PLoS ONE: Customized Behandling i ikke-småcellet lungekræft Baseret på EGFR mutationer og BRCA1 mRNA Expression

Abstrakt

Baggrund

Median overlevelse er 10 måneder og 2-års overlevelse er 20 % i metastatisk ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) behandlet med platinbaseret kemoterapi. En lille del af ikke-skællede celle lungekræft havnen EGFR mutationer, med forbedret resultat gefitinib og erlotinib. Eksperimentel tyder på, at BRCA1 overekspression øger følsomheden over for docetaxel og modstandsdygtighed over for cisplatin. RAP80 og Abraxas interagerer proteiner, der danner komplekser med BRCA1 og kunne modulere effekten af ​​BRCA1. For yderligere at undersøge effekten af ​​EGFR-mutationer og BRCA1 mRNA-niveauer på resultatet i avanceret NSCLC, vi udførte en prospektivt ikke-randomiseret fase II klinisk forsøg, teste hypotesen om, at tilpassede terapi ville give forbedret resultat i forhold til ikke-tilpassede terapi. I en eksplorativ analyse, vi også undersøgt effekten af ​​RAP80 og Abraxas mRNA niveauer.

Metodologi /vigtigste resultater

Vi behandlede 123 metastatisk ikke-skællede celle lunge carcinoma patienter ved hjælp af en skræddersyet tilgang. RNA og DNA blev isoleret fra Mikrodissekterede prøver fra paraffinindlejret tumorvæv. Patienter med EGFR-mutationer modtaget erlotinib, og dem uden EGFR-mutationer modtog kemoterapi med eller uden cisplatin baseret på deres BRCA1 mRNA-niveauer: lav, cisplatin plus gemcitabin; mellemliggende, cisplatin plus docetaxel; høj, docetaxel alene. En eksplorativ analyse undersøgte RAP80 og Abraxas udtryk. Median overlevelse oversteg 28 måneder for 12 patienter med EGFR-mutationer, og var 11 måneder i 38 patienter med lav BRCA1, 9 måneder for 40 patienter med mellemliggende BRCA1 og 11 måneder for 33 patienter med forhøjet BRCA1. To års overlevelse var 73,3%, 41,2%, 15,6% og 0%, hhv. Median overlevelse blev påvirket af RAP80 udtryk i de tre BRCA1 grupper. For eksempel, for patienter med både lav BRCA1 og lav RAP80, median overlevelse oversteg 26 måneder. RAP80 var en væsentlig faktor for overlevelse hos patienter, behandlet i overensstemmelse med BRCA1 niveauer (hazard ratio, 1,3 [95% CI, 1-1,7]; P = 0,05).

Konklusioner /Betydning

Kemoterapi tilpasses i henhold til BRCA1 ekspressionsniveauer forbundet med fremragende median og 2-års overlevelse for nogle undergrupper af NSCLC patienter, og RAP80 kunne spille en afgørende modulerende effekt på denne model af tilpassede kemoterapi.

prøve registrering

ClinicalTrials.gov NCT00883480

Henvisning: Rosell R, Perez-Roca L, Sanchez JJ, Cobo M, Moran T, Chaib I, et al. (2009) Customized Behandling i ikke-småcellet lungekræft Baseret på EGFR mutationer og BRCA1 mRNA ekspression. PLoS ONE 4 (5): e5133. doi: 10,1371 /journal.pone.0005133

Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, USA

Modtaget: December 1, 2008; Accepteret: 3 Mar 2009; Udgivet: 5 maj 2009

Copyright: © 2009 Rosell et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse modtaget delvis støtte fra Redes de Kræft, Spanien (tilskud RD06 /0020/0056). Den finansieringskilde var ikke involveret i indsamling, analyse eller fortolkning af dataene, skrivning af rapporten, eller beslutningen om at indsende til offentliggørelse

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Den mediane overlevelse af patienter med fremskreden eller metastatisk ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er kun 10-11 måneder med enten standard cisplatin kemoterapi [1], [ ,,,0],2] eller tilpasset cisplatin kemoterapi baseret på excision reparation tværs supplere en (ERCC1) mRNA-ekspression, [3] og de to-års overlevelse er kun 14-21%. [1], [2], [3]

De to proto-onkogener øjeblikket vides at være mere almindeligt muteret i lunge adenocarcinom er K-RAS og EGFR [4]. Lungekræft forårsaget af aktiverende mutationer i epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) – primært enten sletning ved exon 19 eller L858R mutation ved exon 21 – reagere på små molekyler tyrosinkinasehæmmere (gefitinib og erlotinib), [5], [6], [7] med en nylig rapporteret median overlevelse til gefitinib på 17,5 måneder. [8] Responsrate var 90% i vores retrospektive forsøg undersøger EGFR-mutationer hos patienter behandlet med gefitinib, [9] og samlede data fra prospektive forsøg med gefitinib hos patienter med EGFR mutationer viste en svarprocent på 80%. [10] Men ingen EGFR mutationer blev fundet i 454 patienter med planocellulært karcinom i lungen. [11]

en voksende mængde af beviser tyder på, at brystkræft modtagelighed gen 1 (BRCA1) bibringer følsomhed over for apoptose induceret af antimikrotubulusmidler lægemidler (paclitaxel og vincristin) men inducerer resistens over for DNA-beskadigende midler (cisplatin og etoposid) og strålebehandling. [12], [13], [14], [15] disse prækliniske resultater understøttes af en række eksperimentelle modeller i bryst- og ovariecancerceller: inducerbar ekspression af BRCA1 forbedret paclitaxel følsomhed, [16] en lille interfererende RNA-medieret inaktivering af endogen BRCA1 førte til paclitaxel og docetaxel resistens [17 ], [18], [19] og rekonstitution af BRCA1-deficiente celler med vildtype BRCA1 forøget følsomhed over for paclitaxel og vinorelbin. [17] Denne differentielle modulerende effekt af BRCA1 mRNA-ekspression blev også observeret i tumorceller isoleret fra maligne effusioner af NSCLC og gastrisk kræftpatienter, hvor BRCA1 mRNA-niveauer korrelerede negativt med cisplatin følsomhed og positivt med docetaxel følsomhed [20] To retrospektive studier -. i NSCLC [21] og ovariecancer [19] patienter – fandt, at lave eller mellemliggende BRCA1 mRNA-niveauer korreleret med en signifikant længere overlevelse efter platinbaseret kemoterapi, [19], [21] mens overlevelse hos patienter med højere BRCA1 udtryk øget efter taxan kemoterapi. [19]

BRCA1 er rekrutteret til de steder, hvor DNA pauser, spiller en central rolle i DNA-reparation og cellecyklus-checkpoint-kontrol. Binding af mediator af DNA beskadigelse checkpoint 1 (MDC1) proteinet til phosphorylerede hale af histon H2AX letter dannelsen af ​​BRCA1 nukleare foci på dobbelt-strenget pauser. [22] receptor-associeret protein 80 (RAP80) virker opstrøms for BRCA1 og er påkrævet for akkumuleringen af ​​BRCA1 til steder med DNA-brud. [23], [24], [25] Abraxas rekrutterer RAP80 at danne et kompleks med BRCA1. Både Abraxas og RAP80 er nødvendige for DNA-skader reparation og celler udtømt for Abraxas eller RAP80 udviser overfølsomhed over for bestråling. [23]

For at undersøge, om tilpasning behandling kunne forbedre resultatet i avanceret NSCLC patienter, vi har udført et prospektivt ikke-randomiseret fase II studie af tilpassede behandling baseret på EGFR mutation status og BRCA1 mRNA ekspressionsniveauerne. Vi har valgt at begrænse tilmelding til ikke-pladecellecarcinom for at maksimere muligheden for at administrere erlotinib hos patienter med EGFR-mutationer. Patienter med enten exon 19 sletning eller L858R mutation modtaget erlotinib, mens dem med vildtype EGFR fået kemoterapi baseret på BRCA1 niveauer: dem med lave niveauer modtog cisplatin plus gemcitabin; dem med mellemliggende niveauer modtog cisplatin plus docetaxel; og dem med høje niveauer modtog docetaxel alene. I en eksplorativ analyse undersøgte vi også effekten af ​​RAP80 og Abraxas mRNA-niveauer hos disse patienter.

Resultater

Patienter

Mellem marts 2005, og juli 2007 i alt 123 patienter fra 25 centre blev inkluderet i undersøgelsen (figur 1). Tredive-fem patienter blev ekskluderet: 3 patienter havde ingen tumorceller i biopsi; 5 patienter havde mindre end 50 tumorceller i biopsi, hvilket gør det umuligt at sikre korrekte resultater; 19 patienter var vildtype EGFR, men med utilstrækkelig tumor prøve efter EGFR vurdering af BRCA1 udtryk analyse; 2 patienter nægtede at deltage; og 6 patienter blev trukket tilbage af deres læge på grund af kliniske faktorer end undersøgelsen. For alle 123 patienter, RNA-isolering og PCR-amplifikation var vellykket. I gennemsnit resultater af genetiske analyser var tilgængelige i 8 dage (i intervallet 6-11 dage). Den mediane antal cyklusser af kemoterapi administreres i BRCA1 grupper var 5 (interval, 1.8). Median opfølgning var 8 måneder (i intervallet 1-28 måneder). Tolv patienter havde EGFR-mutationer og blev tildelt til at modtage erlotinib (EGFR gruppe). Af de 111 patienter med vildtype-EGFR, 38 var i laveste tercile af BRCA1 udtryk og blev tildelt til at modtage cisplatin plus gemcitabin (lav BRCA1 gruppe), 40 var i den mellemliggende tercile og blev tildelt til at modtage cisplatin plus docetaxel (mellemliggende BRCA1 gruppe), og 33 var i den højeste tercile og blev tildelt til at modtage docetaxel alene (høj BRCA1 gruppe) (Figur 1).

Mellem marts 2005, og juli 2007 i alt 123 patienter fra 25 centre blev inkluderet i undersøgelsen. Grunde til patient tilbagetrækning: 3 patienter havde ingen tumorceller i biopsi; 5 patienter havde mindre end 50 tumorceller i biopsi, hvilket gør det umuligt at sikre korrekte resultater; 19 patienter var vildtype EGFR, men med utilstrækkelig tumor prøve efter EGFR vurdering af BRCA1 udtryk analyse; 2 patienter nægtede at deltage; og 6 patienter blev trukket tilbage af deres læge på grund af kliniske faktorer end undersøgelsen. De to patienter i EGFR gruppe, der ikke kunne evalueres for respons døde inden for en måned at komme ind på studiet; de 13 patienter i BRCA1, der ikke kunne evalueres for respons modtaget . 3 cyklusser af behandlingen

De kliniske karakteristika for de fire grupper er vist i tabel 1 og tabel S1. Median alder for alle patienter var 60 år. Forholdsmæssigt flere kvinder end mænd var i laveste tercile af BRCA1 udtryk. EGFR-mutationer blev observeret hyppigere i aldrig-rygere (P = 0,03) og kvinder (p = 0,0001). Fifty-fem procent af patienterne havde en performance status på 1, og 83% havde stadie IV sygdom. Sytten procent af patienterne havde hjernemetastaser. Patienter med EGFR-mutationer havde en median på to metastatiske steder, i forhold til et site med patienter med vildtype-EGFR (tabel S2).

Den samlede responsrate var 90% for EGFR-gruppen, 25 % for den lave BRCA1 gruppen, 45,7% for den mellemliggende BRCA1 gruppen og 41,9% for den høje BRCA1 gruppen (tabel 2). I intent-to-treat analyse, var responsraten 75% for EGFR-gruppen, 21,1% for den lave BRCA1 gruppen, 40% for den mellemliggende BRCA1 gruppen og 39,4% for den høje BRCA1 gruppen (tabel 2).

Median overlevelse blev ikke nået, men oversteg 28 måneder for EGFR-gruppen, sammenlignet med 10 måneder (95% CI, 8,5 til 15-5) for patienter i alle tre BRCA1 grupper. To års overlevelse for patienter i EGFR-gruppen var 73,3% og for alle patienter i BRCA1 grupperne var det 26,7%. For patienter i den lave BRCA1 gruppen, median overlevelse var 11 måneder (95% CI, 1,1-20,9) og 2-årige overlevelse var 41,2%. For dem i den mellemliggende BRCA1 gruppen, mediane overlevelse var 9 måneder (95% CI, 5,4-12,6) og 2-årige overlevelse var 15,6%. For patienter i den høje BRCA1 gruppen, median overlevelse var 11 måneder (95% CI, 8,2-13,8) og 2-års overlevelse var 0% (tabel 2, figur 2).

Median overlevelse blev ikke nået i 12 patienter i EGFR-gruppen, 11 måneder for 38 patienter i den lave BRCA1 gruppen, 9 måneder for 40 patienter i den mellemliggende BRCA1-gruppen og 11 måneder for 33 patienter i den høje BRCA1 (P = 0,01) (se tabel 2) .

Median tid til progression var 13 måneder (95% CI, 7,7-18,3) i EGFR-gruppen i forhold til 6 måneder (95% CI, 4,7 til 7.2) for patienter i alle tre BRCA1 grupper. For patienter i de lave og intermediære BRCA1 grupper, tid til progression var 5 måneder (95% CI, 2,7 til 7.3). For patienter i den høje BRCA1 gruppen, tid til progression var 8 måneder (95% CI, 5,1-10,9) (tabel 2, figur S1).

RAP80 og Abraxas mRNA-transkripter

Baseret på resultaterne af eksperimentelle modeller [23], [24], [25], en eksplorativ analyse af forholdet mellem BRCA1 blev RAP 80 og Abraxas mRNA-ekspression udført i 86 af 111 patienter uden EGFR-mutationer, for hvem tilstrækkelig tumorvæv var tilgængelig. Patient karakteristika for disse 86 patienter var lig dem af alle 111 patienter; betydeligt flere kvinder end mænd havde lav BRCA1 udtryk (P = 0,009). Svar var signifikant højere hos patienter med mellem- og høje BRCA1 niveauer (P = 0,004). (Tabel S3). En tæt korrelation blev fundet mellem BRCA1 og RAP 80 niveauer (ρ = 0,27; P = 0,02) og mellem RAP 80 og Abraxas niveauer (ρ = 0,41; P 0,001), men ikke mellem BRCA1 og Abraxas niveauer (ρ = 0,10; P = 0,39).

Median overlevelse var påvirket af RAP 80 niveauer. Hos patienter med lavt BRCA1 niveauer, var median overlevelse er ikke nået i patienter med lave RAP 80 niveauer, mens det var 8 måneder for patienter med mellemliggende RAP 80 og 7 måneder for dem med høj RAP 80 (tabel 3, figur 3). Hos patienter med mellemliggende BRCA1 niveauer, median overlevelse var 5 måneder hos patienter med lav RAP 80 niveauer, mens det var 13 måneder for patienter med mellemliggende RAP 80 niveauer og 16 måneder for personer med stort RAP 80 niveauer. Hos patienter med høj BRCA1 niveauer, median overlevelse var 6 måneder hos patienter med lav RAP 80 niveauer, 12 måneder hos patienter med mellemliggende RAP80 niveauer, og 11 måneder for personer med stort RAP 80 niveauer (tabel 3).

median overlevelse blev ikke nået i 11 patienter med lav RAP 80 niveauer, 8 måneder for 9 patienter med mellemliggende RAP 80 niveauer og 7 måneder for 5 patienter med høj RAP 80 niveauer (P = 0,006).

Hos patienter med lavt BRCA1 niveauer, tid til progression var 14 måneder hos patienter med lav RAP 80 niveauer, mens det var 4 måneder for patienter med mellemliggende RAP80 niveauer og 6 måneder for personer med stort RAP 80 niveauer (tabel 4, Figur S2). Hos patienter med mellemliggende BRCA1 niveauer, tid til progression var 4 måneder hos patienter med lave RAP 80 niveauer, mens det var 9 måneder for patienter med mellemliggende RAP 80 niveauer og 6 måneder for personer med stort RAP 80 niveauer. Hos patienter med høj BRCA1 niveauer, tid til progression var 2 måneder hos patienter med lav RAP 80 niveauer, 10 måneder hos patienter med mellemliggende RAP 80 niveauer, og 4 måneder for personer med stort RAP 80 niveauer (tabel 4).

Lignende resultater blev opnået, når median overlevelse og tid til progression blev sammenlignet i henhold til Abraxas mRNA-ekspressionsniveauer (tabel S4 og S5). En eksplorativ multivariat analyse i de 86 patienter, med brug af en Cox proportionel-farer model, identificeret ECOG performance status og RAP 80 så signifikante variabler for overlevelse (hazard ratio: performance status 1, 2,72; P = 0,005; RAP 80, 1.3 ; P = 0,05) (tabel S6). Overlevelse blev ikke påvirket af andre kliniske karakteristika, typer af metastaser, second-line kemoterapi (36 patienter), eller Abraxas niveauer. Cox model for tid til progression viste også, at kun performance status og RAP 80 var signifikante variabler (tabel S7).

Discussion

Mutationer i EGFR tyrosinkinasedomæne inducere lungeadenokarcinom i mus [ ,,,0],26] og et gunstigt svar på første og anden linie gefitinib og erlotinib i avanceret NSCLC. [7], [8] i den foreliggende undersøgelse, median overlevelse oversteg 28 måneder i 12 patienter med EGFR-mutationer behandlet med erlotinib, med en median tid til progression på 13 måneder og en overlevelse på 73,3% toårig; disse resultater svarer til resultaterne af en meta-analyse af prospektive forsøg med gefitinib hos patienter med EGFR-mutationer. [10] Median overlevelse var 11 måneder hos patienter med den laveste BRCA1 udtryk, behandlet med cisplatin plus gemcitabin, og to-års overlevelse var 41,2%, hvilket tåler sammenligning med median og to-års overlevelse opnås med gemcitabin plus cisplatin eller pemetrexed plus cisplatin (10,3 måneder og 22%) i en nylig randomiseret forsøg. [2] Hos patienter med den højeste BRCA1 udtryk, behandlet med docetaxel alene, median overlevelse var 11 måneder, er identisk med den, der opnås i et stort fase III forsøg i patienter behandlet med docetaxel plus cisplatin. [1] Men i vores undersøgelse, har ingen patienter var i live på to år, mens der i fase III-forsøg , to-års overlevelse var 21% [1] Interessant, 11 patienter med den laveste udtryk for både BRCA1 og RAP 80 havde et resultat svarende til den, opnås ved patienter med EGFR-mutationer behandlet med erlotinib:. median overlevelse blev ikke nået, og tid til progression var 14 måneder (tabel 3, figur 3) .Chemotherapy respons er solidt baseret på det faktum at DNA reparation gener kræver en række trin molekylær genkendelse, der muliggør DNA beskadigelse respons proteiner til at lokalisere ved og nær DNA-læsioner. Binding af mediator af DNA beskadigelse checkpoint 1 (MDC1) proteinet til phosphorylerede halen af ​​histon H2AX (γH2AX) letter dannelsen af ​​BRCA1 nukleare foci på dobbelt-strenget pauser induceret af bestråling eller kemoterapi. Ved dimerisering med BRCA1-associeret RING domænet (BARD1) protein gennem ringen domæne, BRCA1 danner en E3 ubiquitin-ligase. For nylig er det blevet vist, at RAP 80 mål BRCA1-BARD1 E3 ligase til MDC1-γH2AX-afhængige lysin 63-bundne ubiquitin-proteiner ved dobbelt-strenget pauser (gennemgået i Wang Elledge [27]). Tre studier viste, at ophævelsen af ​​RAP 80 reducerede dannelsen af ​​BRCA1-induceret foci til 28% [23], 2% [24] og 0%. [25] Desuden Abraxas og RAP 80 foci dannelse er BRCA1-uafhængig. [ ,,,0],23] Vores hypotese derfor, at hvis RAP 80 var forhøjet, kan det forårsage resistens over for cisplatin kemoterapi selv i nærvær af lave BRCA1 niveauer. Den sonderende vurdering af RAP 80 i den foreliggende undersøgelse bekræfter sin modulerende effekt på BRCA1 tilpassede model. For eksempel, median overlevelse hos patienter med den laveste BRCA1 udtryk faldt som RAP 80 udtryk steget: 8 måneder med mellemliggende RAP 80 niveauer og 7 måneder med høj RAP 80 niveauer (tabel 3). Overekspression af BRCA1 giver følsomhed over for docetaxel og paclitaxel, [12], [17], [19], [20] patienter med de højeste niveauer af BRCA1, behandlet med docetaxel, havde en median overlevelse på 11-12 måneder, når RAP80 udtryk var også høj, men kun 6 måneder, når RAP 80 udtryk var lav (tabel 3). Patienter med mellemliggende BRCA1 niveauer, behandlet med cisplatin plus docetaxel, havde en samlet median overlevelse på 9 måneder, som steg til 13-16 måneder, når RAP 80 niveauer var mellemliggende eller høj (tabel 3). Disse resultater kan forklares ved prækliniske fund, at RAP 80 er i stand til at translokere til bestråling-induceret foci i HCC1937 celler, der udtrykker en trunkeret BRCA1, der er i stand til at migrere til nuklear foci. [28] Dette indikerer, at RAP 80 kunne erstatte BRCA1 DNA-reparation funktion i celler, der mangler BRCA1. Selv om forskellige platin dubletter viser den samme [29] – eller lidt anderledes [2] – overlevelse generelt forskelle kunne findes, når tilpasse kemoterapi baseret på en model af BRCA1 og RAP 80.

I den foreliggende undersøgelse , ingen korrelation blev fundet mellem BRCA1 og Abraxas mRNA-ekspression. Der var imidlertid tegn på, at ekspressionsniveauer af Abraxas modulere effekten af ​​BRCA1. For eksempel patienter med den laveste BRCA1 ekspression, behandlet med cisplatin plus gemcitabin, opnået en median overlevelse på 18 måneder og tid til progression af 11 måneder, når Abraxas var lavt (tabel S4).

Ud over den potentiel prædiktiv rolle BRCA1, BRCA1 overekspression giver aggressiv adfærd i transgene modeller af småcellet og pladecelle lungecarcinomer samt i en undergruppe af lunge-adenocarcinomer huser den iboende T /t-antigen-cancer signatur. [30] dårlig prognose har også været forbundet med BRCA1 overekspression i begyndelsen NSCLC. [31] i den foreliggende undersøgelse, to-års overlevelse var 41% hos patienter med de laveste niveauer af BRCA1, 16% hos dem med mellemliggende niveauer og 0% i dem med de højeste niveauer.

mekanismerne i BRCA1 overekspression eller nedregulering i NSCLC mangler at blive afklaret. Men det har for nylig vist, at DNA bryder hurtigt aktivere heterochromatin protein 1-β (HP1-β), som fremmer histon H2AX phosphorylering, indledning af BRCA1 lyssignaludstyr for DNA-reparation. [32] Interessant caseinkinase 2 fremmer mobiliseringen af HP1-β og er associeret med dårlig prognose i NSCLC. [33] Mens der observeres BRCA1 methylering i duktal brystkræft, er den kun findes i 4% af NSCLCs. [34] Low BRCA1 ekspression i tumorer kan skyldes tabet af histon methyltransferaser, hvilket fører til nedsat kromatin H3-methylering i lysin 9, med den deraf følgende nedregulering af HP1-β. [35]

i denne fase II, ikke-randomiseret undersøgelse, den genetiske faktor og behandling forskel er fuldstændig co-eksisterende, og der bør udvises forsigtighed ved fortolkning af resultaterne. den sonderende analyse viser dog, at der er nogle beviser for at skræddersy kemoterapi baseret på BRCA1 og RAP 80 niveauer. Desuden er der i en nylig undersøgelse af 96 stadie IV NSCLC patienter behandlet med docetaxel plus gemcitabin, observerede vi, at som BRCA1 mRNA-niveauer steg, sandsynligheden for respons øges og risikoen for progression faldt. For patienter med de højeste BRCA1 niveauer, var responsraten 58,6% mod 13,8% for dem med mellemliggende niveauer og 27,6% for dem med de laveste niveauer. [36] Baseret på disse resultater og omstændighederne i den foreliggende undersøgelse, den spanske Lung Cancer Group nu modificere protokollen for en planlagt international fase III forsøg i avanceret NSCLC at omfatte tilpasning baseret på RAP 80 samt BRCA1 mRNA-ekspression. Patienterne i kontrolgruppen modtager cisplatin plus docetaxel og dem i den eksperimentelle arm vil modtage kemoterapi baseret på RAP 80 og BRCA1 mRNA niveauer: lav RAP 80 niveauer (uanset BRCA1 niveauer), cisplatin plus gemcitabin; mellemliggende eller høj RAP 80 og lav eller mellemliggende BRCA1, cisplatin plus docetaxel; mellemliggende eller høj RAP 80 og høj BRCA1, docetaxel alene

Materialer og metoder

Protokollen for dette forsøg er tilgængelig som underbyggende oplysninger.; se protokollen S1 og protokol S2.

Etik erklæring

Protokollen blev godkendt af hvert center institutionelle etik review board, og alle patienter forudsat skriftligt informeret samtykke før indskrivning.

Patienter

Vi rekrutterede patienter til denne fase II prospektive multicenter studie baseret på screening af EGFR-mutationer efterfulgt af BRCA1 mRNA-ekspression analyse paraffinindlejret tumorvæv. Klinisk berettigelse inkluderet stadie IIIB med pleural effusion eller stadie IV NSCLC, målbar sygdom ved respons evalueringskriterier i solide tumorer (RECIST), performance status 0-2 af Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) kriterier, tilstrækkelig hæmatologiske, nyre- og leverfunktion. Hjernemetastaser var tilladt. Patienter med planocellulære tumorer, tidligere systemisk behandling for fremskreden NSCLC eller andre klinisk signifikante kræftformer inden for fem år var ikke berettiget

Patienter med EGFR-mutationer -. Enten exon 19 deletion eller L858R mutation – fik 150 mg daglig oral erlotinib kontinuerligt indtil progression eller uacceptable bivirkninger. Hver cyklus var 28 dage. Patienter med vild type EGFR modtaget tilpassede kemoterapi baseret på BRCA1 mRNA-niveauer. Patienterne i laveste tercile af BRCA1 udtryk fik cisplatin 75 mg /m

2 på dag 1 plus gemcitabin 1250 mg /m

2 på dag 1 og 8. Patienter i den mellemliggende tercile modtog cisplatin 75 mg /m

2 på dag 1 plus docetaxel 75 mg /m

2 på dag 1. Patienter i den højeste tercile fik docetaxel 75 mg /m

2 på dag 1. Alle kemoterapi blev gentaget hver tredje uge i maksimalt seks cykler, medmindre der var tidligere tegn på sygdomsprogression eller uacceptable bivirkninger.

Baseline vurdering omfattede en sygehistorie, fysisk undersøgelse og tumor målinger af håndgribelige læsioner samt læsioner vurderet af computertomografi scanninger. Vurderingen baseline metode blev gentaget hver anden cyklus, og derefter hver sjette uge indtil sygdomsprogression.

Molekylær analyser

Tumor væv indsamling og laser capture mikrodissektion.

BRCA1, RAP80 og Abraxas genekspression og EGFR-mutationer blev analyseret i RNA og DNA isoleret fra paraffinindlejrede tumorvæv. For hver tumor prøve en hæmatoxylin /eosin farvet skive blev analyseret ved vores patolog at vælge tumoren området. To 5-micron skiver blev monteret på specielle slides (PEM-Membrane dias, Palm, Oberlensheim, Tyskland) til laser capture mikrodissektion (CAPmover Microdissector, Carl Zeiss Microimaging, Barcelona, ​​Spanien) for at sikre et minimum af 90% af tumorcellerne. Et objektglas blev anvendt til RNA-isolering og den anden blev anvendt til DNA-isolering.

geners aktivitet.

Genekspression analyse blev udført i RNA isoleret fra de tumor vævsprøver. cDNA blev syntetiseret under anvendelse af M-MLV retrotranscriptase enzym. Template cDNA sattes til Taqman Universal Master Mix (AB, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) med specifikke primere og probe for hvert gen (tabel S8). De primer og probe sæt blev designet ved hjælp Primer Express 2.0 Software (AB) og RefSeq sekvenser (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene). Kvantificering af genekspression blev udført under anvendelse af ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (AB).

EGFR mutation analyse.

Til isolering af DNA fra mikrodissekeret væv blev materialet inkuberet med proteinase K og DNA blev ekstraheret med phenol-chloroform og ethanol udfældning. Primere til PCR-amplifikation i nestede reaktioner til exonerne 19 og 21 af EGFR er vist i den understøttende information. Mutationer blev analyseret ved hjælp af to metoder:. DNA-sekventering og længde analyse af fluorescensmærket PCR-produkter for EGFR deletioner i exon 19 og sekventering og 5′-nukleaseaktivitet assay (TaqMan) for EGFR mutation i exon 21 (L858R)

(for yderligere oplysninger om de molekylære analyser, se tekst S1).

Statistisk analyse

Patienterne blev inddelt i grupper baseret på terciles af BRCA1 udtryk, da denne opdeling er mindre modtagelige for skævhed i flere sammenligninger. Cut-off point for BRCA1 terciles blev opnået fra den spanske Lung Cancer Group database, som omfatter kliniske og genetiske karakteristika mere end 600 spanske lungekræftpatienter. Svarene blev registreret i henhold til kriterierne RECIST. Median tid til progression og samlet overlevelse blev beregnet fra starten af ​​behandlingen til den første dokumenterede sygdomsprogression eller død, henholdsvis.

For at kunne sammenligne kvantitative variabler blandt patienter i hver af behandlingsgrupperne, at udforske sammenhænge mellem variabler inden for hver gruppe, og at undersøge mulighederne sammenhæng mellem baseline-karakteristika og respons, vi brugte parametriske test (t-test eller ANOVA) eller deres tilsvarende ikke-parametriske tests (U Mann-Whitney, Kruskall Wallis), når normalitet ikke holdt . Den normalitet af kontinuerlige variabler blev kontrolleret med Kolmogorov-Smirnov test. For at kunne sammenligne kategoriske variable og respons procenter med deres 95% initiativerne blandt behandlingsgrupper, vi brugte enten tosidet Fishers eksakte test eller Chi-square test.

Foreningen af ​​risikofaktorer med time-to -event endepunkter blev analyseret med tosidet logrank test, og Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til at plotte tilsvarende tid-til-progression og overlevelseskurver. En univariate Cox regressionsanalyse, med hazard ratio og deres 95% CIs blev anvendt til at vurdere sammenhængen mellem de enkelte potentielle prognostiske faktor og overlevelse og tid til progression. Disse faktorer blev derefter medtaget i en multivariat Cox proportional hazards regression model til evaluering af den uafhængige betydning af hver variabel på overlevelse og tid til progression. Sandsynligheden kvotientkriteriet blev anvendt til at vurdere goodness of fit, og Wald test blev anvendt til at vurdere koefficienten betydning. For potentielle multiple sammenligninger blev p-værdier korrigeres med Bonferroni korrektion.

Firs-seks af de 111 patienter uden EGFR-mutationer, for hvem tilstrækkelig tumorvæv var tilgængelig indgik i en sonderende sub-analyse af relationen mellem BRCA1, RAP80 og Abraxas udtryk. Spearmans rank test blev anvendt til at vurdere sammenhængen mellem BRCA1, RAP80 og ABRAXAS mRNA-ekspression.

Alle statistiske beregninger blev udført med SPSS software statistisk pakke, udgave 15.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) og S-PLUS 6.1. To-sidet p-værdier på mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante.

Støtte Information

Tekst S1.

Supplerende tekst

doi: 10,1371 /journal.pone.0005133.s001

(0,04 MB DOC)

tabel S1.

klinisk-patologisk karakteristika, genekspressionsniveauer, EGFR mutation status og resultater for alle patienter

Doi: 10,1371 /journal.pone.0005133.s002

(0,07 MB XLS)

Tabel S2.

Typer af metastaser

Doi: 10,1371 /journal.pone.0005133.s003

(0,05 MB DOC)

tabel S3. Salg Karakteristik af 86 patienter, hvor RAP 80 og Abraxas blev analyseret

doi: 10,1371 /journal.pone.0005133.s004

(0,07 MB DOC)

Tabel S4.

Median overlevelse i henhold til niveauet af BRCA1 og Abraxas

doi: 10,1371 /journal.pone.0005133.s005

(0,03 MB DOC)

tabel S5.

Tid til progression i henhold til niveauet af BRCA1 og Abraxas

doi: 10,1371 /journal.pone.0005133.s006

(0,03 MB DOC)

tabel S6.

Multivariable COX model for overlevelse med BRCA1 og RAP 80 som kontinuerte variable

Doi: 10,1371 /journal.pone.0005133.s007

(0,03 MB DOC)

tabel S7.

Multivariable COX model for tid til progression med BRCA1 og RAP 80 som kontinuerte variable

Doi: 10,1371 /journal.pone.0005133.s008

(0,03 MB DOC)

tabel S8.

Primere og prober, der anvendes i genekspression analyser

doi: 10,1371 /journal.pone.0005133.s009

(0,04 MB DOC)

Figur S1.

tid til progression efter behandlingsgruppe. Tid til progression var 13 måneder i EGFR-gruppen, 5 måneder i de lave og intermediære BRCA1 grupper og 8 måneder i høj BRCA1 gruppen (se tabel 2)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0005133.s010

(8,92 MB TIF)

figur S2.

Tid til progression for patienter i den lave BRCA1 gruppen efter RAP 80 ekspressionsniveauerne. Tid til progression var 14 måneder for patienter med lavt RAP 80 niveauer, 4 måneder for dem med mellemliggende RAP 80 niveauer og 6 måneder for personer med stort RAP 80 niveauer (se tabel 4)

doi:. 10,1371 /journal.pone .0005133.s011

(10.31 MB TIF)

protokol S1.

forsøgsprotokol

doi: 10,1371 /journal.pone.0005133.s012

(1,12 MB PDF)

protokol S2.