX, USA) og kanin-anti-CD71 (transferrin receptor) polyklonalt antistof (Assay Biotechnology, Sunnyvale, CA, USA). Reagenser, der anvendes til fremstilling af pufferopløsninger blev købt hos Wako Pure Chemical Industries.

Forsøgsdyr

Rotter og mus blev købt hos Japan SLC (Hamamatsu, Japan). De blev opstaldet under standard laboratorieforhold (23 ± 1 ° C, 55 ± 5% fugtighed) og havde adgang til postevand og kost

ad libitum

. Lysene blev automatisk tændt på 08:00 og slukket kl 20:00. Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med den japanske Farmakologisk Society guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr, og de protokoller blev forhåndsgodkendt af Animal Etisk Udvalg fra University of Shizuoka.

Spectrum analyse

Fluorescerende spektre af 5 mM BTP2, BTP3 og BTP4 i kunstig cerebrospinalvæske (ACSF, pH 7,3, 200 pi) indeholdende 119 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 2,5 mM CaCI

2, 1,3 mM MgCl

2 , 1,0 mM NaH

2PO

4, 26,2 mM NaHCO

3 og 11 mM D-glucose blev målt med en mikropladelæser, Infinite M200 (Tecan, Männedorf, Schweiz). Excitation spektre blev erhvervet med emissionsbølgelængder ved 518 nm for BTP2, 526 nm for BTP3 og 542 nm for BTP4. Emission spektre blev erhvervet med excitationsbølgelængder på 370 nm for BTP2, 372 nm for BTP3 og 374 nm for BTP4. Fluorescens synspunkter af 5 mM BTP2, BTP3 og BTP4 i ACSF og BTP2, BTP3 og BTP4 på et filterpapir blev afbildet under excitation UV-lys på 365 nm (Vilber Lourmat, Marne-la-Vallée, Frankrig) med et digitalt kamera, CX1 ( . Ricoh, Tokyo, Japan)

Kvantitativ analyse af sialidase aktivitet

AUSA (10

0-10

5.7 g enhed ml

-1: en enhed defineret som den mængde enzym, der katalyseret frigørelse af 1 pmol sialinsyre i 1 min.) inkuberet i 100 pi 100 mM natriumphosphatpuffer (pH 7,3) indeholdende 10 uM BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac, BTP4-Neu5Ac eller resorufin -Neu5Ac (Res-Neu5Ac) ved 37 ° C i 60 minutter i en 96-brønds sorte mikroplade (Corning, Corning, NY, USA). Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af 150 pi af natriumcarbonat (500 mM, pH 10,7) til hver brønd. Intensiteten af ​​fluorescens blev målt med en mikropladelæser (ex /em: 370 nm /518 nm for BTP2, 372 nm /526 nm for BTP3, 374 nm /542 nm for BTP4 og 570 nm /585 nm for resorufin).

Påvisning af sialidase aktivitet på en PVDF-membran

AUSA (10

-1-10

4 g enhed) blev blottet på en polyvinylidine (PVDF) membran ved anvendelse af en 96-brønds dotblotter (cirkel godt størrelse: 28,3 mm

2, Sanplatec, Osaka, Japan). Hver brønd blev vasket med 100 mM natriumphosphatpuffer (pH 7,3), og derefter 50 pi 10 pM BTP4-Neu5Ac eller X-Neu5Ac i natriumphosphatpuffer blev tilsat. Efter inkubation ved 37 ° C i 6 timer, blev reaktionsopløsninger fjernet, og derefter blev observeret de PVDF-membraner med et digitalkamera i UV-lys (365 nm) i BTP4-Neu5Ac eller med et stereomikroskop SZX7 (Olympus, Tokyo, Japan) under synligt lys for X-Neu5Ac.

Imaging af sialidase aktivitet i hjernen skiver

Wistar-rotter (hanner, 7-10 uger gamle, n = 3) blev bedøvet med halothan og halshugget. Hjernen på hver rotte blev hurtigt høstet og nedsænket i iskold ACSF at undertrykke overdreven neuronal excitation og beskadigelse. ACSF anvendt i dette eksperiment blev kontinuert gennemboblet med 95% O

2 og 5% CO

2. Koronale hjernen skiver (400 um i tykkelse) blev fremstillet ved anvendelse af en LinearSlicer PRO-7 (Dosaka EM, Kyoto, Japan) i iskold ACSF. Akutte hjernen skiver blev holdt i ACSF ved stuetemperatur i mindst 60 min og derefter inkuberet med 400 pi ACSF indeholdende 1 mM BTP2-Neu5Ac (n = 3), BTP3-Neu5Ac (n = 4) eller BTP4-Neu5Ac (n = 4 ) ved 27 ° C i 1 time. Inkubationsbetingelser kamre blev kontinuerligt boblede med 95% O

2 og 5% CO

2 under farvning. Skiver blev vasket tre gange med ACSF og overføres til IWAKI 3,5 mm glas-baseret retter (Asahi Glass, Tokyo, Japan) fyldt med ACSF. Fluorescens blev observeret ved hjælp af en IX71 fluorescens mikroskop (excitation filter /emission filter: BP330-385 /BA420 eller BP330-385 /BA510IF, Olympus). Baggrundsniveau af fluorescens for sialidase aktivitet billeddannelse blev bestemt ved at inkubere hjernen skiver i ACSF uden et substrat. I alle observationer med fluorescens mikroskop, blev gevinst på en DP70 Digital Microscope kamera (Olympus), der ikke til at registrere baggrundsfluorescens.

For hele området billeddannelse af hjernen skive, billeder blev taget i rækkefølge og hvert stykke blev flisebelagt ved hjælp af Photoshop CS4 (Adobe Systems, San Jose, CA, USA). Efter behov blev samme behandling udført på følgende eksperiment.

Cytotoksicitet

MDCK celler blev udsat for et serumfrit medium (SFM) indeholdende 10 eller 100 uM BTP-Neu5Ac eller BTP. Frigivet LDH blev målt under anvendelse af et koblet enzymatisk assay (CytoTox-OneTM, Promega, WI, USA).

Mus colontumormodel

Murin Colon 26 NL-17 carcinomaceller blev dyrket i DMEM suppleret med 10% FBS, 100 enheder ml

-1 penicillin og 100 ug ml

-1 streptomycin ved 37 ° C i nærvær af 5% CO

2 i en fugtig atmosfære. Colon kræftceller blev implanteret orthotopisk efter en protokol baseret på den metode, rapporteret af Takahashi

et al.

[9] BALB /cCrSlc mus (mandlig, 6 uger gamle) blev fastet i 12 timer og derefter bedøvet med chloralhydrat (400 mg kg

-1 kropsvægt). For at inducere colitis blev musene injiceret intrarektalt med 200 pi 0,1 M HCI i et kolon websted 1,5 cm fjernt fra anus via anus. Efter 10 minutter blev musene injiceret intrarektalt med 200 pi af 0,1 M KOH til neutralisering, efterfulgt af injektion med 400 pi PBS. Efter 9 timer blev musene bedøvet igen og injiceres intrarektalt med 200 pi Colon26 NL-17-celler (8 x 10

6 celler) suspenderet med serum-frit DMEM på samme måde. Anus blev straks fastspændt med en lille Klemme i 2 timer. Ved 1 (n = 3) eller 2 uger (n = 3) efter ortotopisk implantation af coloncancer, blev koloner høstet efter intrakardial perfusion med PBS for at fjerne blod fra hele kroppen.

human coloncancer prøver

To kirurgiske prøver blev opnået fra human colon adenocarcinoma (UICC T klassifikation T3 og T4) og farvet med BTP4-Neu5Ac inden 2 timer efter operationen. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Shizuoka General Hospital (Protokol 13-03-59) og University of Shizuoka (Protokol 25-2), og er i overensstemmelse med erklæringen om menneskerettigheder, Helsinki, gav 2002. Alle patienter skriftligt informeret samtykke.

Påvisning af tyktarmskræft med BTP4-Neu5Ac

mus og menneskelige tyktarmskræft væv blev inkuberet i PBS indeholdende 100-200 uM BTP4-Neu5Ac ved 37 ° C i 60 min. Efter vask med PBS blev fluorescens observeret med et fluorescensmikroskop (excitation filter /emission filter: BP330-385 /BA420) eller IVIS Imaging System (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Baggrund niveau af fluorescens blev bestemt ved hjælp af normale koloner inkuberet i PBS uden BTP4-Neu5Ac.

Histopatologiske pletter

Mus og menneskelige koloner, der var blevet brugt til sialidase aktivitet imaging blev fikseret med 4% paraformaldehyd . Efter at være blevet indlejret med paraffin blev vævet skåret i 4-7 um-tykke snit og farvet ved anvendelse af kanin-anti-CD71-antistof som det primære antistof, PE-konjugeret gede anti-kanin IgG antistof som det sekundære antistof og 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan).

reproducerbarhed

Alle farvninger blev gentaget mindst to gange og reproducerbarhed blev bekræftet.

Resultater og diskussion

design af nye sialidase substrat for histokemisk billeddannelse

Sådan visualisere sialidase aktivitet på vævet, bør aglyconen af ​​sialidase substratet være en vanduopløselig farvning farvestof til at blive fastgjort til vævet . Da fluoroforen af ​​4-methylumbelliferyl-α-D-

N

-acetylneuraminic syre (4MU-Neu5Ac), et almindeligt anvendt kunstig sialidase substrat til kvantificering af enzymaktivitet, er vandopløselig, 4MU-Neu5Ac er ikke egnet til histokemisk billeddannelse af sialidase aktivitet. Benzothiazolylphenol (BTP), et vanduopløseligt fluorofor, viser intens fluorescens i en fast tilstand [10]. BTP-baserede fluorescerende prober er blevet anvendt til visse biologiske og kemiske indikatorer [11], [12], [13]. Når BTP-derivater, BTP2 [14], BTP3 [15] og BTP4 [15], blev sat i en kunstig cerebrospinalvæske (ACSF, pH 7,3), blev de udfældede på bunden af ​​reagensglassene (figur 1 A).

A, vises Fluorescens udsigt over BTP2, BTP3 og BTP4 i ACSF (øvre) og på filtrerpapir under 365 nm UV-lys (lavere). B-D, Excitation (blå prikker og linjer) og emissioner (røde prikker og streger) spektre af BTP2 (B), BTP3 (C) og BTP4 (D) blev målt i ACSF (pH 7,3). Blå og røde tal repræsenterer bølgelængden (nm) på peak fluorescensintensitet. Forkortelser:. RF, relativ fluorescensintensitet

BTP2, BTP3 og BTP4 har forskellig emission og excitation spektre (figur 1 B-D). Da fluorescensfarvning farvestoffer med forskellige excitations- og emissionsspektre har en fordel frem udvalg af filteret indstiller at tage fluorescensbilleder, vi anvendte disse tre BTP derivater som aglyconen af ​​sialidase substrat.

Hydrolyse af BTP-Neu5Ac med sialidase fra

Arthrobacter bacter ureafaciens

Vi syntetiserede BTP-baserede sialinsyrederivater (BTP-Neu5Ac), BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac og BTP4-Neu5Ac ifølge synteseskemaet vist i figur 2 . Disse sialinsyrederivater var vandopløselige og udviste ringe fluorescens. Når BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac og BTP4-Neu5Ac blev inkuberet i ACSF indeholdende 10

0-10

5,7 g enhed ml

-1 sialidase fra

Arthrobacter bacter ureafaciens

(AUSA) ved 37 ° C i 60 minutter (pH 7,3), blev fluorescerende intensiteter forhøjes i forhold til koncentrationen af ​​AUSA og nåede et plateau ved høje koncentrationer (figur 3 a-C). Ekstinktionskoefficienter (M

-1 cm

-1) af BTP2, BTP3 og BTP4 i chloroform var 14970, 12440 og 14350, henholdsvis. Disse resultater indikerede, at BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac og BTP4-Neu5Ac er nyttige til kvantitativ analyse af sialidase aktiviteter

Betingelser:. (A) Amberlite IR-120 (H

+), tør MeOH, natten over, 92% udbytte. (B) AgCl-AcOH, natten over, kvant. (C) BTP2~4, NaH, THF-DMF, stuetemperatur, natten over. (D) NaOMe, tør MeOH, 6 timer, stuetemperatur, derefter NaOH aq., MeOH, stuetemperatur, 2 dage.

A-D, Relative fluorescensintensiteter proportionalt forøget med stigende mængder af AUSA i 10 pM BTP2-Neu5Ac (A), BTP3-Neu5Ac (B) og BTP4-Neu5Ac (C), men ikke i 10 um Res-Neu5Ac (D). Hver søjle og linje repræsenterer middelværdien ± S.E.M. (N = 3). Fluorescensintensiteterne af hver sort bjælke blev sat til 10

5. Res: 10 uM resorufin. E, AUSA blottet på PVDF-membraner blev farvet med 10 pM BTP4-Neu5Ac eller X-Neu5Ac. PVDF-membraner blev observeret under UV-lys for BTP4-Neu5Ac eller synligt lys for X-Neu5Ac. Den blå farve skyldes farvning af AUSA med 100 pM X-Neu5Ac er vist til højre for den stiplede linie.

Resorufin er en vanduopløselig fluorofor med en molekylstørrelse svarende til den i BTP- Neu5Ac. Resorufin-baserede glycosidase substrater er blevet anvendt til cytokemisk farvning og måling af enzymaktivitet [16]. I tilfælde af sialinsyrederivater med resorufin (Res-Neu5Ac), blev fluorescerende intensiteter ikke signifikant ændret ved AUSA (envejs ANOVA, figur 3 D). BTP-Neu5Ac ville være mere passende end Res-Neu5Ac til at passe reaktionen lomme af sialidase.

AUSA blottet på en PVDF membran med forskellige koncentrationer blev farvet med 10 pM BTP4-Neu5Ac. Som et resultat af observation under UV-lys, kan fluorescerende intensiteter ændres i et bredt dynamisk område (figur 3 E, øvre). Følsomheden af ​​BTP4-Neu5Ac var bemærkelsesværdigt højere end X-Neu5Ac (Figur 3 E, nederst).

Visualisering af sialidase aktivitet i rotte akutte hjernen skiver

For at visualisere sialidase aktivitet i rottehjerne blev akutte hjernen skiver inkuberet med ACSF (pH 7,3) indeholdende 1 mM BTP2-Neu5Ac, 1 mM BTP3-Neu5Ac eller 1 mM BTP4-Neu5Ac ved 27 ° C i 60 minutter. Inkubationsbetingelser kamre blev kontinuerligt boblede med 95% O

2 og 5% CO

2 under farvning at holde skive tilstand sund. Efter vask med ACSF, viste hvid substans intense fluorescens i skiverne farvet med BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac og BTP4-Neu5Ac (figur 4 A-C). Dette resultat var i overensstemmelse med resultaterne af de foregående undersøgelser, der viser, at hvide substans i mammale hjerne udviser intens sialidase aktivitet under anvendelse 4MU-Neu5Ac eller X-Neu5Ac med FRV LB [8], [17].

A-C , Sialidase aktivitet blev afbildet i akutte koronale skiver af voksne rottehjerner med BTP2-Neu5Ac (A), BTP3-Neu5Ac (B) og BTP4-Neu5Ac (C) ved pH 7,3. Forkortelser: cc, corpus callosum; ec, ekstern kapsel; fi, fimbria; hofte, hippocampus; ic, indre kapsel. D, Brain skiver blev farvet med forskellige koncentrationer (1-1000 uM) af BTP4-Neu5Ac. E, Sialidase aktivitet blev afbildet med 10 pM BTP4-Neu5Ac eller 10 uM BTP4-Neu5Ac indeholdende 1 mM DANA, en sialidase inhibitor. Emissionsfiltre, der sender over 420 og 510 nm blev anvendt i A-D og E henholdsvis. Scale barer i hvert panel repræsenterer 2 mm.

Da BTP4 er begejstret mere effektivt med excitation båndpasfilter (330-385 nm) af en fluorescens mikroskop end BTP2 eller BTP3, billeddannelse med BTP4-Neu5Ac udviste den mest intense fluorescens i disse BTP-Neu5Ac serien. Vi analyserede også følsomheden og specificiteten af ​​BTP4-Neu5Ac mod sialidase. I tilfælde af sialidase aktivitet billeddannelse med X-Neu5Ac og FRV LB, en høj koncentration af X-Neu5Ac, generelt 1 mM, er der behov for at forbedre følsomheden og specificiteten mod mammal sialidase aktivitet [7], [8]. På den anden side kan BTP4-Neu5Ac detektere sialidase aktiviteter med lave substratkoncentrationer endog mindre end 10 pM (figur 4 D). Når 2,3-dehydro-2-deoxy-N-acetylneuraminsyre (DANA, 1 mM), en sialidase inhibitor, blev anvendt i farvning med BTP4-Neu5Ac, blev fluorescens bemærkelsesværdigt svækket i hele hjernen område (figur 4 E). BTP-Neu5Ac er specifikt hydrolyseres med sialidase, hvilket resulterer i en bemærkelsesværdig stigning i fluorescensintensitet.

Siden BTP-Neu5Ac, et hydrofilt substrat, fyldt i det ekstracellulære rum blev hydrolyseret med mammal sialidase af levende væv under fysiologiske ekstracellulære betingelser , sialidase vil spalte BTP-Neu5Ac hovedsagelig på celleoverfladen. Den plasmamembranen sialidase NEU3 hydrolyseret gangliosid effektivt og med lav molekylvægt substrater såsom 4MU-Neu5Ac lidt [18], [19]. Selvom den optimale pH NEU3 er 3.8, NEU3 hydrolyserer gangliosid ved selv neutral pH [19], [20]. Den lysosomale sialidase NEU1 blev også rapporteret at være til stede på plasma membraner og at hydrolysere 4MU-Neu5Ac effektivt [21], [22], [23]. Derudover cytosoliske sialidase NEU2 har en membranbundne form og hydrolyserer 4MU-Neu5Ac [24]. Derfor ikke kun NEU3 men også andre sialidase isozymer ville blive inddraget i den sialidase aktivitet detekteres med BTP-Neu5Ac.

cytotoksicitetsanalyse af BTP-Neu5Ac og BTP

For cytotoksicitet måling, MDCK celler blev udsat for BTP-Neu5Ac eller BTP til 6 (data ikke vist) eller 16 (figur 5) timer. Som et resultat af måling for de mængder af laktat dehydrogenase (LDH) frigivelse fra celler med beskadiget membran, blev ingen signifikant cytotoksicitet opdaget for BTP-Neu5Ac og BTP (envejs ANOVA).

MDCK celler blev udsat for et serum-frit medium (SFM) indeholdende 10 eller 100 uM BTP-Neu5Ac (a) eller BTP (B) i 16 timer og frigivet LDH blev målt. LDH frigivelse vises som i forhold til at fuldføre LDH frigivelse (100%) ved behandling med lysisbuffer.

Påvisning af kræftceller i mus kolon væv

For nylig, teknologi til kræft imaging har skred bemærkelsesværdigt. F.eks Oku

et al.

Udviklet en ny positron emitter-mærkede liposom til positronemissionstomografi (PET) til billedet en lille hjernekræft invasivt i realtid [25]. Urano

et al.

Udviklet en kræft-targeting monoklonalt antistof konjugeret med pH-aktiverbare fluorescens prober til

in vivo

tumor afsløring [26]. En yderst følsom og specifik fluorescerende kræft sonde har fordele til påvisning små kræftformer, fordi den mindste størrelse af en tumor opdages ved anvendelse af fluorescens endoskopi (ca. -1 mm) er meget mindre end den, PET, computertomografi (CT) og magnetisk resonans ( MRI) (ca. 5-20 mm) [27], [28]. Tidligere påvise kræft og efter en hurtig helbredelse af dem effektivt forhindrer ikke kun ondartet ændring af kræft, men også distale metastaser og stærkt lover forbedring af prognosen.

Da tyktarmskræft er rapporteret at udvise intens enzymaktivitet af et plasma membran- associeret sialidase [29], forsøgte vi at opdage tyktarmskræft med BTP4-Neu5Ac i levende kolon væv. Mus blev implanteret orthotopisk med Colon26 NL-17-celler, som er yderst metastatiske cancerceller isoleret fra en mus, colon adenocarcinom 26. Efter 1 eller 2 uger blev colonvæv høstet og inkuberet i phosphatpufret saltvand (PBS) indeholdende 100 uM BTP4- Neu5Ac. Intens fluorescens blev observeret i tyktarmen implanteret med Colon26 NL-17-celler, men ikke i inflammatoriske eller normale koloner (figur 6 A-C, fig S1). Henviser normal colon væv viste svag fluorescens, fluorescens af coloncancer var meget stærkere end for normalt væv (figur 6 D-F). De regioner, der viser intens fluorescens i colon implanteret med Colon26 NL-17-celler blev bekræftet at have kræft ved immunhistokemisk farvning (Figur 6 G). Derfor kunne tyktarmskræft skelnes let fra normale væv ved hjælp af BTP-Neu5Ac.

A, En uge efter ortotopisk kolon implantation af Colon26 NL-17 celler, levede kolon væv farvet med BTP4-Neu5Ac. Pilespids angiver kræft region. B og C, Inflammatory (B) eller normale (C) koloner blev også farvet med BTP4-Neu5Ac. Venstre, midterste og højre paneler i panel A-C viser lyse felt, fusioneret og fluorescerende udsigt hhv. D og E, Forstørret billede af cancer (D) og normal (E) region farvet med BTP4-Neu5Ac. F, Baggrundsfluorescens niveau af paneler D og E er vist. G, Immunohistokemisk farvning (rød fluorescens) ved anvendelse af kanin-anti-CD71-antistof og PE-konjugeret gede anti-kanin IgG-antistof og nuklear farvning med DAPI (blå fluorescens) blev udført for at påvise tyktarmskræft i tværsnit i muse-colonvæv, der var anvendes til sialidase aktivitet billeddannelse i panel A og D. pile viser regioner viser intens fluorescens af BTP i panel A og D. Scale bar i felt C udgør 2,5 mm og er almindelig i panel A og B. Scale bar i panel F betegner 0,5 mm og er almindelig i paneler D og E. Scale bar i panel G repræsenterer 0,2 mm.

sialidase aktiviteter udtrykt i Colon26 NL-17 blev rapporteret til at være svageste blandt colonadenocarcinom 26 underlinjer såsom NL- 4, NL-17, NL-22 og NL-44 [30]. Da selv Colon 26 NL-17 adenocarcinom implanteret orthotopisk i muse koloner blev påvist med BTP-Neu5Ac klart, ville BTP4-Neu5Ac være følsomme nok til kræft sonde.

Påvisning af kræft i humane colon væv

det er blevet rapporteret, at ekspressionsniveauet af Neu3 mRNA i human coloncancer er 3-100 gange højere end i normalt væv [29]. Derfor forsøgte vi også at opdage menneskelige tyktarmskræft med BTP4-Neu5Ac. Efter inkubation af menneskelig tyktarmskræft levende væv, der er kategoriseret som T3 ved T klassificering af Union for International Cancer Control (UICC), i PBS indeholdende 200 uM BTP4-Neu5Ac blev intens fluorescens observeret i tumor regioner, men ikke i de normale områder (Figur 7 A-G). De regioner, der viser intens fluorescens og ikke-fluorescens blev bekræftet at være kræft og normale væv, henholdsvis ved hjælp af hæmatoxylin-eosin-farvning (figur 7 H og I). Cancer kategoriseret som T4 også blev påvist med BTP4-Neu5Ac i humane colonvæv (data ikke vist). Selvom der er behov for yderligere evaluering af toksicitet, vil det være muligt at bruge BTP4-Neu5Ac for kræft opdagelse ikke kun i patologisk undersøgelse, men også ikke-invasiv diagnose.

A, A menneskelig tyktarmskræft eksemplar (område lukket med en hvid linje ) blev opnået fra kirurgiske kræftvæv (UICC T klassifikation: T3). B-D, Den kolon væv blev farvet med BTP4-Neu5Ac. B, C og D viser fotografiske, fusioneret og fluorescerende billeder, hhv. E-G, Forstørrede fluorescensbilleder af normal (E) og cancer (F og G) regioner erhvervet med et fluorescerende mikroskop. H og I, A langsgående udsnit af colon væv blev fremstillet ved den stiplede linie i panel B. Ikke-fluorescens og fluorescens regioner i panel C blev farvet med hæmatoxylin-eosin og er vist i panelerne H og I, henholdsvis. Scale barer i panel B, E og H udgør 10 mm (almindelig i paneler B-D), 500 um (fælles i panelerne E-G) og 250 um (almindelig i paneler H og I), hhv.

konklusioner

Vi udviklede nye fluorescerende sialidase substrater til histokemisk farvning af sialidase aktiviteter i pattedyrvæv. Da sialidase spiller afgørende roller i mange biologiske funktioner, herunder lysosomale katabolisme, immunsystemet og neurale funktioner [2], [31], BTP-Neu5Ac er et kraftfuldt værktøj til detaljeret undersøgelse af sialidase funktioner. Da cytotoksiciteter af BTP-Neu5Ac og BTP blev målbart, BTP-Neu5Ac kan anvendes til biologisk assay af sialidase i det levende væv, f.eks time-lapse billeddannelse. Endelig blev tyktarmskræft opdages med BTP4-Neu5Ac i en levende væv, hvilket tyder på, at BTP-Neu5Ac ville også være nyttigt for kræft sonder.

Støtte oplysninger

figur S1.

Påvisning af koloncancer med BTP4-Neu5Ac i to uger efter implantation af cancerceller. To uger efter orthotopical implantation af Colon26 NL-17-celler, blev mus koloner farvet med BTP4-Neu5Ac. Inflammatoriske eller normale koloner blev også farvet med BTP4-Neu5Ac. Venstre og højre paneler viser fluorescerende billeder og lyse felt billeder fusioneret med fluorescerende billeder, hhv. Scale søjle repræsenterer 5,0 mm

doi:. 10,1371 /journal.pone.0081941.s001

(TIF)

File S1.

Syntetiske procedurer og

1H spektre af nye forbindelser

doi:. 10,1371 /journal.pone.0081941.s002

(PDF)