PLoS ONE: Udtømning af HDAC6 Forbedrer Cisplatin-induceret DNA Skader og apoptose i ikke-småcellet lungekræft Cells

Abstrakt

histondeacetylaseinhibitorer (HDACi) er lovende terapeutiske midler, der i øjeblikket anvendes i kombination med kemoterapeutiske agenter i kliniske forsøg til behandling af kræft, herunder ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Men mekanismerne bag deres anti-tumor aktiviteter forbliver undvigende. Tidligere undersøgelser har vist, at inhibering af HDAC6 inducerer DNA-ødelæggelse og sensibiliserer transformerede celler til antitumormidler, såsom etoposid og doxorubicin. Her viste vi, at udtømning af HDAC6 i to NSCLC cellelinjer, H292 og A549, sensibiliserede celler til cisplatin, en af ​​de første online-kemoterapeutiske midler, som anvendes til behandling af NSCLC. Vi foreslog, at udtømning af HDAC6 øget cisplatin-induceret cytotoksicitet skyldtes forøgelsen af ​​apoptose via aktivering ATR /Chk1 vej. Desuden viste vi, at HDAC6 protein niveauer var positivt korreleret med cisplatin IC

50 i 15 NSCLC cellelinjer. Endelig udtømning af HDAC6 i H292 xenografter afsmeltet nedsat tumor vægt og volumen og udstillet øget basal apoptose sammenlignet med kontrollerne i en xenograft musemodel. Sammenfattende vores resultater tyder på, at HDAC6 er positivt associeret med cisplatin resistens i NSCLC og afslører HDAC6 som en potentiel ny terapeutisk mål for platin ildfast NSCLC

Henvisning:. Wang L, Xiang S, Williams KA, Dong H, Bai W, Nicosia SV et al. (2012) Udtømning af HDAC6 Forbedrer Cisplatin-induceret DNA Skader og apoptose i ikke-småcellet lungekræft Cells. PLoS ONE 7 (9): e44265. doi: 10,1371 /journal.pone.0044265

Redaktør: Guenter Schneider, Technische Universität München, Tyskland

Modtaget: 4. maj 2012; Accepteret: 31 juli 2012; Udgivet: September 5, 2012 |

Copyright: © Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af National Cancer Institute of National Institutes of Health under Award nummer R01CA164147, New Investigator tilskud (09KN-17) fra Florida James og Esther kong Biomedical Program, den Marsha Rivkin Foundation pilot tilskud, æggestokkene Cancer Research Fund (oCRF ), karriereudvikling bevilling fra H. Lee Moffitt Cancer center lungekræft SPORE til XZ og USF Graduate Student succes Diversity Fellowship til KAW. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er stadig den hyppigste årsag til kræft død for både mænd og kvinder i USA, hævder mere lever årligt end de næste tre årsager til kræft død (kræft i bryst, tyktarm og prostata) kombineret [1 ]. NSCLC udgør over 80% af alle lungekræfttilfælde. Overlevelsesrater for patienter med NSCLC forblive ekstremt lave, med kun 16% af patienterne i live 5 år efter en lungekræft diagnose. Selv om denne dårlig prognose forklares delvist af det store antal patienter, som med fremskreden sygdom, selv patienter identificeret på et tidligt stadium erfaring høje tilbagefald på trods af tilstrækkelig kirurgisk resektion [2].

Flere store randomiserede forsøg har vist beskedne forbedringer i langsigtede overlevelse med adjuverende cisplatin kemoterapi [3] – [6]. På grundlag af disse undersøgelser, er adjuverende kemoterapi blevet standard for pleje af patienter med stadie II og III NSCLC. Da en relativt lille population synes at drage fordel af kemoterapi, er mange patienter udsættes for toksisk behandling uden klinisk fordel. En bedre forståelse af de mekanismer for modstand til platinbaseret kemoterapi er påkrævet, og der er behov for strategier til at identificere patienter usandsynligt at drage fordel af behandlingen. Nye fremgangsmåder til at overvinde platinmodstandstermometer kan målrettes til disse populationer. Salg

HDAC, en klasse af enzymer, der fjerner acetylgrupper fra ε-N-acetyl lysinaminosyre på histoner eller andre ikke-histon-proteiner, spiller vigtige roller i cellevækst, apoptose, DNA-skader, etc. De mammale HDAC’er er inddelt i fire klasser: klasse i (HDACs 1, 2, 3, og 8), klasse II (HDAC 4, 5, 6, 7, 9 og 10 ), klasse III (SIRTs 1, 2, 3, 4, 5, 6, og 7), og klasse IV (HDAC11) [7], [8]. Klasse I HDACs lokalisere hovedsagelig i kernen og findes i undertrykkende komplekser, såsom Sin3, NuRD, Corest, PRC2, N-RU, og SMRT komplekser, som deacetylate histoner og andre nukleare proteiner. Klasse II HDACs er yderligere opdelt i IIa og IIb underklasser og disse medlemmer udviser vævsspecifik ekspression. Klasse III medlemmer er SIR2-relaterede NAD

+ – afhængige deacetylaser. HDAC11 er det eneste medlem af klasse IV familien på grund af sin lave sekvens lighed med klasse I og klasse II medlemmer.

HDAC6 tilhører klassen IIb HDAC’er. Det blev klonet som et mammal homolog af gær hda1 fra mus og menneske, henholdsvis [9], [10]. Unikt, HDAC6 indeholder to funktionelle tandem deacetylase domæner, betegnet DAC1 og DAC2, eller DD1 og DD2, samt en ZnF-UBP domæne, som er et zinkfinger indeholdende region der er homolog med det ikke-katalytiske domæne af adskillige ubiquitin-specifikke proteaser (befordringspligtige virksomheder) [11]. HDAC6 ZnF-UBP domæne er i stand til at binde mono- eller poly-ubiquitin samt ubiquitinerede proteiner [11] – [13]. Substrater af HDAC6 omfatter cytosoliske proteiner, såsom α-tubulin, hsp90, cortactin osv [14] – [16]. HDAC6 fungerer også i ubiquitin-afhængig autofagi ved at tillade forarbejdning eller nedbrydning af proteinaggregater [17]. Derudover er HDAC6 involveret i misfoldet protein induceret celle stress [18]. HDAC6 er nu betragtes som en master regulator af celle respons på cytotoksiske overfald [19]. En nylig rapport har vist, at HDAC6 er involveret i DNA-ødelæggende midler inducerede genotoksisk stress [20]. Men de underliggende mekanismer er langt fra klart.

HDAC’er udtryk er ændret i talrige kræftformer. For eksempel har overekspression af HDAC1, HDAC2, HDAC3, og HDAC6 blevet observeret i colon, bryst, prostata, cervix og gastriske cancere [21] – [28]. Hæmmer HDAC-enzymer ved HDAC-hæmmere har vist sig som en lovende metode til behandling af kræft [29] – [31]. HDAC-inhibitorer ændrer acetylering status kromatin og andre ikke-histon-proteiner, hvilket resulterer i ændringer i genekspression, induktion af apoptose, vækststandsning, og celle terminal differentiering [31]. Især er HDAC-hæmmere lovende adjuverende lægemidler, der anvendes i kombination med platinbaseret kemoterapi i flere kræftformer, herunder lungekræft [32].

I denne undersøgelse har vi vist, at HDAC6 giver cisplatin resistens i NSCLC cellelinjer. Knockdown af HDAC6 eller inhibering af HDAC6 aktivitet ved HDAC6-specifikke inhibitor tubastatin A i NSCLC cellelinier A549 og H292 sensibiliserede cellerne for cisplatin-behandling. Derudover blev en positiv og signifikant korrelation mellem HDAC6 proteinniveau og IC

50 af cisplatin fundet i 15 NSCLC cellelinier. Desuden H292 xenografter med HDAC6 udtømning vises mindre tumor vægt og volumen, samt øget basal apoptose sammenlignet med kontrol implanteret. Alt i alt, vores resultater tyder på, at udviklingen af ​​kliniske relevante HDAC6-selektive inhibitorer vil være gavnligt at blive brugt i kombination med platinbaseret terapi i NSCLC.

Materialer og metoder

Kemikalier og reagenser

En 10 mM stamopløsning af vorinostat (Selleck kemikalier) blev fremstillet i dimethylsulfoxid (DMSO) og fortyndet som de nødvendige koncentrationer i celledyrkningsmedium. Tubastatin A blev købt fra BioVision. En 15 mM stamopløsning af tubastatin A blev fremstillet i DMSO. Cisplatin og paclitaxel blev indkøbt fra Sigma. Cisplatin blev fremstillet som en 50 mM stamopløsning i dimethylformamid (DMF) og paclitaxel som en 10 mM stamopløsning i DMSO. Antistoffer mod phosphorylering af histon H2AX (γH2AX) (20E3), phosphoryleret ATR (Ser428) (# 2853), phosphoryleret Chk1 (Ser296) (# 2349), phosphoryleret p53 (Ser15) (16G8), anti-ATR (# 2790), anti-caspase 3 (8G10), PARP-1 (# 9524S), og α-tubulin (1h10) blev indkøbt fra Cell Signaling Technology, mens anti-acetyleret tubulin og anti-β-actin var fra Sigma. Anti-Chk1 (2G1D5), anti-p53 (DO-1) og anti-HDAC6 (H-300) antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology.

cellelinjer og Generation of Scramble og HDAC6 Knockdown H292 Cell linjer

NSCLC cellelinjer ADLC, A549, EPLC, H23, H292, H358, H441, H460, H522, H661, H820, H1650, H1975, H2122, og H2172 blev indhentet fra American Type Culture Collection (ATCC ). Celler blev dyrket i RPMI 1640 medium med penicillin (100 U /ml), streptomycin (100 ug /ml) og 10% føtalt bovint serum (FBS) og inkuberet ved 37 ° C med 5% CO

2. A549 HDAC6 knockdown (A549-HD6KD) og kontrol (A549-Sup) stabile cellelinier blev venligst stillet til rådighed af Dr. Tso-Pang Yao som beskrevet af Kawaguchi et al. [18]. H292 scramble og HDAC6 knockdown stabile cellelinier blev klonalt udvalgt af 0,5 ug /ml puromycin. Først blev H292-celler transient transficeret med kontrolvektor PRS eller shRNA vektor mod HDAC6 (genkende sekvensen 5-AGGTCTACTGTGGTCGTTACATCAATGGC-3 ‘, rør ID: TI349960, ORIGENE) (Cat # TR20003.). Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne delt at duplikere plader af 1:20 i RPMI1640-medium indeholdende 0,5 ug /ml puromycin. Puromycin var genopfyldes hver 2 dage for at opretholde tilstrækkelig udvælgelse pres. De velisolerede enkelte kloner blev overført til 24-brønds plader. Knockdown virkning blev bekræftet ved Western blotting-analyse under anvendelse af anti-HDAC6 antistoffer.

MTT-assays Salg

Cell vækst og levedygtighed blev vurderet ved MTT-assayet. Kort beskrevet blev celler podet i sextuplet i 96-brønds fladbundede plader ved en densitet på 5 x 10

3 celler /brønd. Lægemidlerne blev i de angivne koncentrationer tilsat 24 timer efter podning, mens køretøjet blev tilsat som kontrol. På de angivne dage blev celler inkuberet med 3- (4, 5-dimethylthiszol-x-yl) -2, 5-diphenytetrazolium (MTT) (Sigma) opløsning i 4 timer, derefter tilsat 100 pi DMSO og rystet i 15 min. Absorbansen af ​​cisplatin-eksponerede kulturer blev målt ved anvendelse af en multi-brønd spektrofotometer ved 550 nm med en 630 nm reference. Resultaterne blev præsenteret som procent absorbans i forhold til køretøjet kontrolkulturer.

Cell Cycle Analysis

H292-celler blev høstet og forsigtigt resuspenderet i enkelt cellesuspension i Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) (PBS indeholdende 2% FBS). Cellerne blev vasket med PBS to gange og fikseret i kold 70% ethanol natten over. Celler blev derefter vasket to gange med kold PBS igen, resuspenderet i 50 pi PBS plus 3,3 pi RNase A opløsning (30 ug /ml) og inkuberet i 30 minutter ved 4 ° C. Suspensionen blev tilsat 450 pi FACS buffer og 25 pi propidiumiodid (PI, 1 mg /ml) efterfulgt af inkubation ved 4 ° C i 30 minutter. Celler blev derefter analyseret med FACS maskine straks. Resultater blev analyseret med FlowJo v8.3.3 software.

immunblotting analyser

Whole-celleekstrakter blev fremstillet ved tilsætning af RIPA-buffer (25 mM Tris-HCI pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% NP -40, 1% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, og protease inhibitor cocktail). Proteinkoncentrationen af ​​alle prøver blev bestemt ved Bradford-reagens (Bio-Rad). Proteiner blev opløst på 8% eller 12% SDS-PAGE geler og overført til nitrocellulosemembraner. Membranerne blev probet med primære antistoffer og peberrodsperoxidase (HRP) konjugeret sekundære antistoffer (GE Healthcare). Endelig blev blots visualiseret ved hjælp af kemiluminescens-detektion Kit (Pierce).

Comet Analyser

Efter cisplatin behandling blev H292-PRS kontrol eller HD6-KD-celler bestrålet med 10 Gy gammastråling til introducere tilfældige enkeltstrengede pauser. Dybest set, jo flere tværbindinger indføres ved cisplatin, jo færre enkeltstrengede pauser vil blive detekteret i bestrålede celler. Comet assays blev udført under anvendelse af et OxiSelect ™ Comet assay kit (Cell Biolabs, Inc.) ifølge producentens protokol.

immunofluorescens Mikroskopi

Celler dyrket på kammerobjektglas (Chamber Slide System lab TekII) blev vasket med PBS og fikseret i 4% paraformaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur. Fiksering blev standset med PBS indeholdende 1% glycin. Celler blev permeabiliseret under anvendelse af 1% glycin /0,5% Triton X-100-opløsning ved stuetemperatur i 15 minutter. Efter blokering med 5% bovint serumalbumin (BSA) i 1 time blev celler inkuberet i PBS indeholdende 0,2% Triton X-100, 1% BSA, og anti-γH2AX antistof (20E3) natten over ved 4 ° C. Celler blev derefter vasket med PBST (PBS indeholdende 0,1% Tween) efterfulgt af inkubering med sekundært antistof (i PBS indeholdende 1% BSA) i 45 min. Endelig blev cellerne vasket med PBS indeholdende 0,1% Tween og derefter PBS alene. Objektglassene blev tørret og monteret med Vectashield® mounting medium indeholdende DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA).

kolonidannelse Assay

Kort fortalt blev cellerne podet tredobbelt (1000 celler pr 60 mm vævskulturskål) og inkuberet natten over ved 37 ° C tillader celler at vedhæfte til skålene. Celler blev derefter behandlet med vehikelkontrol eller cisplatin i 8 dage. Bagefter blev cellerne vasket med PBS, fikseret med 4% paraformaldehyd i 15 minutter, og farvet med krystalviolet (0,5% krystalviolet, 1% paraformaldehyd og 20% ​​methanol i PBS) i 30 min. Kolonier på hver plade blev talt og celleoverlevelse efter cisplatin-behandling blev udtrykt som en procentdel af antallet af overlevende kolonier på kontrolpladerne.

tumorvækst

Alle procedurer med mus blev udført under en protokol med titlen: rolle HDAC6 i Platinum Resistance af ikke-småcellet lungekræft, som blev godkendt af en Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) i afdelingen for Research Integrity og Compliance på University of South Florida den 2011/10/19 (protokol # R4064). Den 5- til 6-uger gamle athymiske nøgne mus (nu /nu-mus), der vejede ca. 20 g, blev erhvervet fra National Cancer Institute (NCI). H292-pRS kontrolceller (5 × 10

6 celler /100 pi i RPMI 1640 medium plus 50% matrigel) blev injiceret subkutant i den venstre flanke og den samme mængde H292-HD6KD celler blev injiceret i den højre flanke. Tumorer fik lov til at vokse i seks uger. Tumorstørrelser blev registreret hver uge. Tumor volumen blev beregnet ved hjælp af formlen V = (L × B

2) × 0,5 (V = volumen, L = længde, W = bredde) [33]. Gennemsnitlige tumorvægt blev også beregnet efter høst tumorer.

immunhistokemisk farvning

H292 kontrol og HDAC6 knockdown xenotransplantater blev høstet og fikseret i formalin, derefter indlejret i paraffin og sektioneret. Tissue microarray af 12 xenografter af H292-PRS og H292-HD6KD par blev udarbejdet af Moffitt histologi core facilitet hjælp Beecher Instrument Tissue arrayer. Objektglas blev farvet ved anvendelse af en Ventana Discovery XT automatiseret system (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) i henhold til producentens protokol med proprietære reagenser. Kort fortalt blev objektglas deparaffineret på det automatiserede system med EZ Prep-opløsning (Ventana). Varmeinduceret antigen-genvinding metode blev anvendt i Cell Conditioning 1 (Ventana). Kaninen primære antistof, som reagerer på spaltet caspase 3, (# 9661, Cell Signaling, Danvers, MA) eller Ki67 (# M3060, Spring Bioscience) blev anvendt i en koncentration i Dako antistoffortynder 1:400 eller 1:100 (Carpenteria, CA) og inkuberet i 60 min. Ventana anti-kanin sekundært antistof blev anvendt i 16 min. Den anvendte detektionssystem var Ventana OmniMap kit, og slides blev derefter modfarvet med Hematoxylin. Slides blev derefter dehydreret og dækglas som normalt laboratorium protokol.

En Tissue Microarray (TMA) slide farvet mod spaltet caspase 3 har været digitalt scannet ved hjælp af Aperio ™ (Vista, CA) ScanScope XT med en 200x /0,75 NA objektiv med en hastighed på 4 minutter pr slide via Basler tri-lineær-array. Billede analyse blev udført ved hjælp af en optimeret Aperio PositivePixelCount ® v9.0 algoritme med følgende optimerede tærskler [HueValue = 0,1; HueWidth = 0,5; IWP (Høj) = 220; IWP (Lav) /Ip (Høj) = 175; Ip (Lav) /ISP (Høj) = 100; ISP (Low) = 0; InP (Høj) = -1] til segment positive pixels af forskellige intensiteter. Procenten af ​​positivitet er blevet kvantificeret ved antallet af celler, der udviser positiv plet som en procentdel af total tumor celletal. Den farvningsintensitet blev tærsklingsbehandlet som parametertized ovenfor ind negativ (0), lav (1+), moderate (2+) og stærkt positive (3+) ved gennemsnitlig plet densitet (0-255 dynamikområde) for hver TMA kerne. Uddannelsen algoritme udviklet blev kvalitet kontrolleret af en praktiserende patolog.

Statistisk analyse

Alle analyser blev udført i mindst tre uafhængige forsøg. Dataene blev præsenteret som middelværdi ± SEM, og statistiske sammenligninger mellem grupper blev udført ved anvendelse envejs ANOVA efterfulgt af Dunnet-testen. En

s

-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Spearman koefficient og

s

-værdi for sammenhængen mellem HDAC6 niveau og cisplatin IC

50 blev beregnet ved SAS-software.

Resultater

HDAC6 er associeret med cisplatin induceret Cytotoksicitet i NSCLC cellelinier

for at karakterisere rolle HDAC6 i cisplatin modstand, to par HDAC6 knockdown cellelinjer fra H292 og A549 blev etableret (figur 1A og 1D). Cytotoksicitet af cisplatin i kontrol og HDAC6 Knockdown par (H292-PRS, og H292-HD6KD; A549-Sup og A549-HD6KD) blev målt ved MTT-assays. Som vist i figur 1B og 1E, der vises, A549 og H292 celler depleteret for HDAC6 forbedret cytotoksicitet efter cisplatin behandling i 3 dage, sammenlignet med dem for kontrolceller. For at bestemme den langsigtede virkning af HDAC6 knockdown på celleoverlevelse, udførte vi kolonidannelse assays. Som vist i figur 1G og 1H, udtømning af HDAC6 faldt betydeligt antallet af kolonidannelse i H292 celler efter cisplatin-behandling. Interessant nok knockdown af HDAC6 ikke forbedre paclitaxel-induceret cytotoksicitet i A549 og H292 celler, hvilket antyder, at den forøgede følsomhed over for cisplatin ved udtømning af HDAC6 var lægemiddel specifikt (figur 1C og 1F). For at undersøge, om udtømning af HDAC6 kan re-sensibilisere cisplatin resistente celler, C13 cellelinje, en cisplatin resistent kræft i æggestokkene cellelinje afledt fra OV2008 [34], blev stabilt transficeret med kontrol eller HDAC6 shRNA at etablere kontrol og HDAC6 knockdown cellelinjer. Som vist i figur S1, udtømning af HDAC6 i C13-celler dramatisk reducerede cisplatin IC

50 sammenlignet med kontrolceller. For at udvide vores resultater, vi målte HDAC6 niveau og cisplatin IC

50 i 15 NSCLC cellelinjer. Som vist i figur 1I og S2, HDAC6 proteinniveauet positivt korreleret med cisplatin IC

50. Spearman koefficient (0,64875) og

s

-værdi (0,0089) foreslået, at denne sammenhæng var statistisk signifikant. Vi næste spurgt, om udtømning af HDAC6 i ikke-transformerede celler kunne sensibilisere celler til cisplatin. Som vist i figur S3, blev cisplatin IC

50 faldt betydeligt i HDAC6 knockout embryonale fibroblaster (MEF’er) sammenlignet med vildtype MEF’er. Samlet set vores resultater viste, at HDAC6 giver cisplatin modstand.

blev H292-celler transficeret med scramble shRNA eller shRNA mod HDAC6 at generere H292-PRS eller H292-HD6KD stabil klon, hhv. HDAC6 ekspression i kontrol (H292-PRS) eller HDAC6 knockdown (H292-HD6KD) celler blev påvist ved anti-HDAC6 Western blotting-analyse (øvre panel). Anti-β-actin Western blotting blev udført for at sikre lige belastning af protein (nederste panel). B, Knockdown af HDAC6 sensibiliserede H292 celler til cisplatin behandling. MTT-assays blev udført ved anvendelse H292-PRS eller H292-HD6KD cellerne eksponeret for vehikelkontrol (0 uM cisplatin) eller angivne koncentrationer af cisplatin i 3 dage. C, Knockdown af HDAC6 ikke sensibiliserer H292 celler til paclitaxel behandling. MTT-assays blev udført ved anvendelse H292-PRS eller H292-HD6KD celler behandlet med vehikelkontrol (0 nM paclitaxel) eller angivne koncentrationer af paclitaxel i 3 dage. D, HDAC6 blev effektivt udtømt i A549 celler. HDAC6 ekspression i kontrol (A549-Sup) eller HDAC6 knockdown celler (A549-HD6KD) blev påvist ved anti-HDAC6 Western blotting-analyse (øvre panel). Den anti-β-actin Western blotting-analyse blev også udført for at sikre lige belastning (nederste panel). E, Knockdown af HDAC6 sensibiliserede A549 celler til cisplatin-behandling. MTT-assays blev udført ved anvendelse A549-Sup eller A549-HD6KD celler behandlet med vehikelkontrol eller angivne koncentrationer af cisplatin i 3 dage. F, Knockdown af HDAC6 ikke sensibiliserer A549-celler til paclitaxel behandling. MTT-assays blev udført ved anvendelse A549-Sup eller A549-HD6KD celler behandlet med vehikelkontrol eller angivne koncentrationer af paclitaxel i 3 dage. G, kolonidannelse blev udført med H292-PRS, og H292-HD6KD celler i 8 dage med vehikelkontrol (0 uM cisplatin) eller angivne koncentrationer af cisplatin. H, De kvantitative resultater blev opnået ved at beregne kolonier fra G.

Kolonner, betyder fra tre eller seks dubletter; barer, SEM (*, P 0,05, **, P 0,01, ***, P 0,001)

. I, HDAC6 niveauer positivt korrelerer med cisplatin IC

50 i et panel af NSCLC-cellelinier. HDAC6 protein niveauer blev opnået ved Western blotting analyser af 15 NSCLC linjer (ADLC, A549, EPLC, H23, H292, H358, H441, H460, H522, H661, H820, H1650, H1975, H2122, og H2172) og kvantificeret ved Mængde One software. Cisplatin IC

50 blev beregnet ud fra MTT-assays efter behandling af disse celler i 3 dage. Sammenhængen mellem HDAC6 proteinniveau og cisplatin IC

50 blev analyseret af SAS software. En dot-plot blev anvendt til at illustrere den positive sammenhæng mellem HDAC6 niveau og cisplatin IC

50. Spearman koefficient var 0,64875 og

s

-værdi var 0,0089.

Udtømning af HDAC6 forstærker Cisplatin-induceret apoptose

For at bestemme om knockdown af HDAC6 forbedret cisplatin cytotoksicitet er på grund af celle apoptose, vi undersøgte PARP1 spaltning i H292-PRS og H292-HD6KD par. Som vist i figur 2A, blev spaltet PARP1 forhøjet i H292-HD6KD celler sammenlignes med den i H292-pRS celler efter 5 pM eller 10 pM cisplatin behandling. Desuden som vist i figur 2B, den spaltede PARP1 band optrådte tidligere (dag 1) i H292-HD6KD celler sammenlignet med kontrolceller (dag 2). Lignende resultater blev også opnået ved anvendelse HDAC6 vildtype og knockout MEF’er par (figur S4) og A549-Sup og A549-HD6KD par (data ikke vist). For at bekræfte vores resultater, flowcytometri analyse blev anvendt til at detektere apoptotisk population i celler udsat for cisplatin. Som vist i figur 2C og 2D, sub-G1 population, som angiver apoptotiske celler [35], blev dramatisk forøget i H292-HD6KD celler sammenlignet med H292-pRS celler eksponeret for 5 eller 10 uM cisplatin. Derfor, udtømning af HDAC6 øgede cisplatin-induceret apoptose. For at undersøge, om apoptose blev caspase 3 afhængig, vi har registreret niveauerne af kløvet caspase 3 i H292-PRS eller H292-HD6KD celler udsat for cisplatin. Som vist i figur 2E, blev niveauerne af spaltet caspase 3 steg i HD6KD celler, når de udsættes for 1, 5 eller 10 uM cisplatin, sammenlignet med kontrolceller. Samlet tyder vore resultater på, at udtømning af HDAC6 øger caspase-afhængig apoptose ved cisplatin behandling i NSCLC-celler.

, H292-PRS eller H292-HD6KD celler blev behandlet med angivne koncentrationer af cisplatin i 24 timer. Anti-PARP1 og anti-p-actin Western blotting analyser blev udført. B, H292-PRS, og H292-HD6KD celler blev behandlet med 5 pM cisplatin for de angivne dage. Anti-PARP1 og anti-p-actin Western blotting-analyser blev udført. C, Sub-G1 befolkning blev bestemt i H292-PRS eller H292-HD6KD celler behandlet med køretøj (0 uM cisplatin) eller cisplatin ved FACS-analyse. CDDP betegner cisplatin. D, Kvantitativ præsentation af de procentdele af sub-G1 fase celler fra C. E, H292-PRS eller H292-HD6KD celler blev behandlet med angivne dosering af cisplatin, og anti-spaltet caspase 3 og anti-β-actin Western blotting analyser var udført.

Knockdown af HDAC6 forværrer cisplatin-induceret DNA Damage

at udforske funktioner HDAC6 i cisplatin-induceret DNA-skader, blev H292-pRS, og H292-HD6KD celler undersøgt ved enkelt celle comet assay en standard teknik til at evaluere DNA-beskadigelse. Efter cisplatin behandling blev begge celler eksponeret for 10 Gy ioniserende stråling for at inducere tilfældige enkelt strengbrud (angivet med komet haler). Virkningen af ​​cisplatin-induceret tværbinding blev vist ved afkortning af komet haler [36]. Som vist i figur 3A, venstre to paneler, efter bestråling lignende distinkte kometer blev observeret i både kontrol- og HD6KD celler udsat for vehikelkontrol. Men efter cisplatin-behandling blev mere forkortede haler observeret i HD6KD celler sammenlignet med kontrolceller (figur 3A, højre to paneler), hvilket antyder, at udtømning af HDAC6 sensibiliserede H292 celler til cisplatin-induceret DNA-beskadigelse. Kvantitativ analyse af den comet assay blev vist i figur 3B. Cisplatin kan også stimulere H2AX phosphorylering på serin 139 (γH2AX), hvis foci-dannelse kan anvendes til at analysere DNA-beskadigelse [37] – [39]. Vi anvendte derfor immunfluorescensfarvning at bestemme γH2AX foci-dannelse. Efter cisplatin behandling blev flere γH2AX foci identificeret i H292-HD6KD celler sammenlignet med kontrol-celler (figur 3C). Den foci i kernen blev kategoriseret i tre grupper: Foci 20, Foci = 1~20 og Foci = 0. Den procentdel af celler, der falder ind i de ovennævnte tre grupper blev kvantificeret. Som vist i figur 3D, højere procentdele af cisplatin-behandlede HD6KD celler tilhørte Foci 20 gruppe, sammenlignet med den for kontrolceller, hvilket antyder, at udtømning af HDAC6 stimuleret cisplatin-induceret DNA-beskadigelse. Tilsvarende i A549-Sup og HD6KD eller C13-PRS og HD6KD parvis flere foci 20 gruppe blev fundet i HDAC6 knockdown celler (data ikke vist). Konsekvent, viste Western blot-analyse, at niveauerne af γH2AX upon 5 eller 10 uM cisplatin behandlinger var højere i H292-HD6KD celler sammenlignet med H292-prs kontrol celler (Figur 3E). Derudover γH2AX var højere i H292 HDAC6 knockdown celler eksponeret for 5 uM cisplatin i 1, 2 og 3 dage sammenlignet med kontrolceller (Figur 3F). Lignende resultater blev også observeret i A549-kontrol og A549 HDAC6 knockdown par (figur S5). Vi næste brugte farmakologiske hæmmere såsom vorinostat (pan-HDAC-hæmmer) og tubastatin A (HDAC6-selektiv inhibitor) at validere, at undertrykkelse af HDAC6 aktivitet øger cisplatin-induceret DNA-skader i NSCLC celler. Som vist i figur 4A og 4B, co-behandling af vorinostat og cisplatin drastisk niveauerne af γH2AX i A549 eller H292 celler sammenlignet med cellerne behandlet med enten cisplatin eller vorinostat alene. De tilsvarende resultater blev også opnået i A549 og H292 celler ved anvendelse tubastatin A til erstatning vorinostat (figur 4C og 4D). Både vorinostat og tubastain A kan dramatisk øge niveauet af acetyleret tubulin, hvilket antyder, at HDAC6 aktivitet var effektivt hæmmet. Interessant apoptose blev påvist som det spaltede PARP1 i H292-celler behandlet med cisplatin og vorinostat i kombination eller cisplatin og tubastatin A i kombination, men ikke i A549-celler (Figur 4). Disse data tyder på, at H292-celler er mere følsomme over for disse lægemidler end A549-celler. HDAC6 proteinniveauer var upåvirket af lægemiddelbehandling (Figur 4). Sammen vore resultater antyder, at inhibering af HDAC6 aktivitet sensibiliserer cisplatin-induceret DNA-ødelæggelse.

A, H292-pRS eller H292-HD6KD celler blev behandlet med vehikel (0 uM cisplatin) eller cisplatin i 24 timer, derefter bestrålet med 10 Gy gammastråling til at indføre tilfældige enkeltstrengede pauser. Comet assays blev udført som beskrevet i fremgangsmåderne. B, tværbundne DNA blev scoret af High Capacity Sider Analysis System (HCSA) software (Frakker Associates, Inc.).

Kolonner, betyder fra 40 enkelte celler; barer, SE (***, P 0,001)

C, Immunofluorescens farvning af γH2AX foci i H292-PRS eller H292-HD6KD celler behandlet med køretøj (0 uM cisplatin) eller cisplatin som angivet.. D, Kvantitativ repræsentation af γH2AX foci i ovenstående celler.

Kolonner, betyder fra 600 celler.

E, blev H292-PRS, og H292-HD6KD celler behandlet med de angivne koncentrationer af cisplatin i 24 timer, og anti-γH2AX og anti-β-actin Western blotting-analyser blev derefter udført. F, De ovennævnte celler blev behandlet med vehikel eller 5 uM cisplatin for de angivne dage og anti-γH2AX og anti-β-actin Western blotting-analyser blev udført.

, blev A549-celler behandlet med vehikelkontrol , cisplatin alene, vorinostat alene eller cisplatin og vorinostat i kombination i 24 timer, derefter anti-γH2AX, anti-acetyleret tubulin, anti-PARP1, anti-HDAC6, og anti-p-actin Western blotting-analyser blev udført. B, blev H292-celler behandlet med vehikelkontrol, cisplatin alene, vorinostat alene eller cisplatin og vorinostat i kombination i 24 timer, derefter anti-γH2AX, anti-acetyleret tubulin, anti-PARP1, anti-HDAC6, og anti-β-actin Western blotting analyser blev udført. Pilehovedet angivet det spaltede PARP1 band. C, A549-celler blev behandlet med vehikelkontrol, cisplatin alene, tubastatin A alene eller cisplatin og tubastatin A i kombination i 24 timer, derefter anti-γH2AX, anti-acetyleret tubulin, anti-PARP1, anti-HDAC6 og anti-β-actin Western blotting-analyser blev udført. D, H292-celler blev behandlet med vehikelkontrol, cisplatin alene, tubastatin A alene eller cisplatin og tubastatin A i kombination i 24 timer, og anti-γH2AX, anti-acetyleret tubulin, anti-PARP1, anti-HDAC6 og anti-β-actin Western blotting-analyser blev udført. Den pilespids indikerede spaltede PARP1 bandet.

Knockdown af HDAC6 Øger Phosphorylering af DNA Damage Signaling Proteiner Upon cisplatin behandling

De store molekylære sensorer for DNA-skader omfatter ATM (ataksi telangiectasia muteret) og ATR (ataxi telangiectasia og Rad3-relateret) [40], [41]. Som svar på DNA-skade, vil disse kinaser rekruttere og aktivere andre signalproteiner, såsom Chk1 og Chk2, inducerende cellecyklusstop eller apoptose. Alle disse kinaser, kan ATM, ATR, Chk1 og Chk2 phosphorylere og aktivere p53, som fører til celler, der undergår apoptose efter DNA beskadigelse. For at bestemme om reduktion HDAC6 kunne øge DNA-beskadigelse signalering efter cisplatin behandling blev de centrale proteiner testet. H292-PRS, og H292-HD6KD celler blev behandlet med vehikel (0 uM cisplatin) eller cisplatin i 24 timer.