Abstrakt
Antracykliner (såsom doxorubicin eller daunorubicin) er blandt de mest effektive lægemidler mod cancer, men deres anvendelighed er hæmmet af risikoen for irreversibel kardiotoksicitet. Dexrazoxan (ICRF-187) er den eneste klinisk godkendt hjertebeskyttende middel mod antracyklin kardiotoksicitet. Dens aktivitet har traditionelt været tilskrevet de jern-chelaterende virkninger af dens metabolit med efterfølgende beskyttelse mod oxidativ stress. Men dexrazoxan er også en katalytisk hæmmer af topoisomerase II (TOP2). Derfor har vi undersøgt, om dexrazoxan og to andre top2 katalytiske hæmmere, nemlig sobuzoxan (MST-16) og merbaron, beskytte cardiomyocytter fra antracyklin toksicitet og vurderet deres virkninger på antracyklin antineoplastisk effekt. Dexrazoxan og to andre top2 hæmmere beskyttet isolerede neonatale rottecardiomyocytter mod toksicitet fremkaldt af både doxorubicin og daunorubicin. Men ingen af de top2 inhibitorer signifikant beskyttet cardiomyocytter i en model for hydrogenperoxid-induceret oxidativ skade. I modsætning hertil har de katalytiske hæmmere ikke kompromittere antiproliferative virkninger af antracykliner i HL-60 leukæmiske cellelinje; I stedet blev synergistiske interaktioner meste observeret. Endvidere blev antracyklininduceret caspaseaktivering forskelligt moduleres af de top2 inhibitorer i hjerte- og kræftceller. Ud fra følgende betragtninger dexrazoxan var ved hydrolyse i stand til væsentligt chelat intracellulære labile jern-ioner, blev der ikke sådan virkning kendt for enten sobuzoxan eller merbaron. Som konklusion indikerer vore data, at dexrazoxan kan beskytte cardiomyocytter
via
dens katalytiske TOP2 inhiberende aktivitet snarere end jern-chelering aktivitet. Den differentielle ekspression og /eller regulering af top2 isoformer i hjerte- og cancerceller ved katalytiske hæmmere kan være ansvarlige for den selektive modulering af antracyklin handling observeret
Henvisning:. Vávrova A, Jansova H, Mackova E, Machacek M, Haskova P, Tichotova L, et al. (2013) katalytiske hæmmere af topoisomerase II forskelligt modulerer Toksicitet af antracykliner i Hjerte og kræftceller. PLoS ONE 8 (10): e76676. doi: 10,1371 /journal.pone.0076676
Redaktør: Rajesh Mohanraj, UAE Universitet, Det Medicin Sundhedsvidenskabelige Fakultet, De Forenede Arabiske Emirater
Modtaget: 23. maj 2013; Accepteret: August 25, 2013; Udgivet: 7 okt 2013
Copyright: © 2013 Vávrova et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af den tjekkiske Science Foundation (projekt 13-15008S, www.gacr.cz), Charles University i Prag (projekt SVV 267 004, www.cuni.cz) og medfinansieres af den Europæiske Socialfond og statsbudget den Tjekkiske Republik (projekt nr CZ.1.07 /2.3.00 /30,0022;. www.msmt.cz). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Anthracyclin (ANT) antibiotika, såsom doxorubicin (DOX, figur 1), daunorubicin (DAU, figur 1) eller epirubicin, er blandt de mest effektive og hyppigt anvendte antineoplastiske midler og forbliver uundværlige komponenter i moderne kemoterapi protokoller for mange hæmatologiske maligniteter samt faste tumorer. Men risikoen for irreversibel og potentielt dødelige toksicitet for hjertevæv er den største ulempe ved ANT anvendelse i klinisk praksis [1].
Antracykliner doxorubicin (DOX) og daunorubicin (DAU) og topoisomerase II katalytiske hæmmere dexrazoxan ( DEX), sobuzoxan (SOB) og merbaron (MER) blev anvendt i denne undersøgelse.
der er blevet foreslået talrige hypoteser om mekanismerne bag både de antineoplastiske og kardiotoksiske virkninger af myrer [2]. I øjeblikket er topoisomerase II (TOP2) generelt anerkendt som den vigtigste molekylære mål for ANT antitumor handling. Myrer hører til gruppen af ”top2 giftstoffer”, som består af cytotoksiske midler, der stabiliserer “spalteligt kompleks” [3]. Med hensyn til kardiotoksicitet, jern (Fe) -catalysed intramyocardial produktion af reaktive ilt arter (ROS) har traditionelt været impliceret. C-ringen af ANT aglycon let undergår redox-cycling, og Fe-ioner kan danne redox-aktive komplekser med myrer, hvilket resulterer i dannelse af superoxid, peroxid og til sidst meget reaktive og toksiske hydroxylradikaler [4], [5].
Denne traditionelle “ROS og Fe” hypotese af ANT-induceret kardiotoksicitet er blevet forstærket af den beskyttende effektivitet af dexrazoxan (DEX, ICRF-187, figur 1), som er den eneste klinisk godkendt kardiobeskyttende. De hjertebeskyttende virkninger af DEX er blevet tilskrevet dets hydrolyseprodukt ADR-925, slående lighed med den velkendte metalchelator EDTA. Efter metabolisme af DEX i ADR-925, kan dette produkt chelatere fri og redox-aktive intracellulære Fe og /eller erstatte Fe i ANT-Fe-komplekser, hvilket forhindrer stedspecifik hydroxylradikal dannelse og oxidative skader på hjertevæv [6].
Men DEX er også en etableret katalytisk hæmmer af TOP2 [7], og derfor kan det ikke udelukkes, at DEX kan udøve beskyttende virkninger gennem interferens med ANT-induceret TOP2 forgiftning i hjertet [8], [9]. Faktisk en nylig undersøgelse rapporterede, at sletning af TOP2 beta isoform (
TOP2B
gen) beskyttede cardiomyocytter fra DNA dobbelt-streng pauser og transkriptom forandringer som følge af akut in vivo DOX behandling, med efterfølgende forebyggelse af defekte mitokondrie biogenese og ROS-dannelse. Endvidere cardiomyocyte-specifik deletion af
TOP2B
gen beskyttet mus fra udviklingen af progressiv hjerteinsufficiens induceret ved gentagen DOX behandling, hvilket antyder, at DOX-induceret kardiotoksicitet primært medieres af cardiomyocyte TOP2B [10].
spørgsmål følger af disse tidligere undersøgelser tilskyndet os til at undersøge inddragelsen af tOP2 i ANT kardiotoksicitet og vurdere andre top2 katalytiske hæmmere som potentielle cardioprotectants. I denne undersøgelse, med primære kulturer af isolerede rotte neonatal ventrikulære cardiomyocytter (NVCMs) undersøgte vi de beskyttende virkninger af DEX og to andre katalytiske hæmmere af TOP2, sobuzoxan (SOB, MST-16, figur 1) og merbaron (MER, figur 1 ), mod cardiotoksicitet induceret af DAU og DOX. Til sammenligning har vi også undersøgt virkningerne af disse midler i en model af H
2O
2-induceret oxidativ cardiomyocyte skade. Derudover blev HL-60 leukæmiske cellelinje anvendes til at vurdere, om top2 katalytiske hæmmere kan påvirke ANT kardiotoksicitet uden at kompromittere deres antiproliferative effekt mod leukæmi kræftceller.
Materialer og metoder
1. Materialer
Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), DMEM med næringsblanding F-12 (DMEM /F12), hesteserum (HS), føtalt bovint serum (FBS), penicillin /streptomycin-opløsning (5000 U /ml ; P /S) og natriumpyruvat opløsning (100 mM; PYR) blev købt hos Lonza (Belgien). Seraene blev varmeinaktiveret før anvendelse. DEX blev opnået fra Huaren kemikalier (Chang-Zhou, Kina). RPMI-1640-medium med L-glutamin og NaHCO
3, mælkesyre, nikotinamidadenindinukleotid (NAD
+), MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromid, SOB, MER, dimethylsulfoxid og 4- (2-hydroxyethyl) -1 piperazineethanesulphonic syre (HEPES) blev købt fra Sigma (Tjekkiet) og andre kemikalier (f.eks bestanddele af forskellige buffere) fra Penta (Tjekkiet) og var af højeste tilgængelige farmaceutiske eller analytisk kvalitet. dimethylsulfoxid blev anvendt til at opløse DEX, SOB og MER. plast til cellekulturen blev opnået fra TPP (Schweiz).
2. cardiomyocyte isolation og vurderinger toksicitet
Alle dyreforsøg og udarbejdelse af NVCMs blev godkendt og overvåget af Charles University Animal Care udvalg. Primære kulturer af NVCMs blev fremstillet ud fra 2 dage gamle Wistar rotter. dyrene blev bedøvet med CO
2, og halshugget. de kister blev åbnet, og hjerterne blev opsamlet i en iskold Ca
2 + -fri buffer indeholdende 116 mM NaCl, 5,3 mM KCI, 1,2 mM MgSO
4, 1,13 mM NaH
2PO
4, 5 mM glucose og 20 mM HEPES (pH 7,40). Ventriklerne blev grundigt hakket og serielt spaltet med en blanding af collagenase (0,25 mg /ml; Invitrogen, USA) og pancreatin (0,4 mg /ml; Sigma) opløsning ved 37 ° C. Cellesuspensionen blev anbragt på en stor (15 cm) petriskål (ca.. 20 hjerter pr skål) og henstod i 2 timer ved 37 ° C for at adskille de myocytter (flydende i mediet) fra fibroblaster (fastgjort til skålen). Den myocyt-rige suspension blev opsamlet og levedygtige celler blev talt under anvendelse af Trypan blå eksklusion. Proceduren Isoleringen resulterede i et konfluent cellulært monolag med -90% af cardiomyocytter slå synkront. For at vurdere cytotoksicitet, cellulær morfologi og caspaseaktivitet blev cellerne udpladet på plader med 12 brønde præ-coatet med 1% gelatine i en densitet på 0,8 millioner celler pr. Til måling glutathionindholdet blev cellerne udpladet på 60 mm petriskåle ved en tæthed på 4,8 millioner celler pr skål. NVCMs blev dyrket ved 37 ° C og 5% CO
2 i DMEM /F12 suppleret med 10% HS, 5% FBS, 4% PYR og 1% P /S. Nyligt isolerede NVCMs blev efterladt i 40 timer, blev derefter mediet ændret til DMEM /F12 suppleret med 5% FBS, 4% PYR og 1% P /S. Mediet blev udskiftet igen efter yderligere 24 timer. Alle forsøg blev startet på den fjerde dag efter isolering. Anvendelse af både serum og PYR-frit medium, blev NVCMs inkuberet ved 37 ° C med de testede midler enten alene eller i kombination. Aktiviteten af lactatdehydrogenase (LDH) frigivet fra cardiomyocytter blev bestemt i cellekultur medier som en standard markør for cytotoksicitet og cellulær fordeling under anvendelse af et veletableret spektrofotometrisk metode; i vores tidligere undersøgelser, denne metode korrelerede godt med frigivelse af hjerte-specifikke troponiner T og I [11]. Aktiviteten af LDH frigivet fra cardiomyocytter blev udtrykt som procentdelen af samlede cellulære LDH målt efter cellelyse i 15 minutter (0,1 M kaliumphosphat, 1% Triton X-100, 1 mM DTT [(-) -1,4-dithio -L-threitol], 2 mM EDTA, pH 7,8) ved stuetemperatur. Alle prøverne blev frosset straks og opbevares i -80 ° C før måling. Aktivitet af LDH blev analyseret i Tris-HCI-buffer (100 mM, pH 8,9) indeholdende 35 mM mælkesyre og 5 mM NAD
+. Satsen for NAD
+ reduktion blev overvåget spektrofotometrisk ved 340 nm i 2 min. Hældningen af den lineære region og molære absorptionskoefficient e = 6.22 * 10
3 M /cm blev anvendt til beregning af LDH aktivitet og dataene blev udtrykt som procentdel af den samlede LDH beløb.
Ændringer i cellulære morfologi blev dokumenteret ved hjælp af en Eclipse TS100 inverteret epifluorescensmikroskop (Nikon, Japan), og NIS-Elements AR 2,20 software (Laboratory Imaging, Tjekkiet). At visualisere aktive mitokondrier blev celler fyldt med 0,5 pM JC-1 (Molecular Probes /Invitrogen, USA) i 30 minutter ved 37 ° C. Ved lave koncentrationer, eksisterer JC-1 i celler i et grønt-fluorescerende monomer form og akkumuleres i aktivt respirerende mitochondrier. Der JC-1-monomerer aggregat drives af eksisterende membranpotentiale forskel (ΔΨ
m) mellem den indre og ydre mitokondriske membran. Dette ΔΨ
m-afhængige dannelse af “J-aggregater” er repræsenteret ved et slagtilfælde-skift fra grøn til rød fluorescens.
3. Spredning undersøgelser
HL-60-cellelinie, afledt af en patient med akut promyelocyt leukæmi [12], blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Celler blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS og 1% P /S i 75-cm
2 vævskulturkolber) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO
2. For proliferationsassays blev celler udpladet på plader med 96 brønde ved en densitet på 10.000 celler per brønd. De kombinationsstudier blev designet i henhold til den Chou – Talalay metoden [13]. Kort fortalt blev koncentrationerne af chelatorer inducerende 50% proliferation fald (IC
50) af alle enkeltstoffer bestemmes først. Derefter blev både de enkelte stoffer og kombination blandinger testet ved koncentrationer svarende til flere fraktioner og multipla. (1/8, 1/4, 1/2, 1, 2, 4) af deres individuelle IC
50 værdier
Cellulær proliferation blev vurderet ved anvendelse af en levedygtighed assay baseret på evnen af aktive mitochondrier at ændre gul 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazolium bromid tetrazol (MTT; Sigma) til lilla formazan ifølge producentens anvisninger Kort fortalt, 25 pi 3 mg /ml MTT-opløsning i phosphatbufret saltvand blev tilsat til dyrkningsmediet (100 pi), og efter 2 timers inkubation i 37 ° C blev cellerne lyseret med lysepuffer (isopropanol , 0,1 M HCI, 10% Triton X-100) i 30 minutter i stuetemperatur. Efter opløsning blev den optiske densitet af opløseligt MTT målt under anvendelse af et Tecan Infinite 200 M pladelæser ved λ = 570 nm, subtrahere λ = 690 nm baggrund. Spredningen satser de eksperimentelle grupper blev udtrykt i procent af de ubehandlede kontroller (100%).
4. Vurdering af caspaseaktivitet
Aktiviteterne af caspaser 3/7, 8 og 9 blev bestemt ved anvendelse af et kommercielt tilgængeligt kit (Caspase Glo assays, Promega, USA) baseret på evnen af caspaser til at spalte specifikke aminosyresekvenser til stede i et substrat for luciferase. Caspaser aktiviteter blev bestemt i forhold til proteinindholdet, som blev vurderet ved anvendelse af bicinchoninsyre fremgangsmåden ifølge fabrikantens protokol (Sigma). Lysater blev fortyndet til lige proteinkoncentrationer.
5. Bestemmelse af total og oxideret glutathion
NVCMs blev vasket med PBS (2 x 2,5 ml, 4 ° C), høstet med en celleskraber og centrifugeret (10 min ved 700 x g, 4 ° C), og pelleten blev resuspenderet i 250 pi 4 ° C koldt sulfosalicylsyre (Sigma) og derefter sonikeret på is i 10 s (Bandelin Sonoplus, Bandelin Instruments, Tyskland). Prøverne blev derefter centrifugeret i 15 minutter ved 18.000 x g, og supernatanterne blev anvendt til at bestemme mængden af reduceret og oxideret glutathion (GSH /GSSG) ifølge Tietze [14] ved brug af den enzymatiske Genbrugsmetode med 5,5′-Dithio bis (2-nitrobenzoesyre) (Sigma) og GSH reduktase (Sigma) i en mikroplade format. Hastigheden af 2-nitro-5-mercaptobenzoesyre dannelse blev registreret ved 405 nm i 2 minutter, og hældningen blev sammenlignet med den af standardkurven af oxideret glutathion (GSSG). Koncentrationen af total glutathion (GSH + GSSG) blev beregnet under anvendelse af fremgangsmåden ifølge lineær regression blev resultaterne korrigeret for proteinindhold og udtrykt i procent af den samlede glutathion i en kontrolprøve (100%). blev bestemt GSSG indhold i prøven efter derivatisering af GSH med 2-vinylpyridin (Sigma). Resultaterne blev korrigeret for proteinindholdet bestemmes spektrofotometrisk under anvendelse bicinchoninsyre fremgangsmåde ifølge fabrikantens protokol (Sigma).
6. Flowcytometri cellecyklusanalyse
Efter inkubation blev HL60-celler centrifugeret ved 300 x g, vasket i PBS med 5% FBS (PBS + FBS) og suspenderes i en lille mængde PBS + FBS. Derefter blev iskold 70% ethanol tilsat dråbevis, og cellerne blev fikseret i 3 timer ved – 20 ° C. Efter fiksering blev ethanol fjernet ved centrifugering; celler blev vasket i PBS + FBS og suspenderet i 4 mM natriumcitrat i PBS + FBS. Endelig blev cellerne inkuberet med 200 ug /ml RNAse A (Sigma) og 30 ug /ml propidiumiodid (PI) i 20 min ved 37 ° C. Celler blev analyseret under anvendelse af et Accuri C6 flowcytometer (Accuri cytometre Europe Ltd., UK) som tidligere beskrevet [15]. PI blev anslået ved 488 nm, og fluorescens blev analyseret ved 585 nm (FL-2). Pr analyse blev 10.000 begivenheder opsamlet. Cell cyklus analyse blev evalueret ved brug multicycle AV Software (Phoenix Flow Systems, USA). Tallene cellecyklus blev skabt med Cyflogic software (CyFlo Ltd, Finland).
7. Calcein-AM assay for bestemmelser af intracellulær Fe-chelaterende egenskaber
Forsøgene analyserer Fe-chelaterende intracellulære effektivitet af de undersøgte stoffer blev udført i overensstemmelse med Glickstein et al. [16] med mindre modifikationer. Den H9c2 cellelinie afledt fra embryonisk rotte hjertevæv [17] blev erhvervet fra American Type Culture Collection (USA). Celler blev dyrket i DMEM suppleret med 10% FBS, 1% P /S og 10 mM HEPES i 75 cm
2 vævskulturkolber ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO
2. Subsammenflydende celler blev subkultiveret hver 3-4 dage. H9c2 celler blev podet på plader med 96 brønde (10.000 celler pr brønd) og blev efterladt i 24 timer for at vedhæfte. Bagefter blev dyrkningsmediet erstattet med serum- og pyruvat-frit DMEM. Efter 24 timers serum deprivation blev cellerne i det væsentlige ikke-prolifererende, og blev anvendt til eksperimenter. Cellerne blev fyldt med 100 pM ferri-ammoniumcitrat (FAC) i serum-frit medium 24 timer før forsøget. Cellerne blev derefter vasket, og for at forhindre eventuelle interferenser (især med hensyn til forskellige sporstoffer) blev mediet erstattet med en buffer fremstillet ud fra Millipore-filtreret (demineraliseret) vand, der indeholder 116 mM NaCl, 5,3 mM KCI, 1 mM CaClz
2, 1,2 mM MgSO
4, 1,13 mM NaH
2PO
4, 5 mM glucose og 20 mM HEPES (pH 7,4). Celler blev derefter fyldt i 30 min ved 37 ° C med 1 uM celle-permeable acetoxymethylester af calcein grøn (Molecular Probes /KRD, Tjekkiet) og vaskes. Cellulære esteraser spalter acetoxymethyl grupper til at gøre cellemembranen-uigennemtrængelig calcein grøn, hvilket fluorescens blev standset ved FAC. Intracellulær fluorescens (λ
ex = 488 nm; λ
EM = 530 nm) blev derefter fulgt i 24 timer ved 37 ° C under anvendelse af en uendelig 200 M pladelæser (Tecan, Østrig). DEX, SOB og MER blev sammenlignet med den stærke lipofile Fe chelateringsmiddel SIH der blev anvendt som reference agent.
8. Dataanalyse
Alle data er præsenteret som gennemsnit ± SD. Data blev envejs eller tovejs ANOVA med Dunnetts post-test ved hjælp af GraphPad Prism 5,00 (GraphPad Software, Californien, USA) med p ≤ 0,05 som signifikansniveau. Alle målinger blev udført i mere end fire uafhængige forsøg. IC
50 værdier (koncentration af midler, der inducerer en 50% proliferation fald i forhold til ubehandlede kontroller) samt kombination indeksværdier (
CI
-a kvantitative mål for graden af interaktion) blev beregnet ved anvendelse CalcuSyn 2.0 software (Biosoft, Cambridge, UK)
IC
50 værdier (koncentration af agenter, der inducerer 50% spredning nedgang i forhold til ubehandlede kontroller eller medianen effekt dosis) blev beregnet som følger:.
Hvor
F
en
er påvirket (proliferation inhiberet) af et lægemiddel behandling fraktion;
F
u
er den uhæmmede fraktion;
D
x
er den dosis af et lægemiddel;
D
m
er medianen effekt dosis (IC
50) og m er hældningen af kurven. Sidstnævnte software blev også brugt til at opnå kombinationen indeks (
CI
) -a streng kvantitativ måling af graden af lægemiddelinteraktion:
Hvor
D
en
og
D
b
er doser af lægemidler, der anvendes i kombination, mens
D
xa
og
D
xb
er de isoeffective doser. Chou og Talalay beskrive lægemiddelinteraktioner i form af næsten additive virkning (
CI
0,9-1,1), let synergisme (
CI
0,85-0,90), moderat synergisme (
CI
0,7-0,85), synergisme (
CI
0,3-0,7), stærk synergisme (
CI
0,1-0,3), meget stærk synergisme (
CI
0,1) , svag antagonisme (
CI
1,1-1,2), moderat antagonisme (
CI
1,20-1,45), antagonisme (
CI
1,45-3,3), stærk antagonisme (
CI
3,3-10) eller meget stærk antagonisme (
CI
10). Endvidere at vurdere ændringerne i lægemiddelinteraktioner som en funktion af koncentration eller aktivitet, fraktioneret påvirke (
F
et
) – kombination indeks (
CI
) parceller blev beregnet ved hjælp af CalcuSyn computersimuleringer.
Resultater
1. In vitro kardiotoksicitet undersøgelser
Først blev kardiotoksiske virkninger af myrer og potentielle beskyttende indgreb vurderet ved anvendelse af en tidligere offentliggjort protokol [18] består af en 3-timers udsættelse af NVCMs til DAU eller DOX, efterfulgt af vaskninger for at fjerne myrer og myocytter inkubation i ANT-frit medium; cellulær skade blev bestemt under anvendelse af et LDH-frigivelse-assay. Som observeret i figur 2A-B, eksponeringen af isolerede cardiomyocytter til DAU eller DOX i 3 timer efterfulgt af en 48-h udvaskningsperiode førte til en statistisk signifikant tab af levedygtighed (bestemt som den procentdel af totale LDH-frigivelse) i området fra -20 % ved 0,6 uM for både myrer til ~55% ved 2,0 uM. Præ-inkubering af cellerne med 10, 100 og 1000 pM DEX i 3 timer inducerede signifikant beskyttelse fra toksiciteten af begge myrer i koncentrationer op til 1,2 um (DAU) og 1,4 pM (DOX). Denne virkning syntes ikke at være dosisafhængig, som i de fleste eksperimenter de 10 pM og 100 pM DEX koncentrationer tilbydes bedre beskyttelse end 1000 pm (Figur 2A-B). I cardiomyocytter udsat for oxidativt stress-fremkaldende middel H
2O
2, toksicitet spænder fra ~36% ved 200 uM til -50% ved 500 uM H
2O blev fundet
2. Imidlertid ingen signifikant beskyttelse mod H
2O
2-induceret toksicitet blev fundet med enhver analyserede koncentration af DEX (figur 2C). For yderligere undersøgelser, blev 1,2 uM DAU eller DOX valgt, som i denne koncentration begge myrer forårsagede signifikant toksicitet forebygges ved DEX forinkubering. Følgelig 300 uM H
2O blev valgt
2 til sammenligning, da denne koncentration forårsagede sammenlignelig toksicitet til 1,2 uM DAU eller DOX. Af de tre top2 katalytiske inhibitorer anvendt i denne undersøgelse, DEX (10 – 1000 pm) og SOB (i koncentrationer op til dets opløselighed på 300 um) ikke forårsagede signifikant tab af NVCM levedygtighed. Omvendt MER udviste signifikant toksicitet ved koncentrationer ≥60 uM (figur 3D). DEX, SOB og MER blev derefter sammenlignet for deres cardiobeskyttende potentiale ved en koncentration på 30 uM, det vil sige, den højeste koncentration, hvor ingen af lægemidlerne inducerede sin egen toksicitet. Alle tre top2 katalytiske hæmmere kunne delvist men betydeligt beskytte NVCMs mod 1,2 uM DAU eller DOX med ~ 10 – 15% reduktion toksicitet sammenlignet med DAU eller DOX toksicitet alene, men top2-hæmmere ikke havde nogen signifikant effekt på toksicitet forårsaget af 300 uM H
2O
2 (figur 3A-C).
Celler blev præinkuberet med tre koncentrationer af dexrazoxan i 3 timer og derefter co-inkuberet med stigende koncentrationer af anthracycliner daunorubicin (DAU, a) eller doxorubicin (DOX, B) i 3 timer efter en 48-h antracyklin-fri periode eller i 48 timer med H
2O
2 (C). Toksicitet blev vurderet som% af totale lactat dehydrogenase (LDH) frigivet fra cardiomyocytter i celledyrkningsmediet. Data opnået fra ≥ 4 uafhængige forsøg er udtrykt som middelværdi ± SD, statistisk signifikans: c – sammenlignet med stoffri kontrol (DMSO); d – sammenlignet med DAU eller DOX; p -. sammenlignet med H
2O
2 (envejs ANOVA med Dunnetts post-test, p ≤ 0,05)
Neonatal rottecardiomyocytter blev præ-inkuberes med dexrazoxan (DEX) , sobuzoxan (SOB) eller merbaron (MER) i 3 timer og derefter inkuberet med anthracycliner daunorubicin (DAU, a) eller doxorubicin (DOX, B) i 3 timer efter en 48-h anthracyclin-periode eller i 48 timer med hydrogenperoxid (H
2O
2, C). DEX, SOB og MER individuel toksicitet efter 48-timers inkubation er vist i panel D. Virkninger af DEX forbehandling i 3 timer med en 3-h DAU inkubation og efterfølgende 48-h DAU-fri periode på cellulær oxideret og reduceret indhold glutathion er vist i panel E. data fra ≥ 4 uafhængige forsøg er udtrykt som middelværdi ± SD, statistisk signifikans: c – sammenlignet med kontrol; d – i forhold til DAU eller DOX (envejs ANOVA med Dunnetts post-test, p ≤ 0,05)
Som observeret i figur 3E, inkubationen af NVCMs med 1,2 pM DAU i 3 timer fulgt. ved 48 h i DAU-frit medium førte ikke til en statistisk signifikant stigning i enten GSH eller GSSG, på trods af den signifikant toksicitet forårsaget af denne koncentration og inkubation tidsplan. Præ-inkubation af cardiomyocytter med 30 pM DEX i 3 timer efterfulgt af co-inkubering med DAU viste en ubetydelig tendenser stigning i GSH, men dette forekom i fraværet af ændringer af GSSG. Styringen inkubation med DEX alene inducerede ikke nogen signifikant forskel fra kontrolværdier for enten GSH eller GSSG (figur 3E).
En tre-timers eksponering af NVCMs til 1,2 uM DAU eller DOX forårsaget markante ændringer i cardiomyocyte morfologi , herunder cytoplasmatisk vakuolisering og granulering, der fortsatte ind i afbrydelse af det cellulære monolag og cellulære og nuklear svind. Cardiomyocytter blev farvet med JC-1-proben, og signalet blev visualiseret ved fluorescensmikroskopi. Efter udsættelse for DAU eller DOX, var der en iøjnefaldende overgang af normale røde-farvede mitokondrier med polariserede indre membraner til at sprede grøn fluorescens indikerer døende celler med depolariseret mitokondrier. Præ-inkubation med 30 pM DEX, SOB og, i mindre grad, MER, delvist forhindret både ANT-inducerede ændringer i cellemorfologi samt spredning af den mitokondriske indre membran potentiale (fig S1).
2. Spredning undersøgelser
Efter inkubation i 72-h, alle stoffer undersøgte havde betydelig og dosisafhængig antiproliferative virkninger på HL-60 celler. Myrerne (DAU og DOX) var effektive ved koncentrationer, der var tre størrelsesordener lavere end de katalytiske hæmmere; IC
50 værdier for alle stoffer var som følger: 19 nM for DAU, 38 nM for DOX, 25 uM for DEX, 48 uM for SOB og 38 uM for MER. Enkelte agenter og kombinationer af myrer og top2 katalytiske hæmmere blev derefter inkuberet i 72 timer ved koncentrationer, der svarer til deres IC
50-værdier, og deres samspil blev analyseret i henhold til Chou-Talalay-metoden. Derudover, som lægemiddelinteraktioner kan ændre sig som funktion af koncentration eller aktivitet, vi undersøgte også kombinationer af chelatorer og anticancer narkotika på fraktioner og multipla (1/8, 1/4, 1/2, 1, 2, 4) af deres IC
50-værdier, og Fraktion påvirket (
Fa
) – kombination indeks (
CI
) parceller blev beregnet ved hjælp af computersimuleringer (figur 4). Spredning data er vist i panel A og B i figurer S2-S4 og kombinationsindeks (
CI Salg) beregnede værdier er opsummeret i tabel S1-S3. Disse analyser viste, at DEX, SOB og MER forstærkes de antiproliferative virkninger af både DAU og DOX, når disse stoffer blev co-inkuberet samtidigt, som det tilsvarende
CI
værdier varierede fra moderat til stærk synergisme.
Celler blev inkuberet enten kontinuert med dexrazoxan (DEX, A), sobuzoxan (SOB, B) eller merbaron (MER, C) og daunorubicin (DAU) eller doxorubicin (DOX) i 72 timer eller præ-inkuberet med DEX (A), SOB (B) eller MER (C) i 3 timer eller 6 timer og derefter inkuberet i 72 timer med alle lægemidler i koncentrationer svarende til deres IC
50 værdier og IC
50 fraktioner og multipler (1/8; 1 /4, 1/2, 1, 2, 4). Alternativt blev celler enten co-inkuberet i 72 timer eller præinkuberet med DEX i 3 timer og derefter co-inkuberet med DAU i 72 timer ved et forhold på 1:20 DAU: DEX (A). Computersimuleringer af kombinationsindeks (
CI
) – celleproliferation (fraktion påvirket –
Fa
). Afhængigheder blev opnået ved hjælp CalcuSyn 2.0 software
I en anden serie af eksperimenter, DEX, SOB og MER blev præ-inkuberet i 3 eller 6 timer inden tilsætningen af DAU med en efterfølgende 72-h co-behandling (paneler C og D i figur S2-S4, tabel S1-S3). Som observeret i disse tal og tabeller, disse lægemiddelkombinationer forblev synergistisk med undtagelse af kombinationer af DAU med DEX på sit højeste koncentration; i dette tilfælde
CI
værdier var additiv eller i et sjældent tilfælde moderat antagonistisk. Derudover bortset fra standard Chou-Talalay kombination forsøgsdesign (hvor midlerne anvendes ved ækvipotente doser), DAU og DEX blev også undersøgt ved hjælp af den faste 01:20 koncentrationsforhold anvendes i klinisk praksis [19]. Mens snarere mindre udtalt synergisme blev påvist for lavere koncentrationer, her, ingen antagonisme forekom, selv efter præinkubering med DEX i 3 timer, og i denne indstilling, alle koncentrationer af DEX potenseret den antiproliferative aktivitet af DAU dybt HL-60-celler (figur S2E- F, tabel S1).
3. Caspase aktivitetsassays
Kombinationer af myrer og top2 katalytiske hæmmere blev også undersøgt for deres evne til at aktivere caspaser, som er vigtige mediatorer af apoptose. Inkubation af NVCMs med 1,2 pM DAU i 3 timer efterfulgt af 48 timer af DAU-fri periode forårsagede betydelig aktivering af caspaser 8 og 9, som er nøglen extrinsic (receptormedieret) og iboende (mitochondrial) apoptosecyklus initiatorer som henholdsvis samt udførelse Caspaser 3/7 til -200% af kontrolværdier. Inkubation med 30 uM koncentrationer af alle tre top2 katalytiske hæmmere forårsagede ikke nogen væsentlig stigning i aktiviteten af enhver caspase, men DEX og SOB væsentligt beskyttede cardiomyocytter mod caspaseaktivering af DAU. Selvom MER forbehandling viste også en tendens mod reduceret aktivering af alle caspaser, dette ikke statistisk signifikans i forhold til DAU gruppen. I overensstemmelse med resultaterne af LDH-lækage assay aktiveringen af caspaser efter inkubering med DOX var generelt mindre udtalt end efter DAU inkubation. Aktiveringen af initiering caspaser var ubetydelige sammenlignet med kontrolgruppen (figur 5E-F), selv om der var en lille stigning. Samlet set inkubation af cellerne med DEX, SOB eller MER ikke signifikant ændre indledning caspase aktivering, på trods af tendensen til lavere aktivitet. Imidlertid blev aktiviteten af den udøvende caspase 3/7 steget markant efter DOX behandling, mens top2 katalytiske hæmmere effektivt forhindret denne ændring (figur 5D)
Neonatal rottecardiomyocytter (A – F). Blev præ-inkuberet med 30 pM dexrazoxan (DEX), sobuzoxan (SOB) og merbaron (MER) i 3 timer og derefter co-inkuberet med 1,2 uM daunorubicin (DAU, A – C) eller doxorubicin (DOX; D – F) i 3 timer, efterfulgt af en antracyklin-fri 48-timers periode.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.