PLoS ONE: Kronisk Hyperglykæmi inducerer Trans-differentiering af humane pancreas Stjemeformige Cells og Forbedrer Malignt Molekylær Kommunikation med menneskelige bugspytkirtelkræftceller

Abstrakt

Baggrund

Diabetes mellitus er knyttet til kræft i bugspytkirtlen. Vi hypotese en rolle for bugspytkirtlen stjemeformige celler (PSC) i hyperglykæmi induceret forringelse af kræft i bugspytkirtlen, og derfor undersøgte to humane cellelinjer (RLT-PSC, T3M4) i hyperglykæmiske miljø.

Metode /vigtigste resultater

effekten af ​​kronisk hyperglykæmi (CHG) på PSC’er blev undersøgt ved anvendelse af mRNA-ekspression array med realtids-PCR validering og bioinformatisk pathway analyse, og bekræftende proteinstudier. Stress fiberdannelse (IC: αSMA) indikerede, at kvikskrankerne tendens til transdifferentiate til en myofibroblastlignende tilstand efter udsættelse for CHG. Phosphorylering af p38 og ERK1 /2 blev forøget med en fortløbende opregulering af CDC25, SP1, økonomidirektører og p21, og med nedregulering af PPARy efter kvikskranker blev udsat for kronisk hyperglykæmi. CXCL12 niveauer steg betydeligt i PSC supernatanten efter CHG eksponering uafhængigt af TGF-β1 behandling (3,09 gange med en 2,73 gange uden TGF-β1, p 0,05). Den upregualtion af SP1 transskription faktor i kvikskranker efter CHG udsættelse kan være impliceret i den øgede CXCL12 og IGFBP2 produktion. I kræftceller, hyperglykæmi inducerede en forøget ekspression af CXCR4, en CXCL12 receptor, der også blev induceret af PSC konditioneret medium. Receptor-ligand-interaktion øgede phosphorylering af ERK1 /2 og p38 resulterer i aktivering af MAP-kinase-vejen, en af ​​de mest kraftfulde stimuli for celleproliferation. Bestemt, konditionerede medium af PSC øget bugspytkirtelkræft celleproliferation og denne virkning kan delvist inhiberet af en CXCR4 inhibitor. Som PSC konditioneret medium (normal glucosekoncentration) øgede ERK1 /2 og p38-phosphorylering, konkluderede vi, at kvikskrankerne producere andre faktor (er), som har indflydelse (er) bugspytkirtelkræft adfærd.

Konklusioner

Hyperglykæmi inducerer øget CXCL12 produktion ved kvikskrankerne, og dets receptor, CXCR4 på cancerceller. Den ligand-receptor interaktion aktiverer MAP-kinase signalering, der forårsager øget kræft celledeling og migrering

Henvisning:. Kiss K, Baghy K, Spisak S, Szanyi S, Tulassay Z, Zalatnai A, et al. (2015) Kronisk Hyperglykæmi inducerer Trans-differentiering af humane pancreas Stjemeformige Cells og Forbedrer Malignt Molekylær Kommunikation med menneskelige bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 10 (5): e0128059. doi: 10,1371 /journal.pone.0128059

Academic Redaktør: Seema Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, UNITED STATES

Modtaget: Januar 28, 2015; Accepteret: April 23, 2015; Udgivet: 26 maj, 2015

Copyright: © 2015 Kiss et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer. Alle microarray resultater er uploadet til Gene Expression Omnibus (GEO) database repository (tiltrædelse nummer: GSE59953).

Finansiering: Denne undersøgelse er blevet delvist understøttet af den OTKA 100904 tilskud. Den resterende del af støtten kom fra: School of Ph.D. Undersøgelser, Semmelweis Universitet, Ungarn. Forfatterne vil ikke have havde været i stand til at gennemføre nogle af disse eksperimenter uden begavede materialer: JML, RJ overført udødeliggjort menneskelige bugspytkirtlen stjerneformet (RLT-PSC) cellelinje til Semmelweis University under en MTA aftale. Den T3M4 menneskelige pancreas ductal adenocarcinom cellelinje var en slags gave fra Europa Pancreas Center i Heidelberg. De anvendes i mRNA-ekspression vifte reagenser var slags gaver ved GF, såsom AMD3100 og reagenserne, der blev brugt til at vurdere CXCL12, IGFBP2, CXCR4, CXCR7 på protein og mRNA-niveauer. De finansieringskilder på OTKA havde nogen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. GF har læst tidsskriftets politik og forfatterne af dette manuskript har følgende konkurrerende interesser: JML, RJ, GF har en verserende patentansøgning P1300509 (PCT /HU2014 /00007), der vedrører materiale relevant for dette manuskript er. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om deling af data og materialer. OTKA tilskud ikke har deltaget i finansieringen af ​​forsøgene førte til P1300509 (PCT /HU2014 /00007) ansøgning eller bidraget i enhver anden form til det.

Introduktion

Epidemiologiske undersøgelser og deres meta -analyser etableret et klart bevis for sammenhængen mellem diabetes mellitus (DM) og bugspytkirtelkræft (PAC) og konkluderede, at DM er ikke alene en tidlig manifestation, men også en ætiologisk faktor af AKP. [1] Carstensen og medarbejdere baseret på data fra mere end 4 millioner personår bekræftet sammenhængen mellem type 1 DM (T1DM) og PaC og konkluderede, at en større kræftfremkaldende effekt af exogent insulin er usandsynligt i T1DM. [2]. I mere udbredt type 2 DM (T2DM) tilknytningen til AKP også tydeligt i visningen af ​​en meta-analyse af 36 undersøgelser [3].

En prospektiv kohorte rapporterede, at forhøjede fastende plasmaglukose (FPG) niveauer er risikofaktorer for PaC [4]. Desuden en dosis-respons meta-analyse af data fra 2408 Pac patienter bekræftet, at hver eneste mmol /l stigning i FPG allerede over 4,1 mmol /l er forbundet med en stigning i antallet af kræft i bugspytkirtlen [5] 25%. I en risiko model til at identificere personer med øget risiko for kræft i bugspytkirtlen, diabetes 3 år udgjorde en lignende grad af risiko end, familie historie af kræft i bugspytkirtlen i befolkningen [6]. Kræft i bugspytkirtlen, hvoraf 90% af tilfældene er duktalt adenocarcinom, betyder en elendig prognose med en 5 års overlevelse på 7% [7]. Det betyder en enestående høj behov for en bedre forståelse af sin molekylære patologi.

På trods af antallet af støtte epidemiologiske studier de cellulære og molekylære mekanismer for udviklingen af ​​denne forening mellem DM og AKP mindre klar. hypotese, vi derfor, at kronisk hyperglykæmi ud over den direkte effekt på kræftceller også negativt kan ændre kommunikationen mellem kræftceller og mikromiljø, især med de bugspytkirtlen stjemeformige celler, der er de væsentligste cellulære stromale elementer i PaC. Følgerne af fibroblast-aktivering-en proces drevet oprindeligt ved transformerende vækstfaktor beta (TGF-β) udviklet sig til at forbedre sårheling-er ugunstige i kræftsygdom [8]. Eksperimentelle data antydede, at antitumorimmunitet blev undertrykt af stromale celler, der udtrykker fibroblast aktiverede protein (FAP) og et middel målretning FAP-udtrykkende celler forøget anti-tumoral immunitet [9]. Men dette koncept er for nylig blevet udfordret baseret på observationer med αSMA + myofibroblastdifferentiering slettet transgene mus i bugspytkirtelkræft model antyder en endnu mere kompleks regulering [10].

pancreas stjemeformige celler (PSC) efter aktivering transeuropæiske differentiere til myofibroblasts -lignende celler, der er den vigtigste kilde til den ekstracellulære matrix (ECM) protein deposition under vævsfibrose [11-13]. Pankreatisk duktalt adenokarcinom er kendetegnet ved en rigelig desmoplastiske stroma som følge af PSC-aktivering [14].

Der er en intens kommunikation mellem tumorassocierede PSC’er og cancerceller. Aktiverede PSC’er frigive en række forskellige vækstfaktorer, cytokiner og chemokiner, der fremmer den maligne opførsel af pancreas-tumorceller, spiller en væsentlig rolle i cancer og vækst [15-18] aktiverede setllate celler også beskytte den pancreastumor fra strålingshærdelig og gemcitabine- inducerede apoptotiske virkninger [19]. PSC i indirekte co-dyrkning forbedret stamcellelignende fænotyper af cancerceller og induceret ekspression af cancer stamcelle-relaterede gener, hvilket antyder en rolle i cancer stamceller niche [20].

Vi vurderede respons humane PSC’er udsat for kronisk hyperglykæmi (CHG, 21 dage), ved anvendelse af en flertrins fremgangsmåde til at identificere de molekylære veje, der kan regulere PSC aktivering. PAC celler blev også direkte vurderes ved udsættelse for hyperglykæmi eller konditioneret PSC dyrkningsmedium (CCM).

Materialer og Metoder

cellelinjer, cellekulturer

I alle eksperimenter, vi anvendt RTL-PSC og T3M4 menneskelige cellelinier. RLT-PSC er en human pankreatisk stjerneformet cellelinie, der tidligere blev udødeliggjort ved transfektion med SV40 stort T-antigen og human telomerase (hTERT) og analyseret for stjerneformet cellemarkører [13]. Desuden T3M4 human pancreas duktalt adenokarcinom cellelinje blev anvendt, som var en venlig gave fra Europa Pancreas Center i Heidelberg [21].

PSC celler blev dyrket i DMEM (Dulbeccos modificerede Eagle-medium, Sigma, St. Louis, MO) med 1000 mg /l (5,5 mmol /L) glucosekoncentration, T3M4 celler blev dyrket i RPMI-1640-medium (Sigma) begge suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Sigma) og 1% penicillin /streptomycin ( Sigma). Celler blev dyrket ved 37 ° C atmosfære indeholdende 5% CO2 og passeret ved 85-90% konfluens ved hjælp af trypsin-EDTA-opløsning (Sigma).

vækstfaktorer og andre forbindelser

transformerende vækstfaktor β1 (TGF-β1, Sigma) blev tilsat i 5 ng /mL slutkoncentration til cellerne. AMD3100 octahydrochloride hydrat (2 ug /ml, Sigma) blev anvendt til at inhibere CXCR4-receptoren. Under cellemigration vurdering celler blev behandlet med mitomycin C (10 ug /ml, Sigma, del nr .: M4287) for at forhindre celleproliferation. BSA (bovint serumalbumin, Sigma, del nr .: A3294) blev anvendt til uspecifik blokering i flere metoder.

Behandlingsplan af PSC og T3M4 celler

PSC’er blev udsat for Chg og TGF β1 efter følgende protokol:

i “kontrol” betingelser celler dyrket som beskrevet ovenfor. I tilfælde af “high glucose” behandling celler blev dyrket i dyrkningsmedium indeholdende 15,3 mmol /l glucose i 3 uger (21 dage), som foreløbige eksperimenter viste det bedste respons ECM proteinproduktion på dette tidsramme. Efterfølgende blev cellerne udsultet i 24 timer i FBS-frit medium og derefter i 48 timer i FBS-frit medium enten med eller uden TGFp1 at sammenholde dens virkning CHG. To biologiske paralleller blev anvendt til hver regimen. Salg

Celler dyrket i T75 kolber blev opsamlet og anvendt til mRNA og protein analyse blev celledyrkningsmedium indsamlet til proteinanalyse. For immuncytokemi blev cellerne dyrket på dækglas i 6-brønds plader. Forsøg blev gentaget tre gange. Salg

T3M4 celler blev dyrket til 80% konfluens i T75-kolber og derefter sultet natten over i FBS-fri RPMI. Efterfølgende dyrkningsmedium indeholdende PSC-CCM og RPMI med 10% FBS i en 50% -50%-forholdet blev tilsat til cellerne i 48 timer. Som kontroller i T3M4 eksperimenter FBS DMEM (med 5,5 og 15,3 mM glucose koncentration) blev tilsat sideløbende med den fuld FBS RPMI. Efter 48 timers behandling, T3M4 celler og cellekultursupernatanter blev indsamlet til proteinstudier.

Fremstilling af konditioneret celledyrkningsmedium (CCM)

Vi forberedt CCM fra RTL-PSC’er ved dyrkning deraf i T75 kolber med 12 ml DMEM indeholdende 10% FBS i 3 dage. DMEM med 1000 mg /l (5,5 mmol /L) eller med 2750 mg /l (15,3 mml /l) glucose blev anvendt. CCM blev opsamlet fra hver kolbe, steril filtreret og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse.

mRNA-ekspression matrix

Totalt RNA blev isoleret (Mean RNA Integrity Nummer [RIN] = 9,2 ± SD 0.4) under anvendelse af RNeasy Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). To biologiske dubletter blev samlet inden for hver gruppe og to tekniske dubletter blev hybridiseret fra hver samleprøve gruppe på GeneChip PrimeView Human Gene Expression Array (Affymetrix, Santa Clara, CA). Biotinyleret amplificeret RNA (aRNA) prober blev syntetiseret ud fra 200 ng total RNA ved anvendelse af 3 ‘IVT Express Kit (Affymetrix). Mærkede Arnas blev derefter renset og fragmenteret for den efterfølgende hybridisering. Fluorescerende signaler blev scannet ved GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix). Data blev udvundet fra CEL filer ved hjælp “R” overflade med BioConductor softwarepakker. Robust Multichip Gennemsnitlig (RMA) normalisering blev udført, og data blev konverteret til log2 notation at gøre Feature udvælgelse ved lineær model og SAM hjælp “limma” og “samtools” pakker. Alle microarray resultater er uploadet til Gene Expression Omnibus (GEO) database repository (tiltrædelse nummer: GSE59953).

Gene udtryk værdier på hver behandling arm blev rangeret efter deres differential udtryk i forhold til prøverne isoleret fra “kontrol” kvikskranker . To sæt gener, top 100 og 300 blev udvalgt til at give den bedste separation. (P-værdi: 10-4, Statistica software release 8, T-test).

Bioinformatik /Pathway analyse

MetaCore (Thomson Reuters) pathway database integreret software blev anvendt til funktionel analyse af mRNA-ekspression microarray data [22]. Denne analyse gav en foreløbig rang af signaltransduktionsveje, der er mest sandsynligt ændret i kvikskranker efter CHG eksponering. Vi har udvalgt 14 differentielt udtrykte gener fra disse orienteringsmæssige netværk for yderligere real-time RT-PCR validering, baseret på deres potentielle tilknytning til diabetes eller bidrag til PSC aktivering, ø specifik fibrose eller kræft i bugspytkirtlen.

Real-time RT PCR validering

Første streng cDNA blev syntetiseret fra 1 pg RNA ved hjælp af M-MLV revers transkriptase (Invitrogen af ​​Life Technologies Carlsbad, CA, USA) på de betingelser, der er anbefalet af producenten. Real-time PCR blev udført ved hjælp af ABI Gene Expression TaqMan Analyser (S1 tabel.) Og TaqMan Universal PCR Master Mix (varenummer 4.324.018) i en ABI 7000 Sequence Detection System, alle købt fra Applied Biosystems af Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) under betingelser anbefalet af producenten. Prøver blev kørt in triplo i 20 pi totalvolumen indeholdende 50 ng cDNA [cyklusbetingelser: denaturering: 95 ° C (10 min) efterfulgt af 40 cykler: 95 ° C (15s), annealing + udvidelse: 60 ° C (1 min)] . Resultaterne blev standardiseret til 18S rRNA (varenummer 4319413E). Cycle tærskel (CT) værdier blev registreret og relative genekspressioner blev beregnet ved anvendelse af 2

-ΔΔCT metode.

enzymmaerket (ELISA)

Type-1 og type- 3 kollagen indholdet blev vurderet ved anvendelse af en indirekte ELISA-system. Plader blev overtrukket natten over med cellekultursupernatanten ved 4 ° C. Efter blokering med 3% vægt /volumen BSA, blev primære antistoffer anvendt natten over ved 4 ° C. Efter vask med PBS, blev passende sekundært antistof. (Antistof specifikationer og fortyndinger anvendes, er angivet i S2 tabel.) Signaler blev opnået ved tilsætning af 3,3 ‘, 5,5’- tetramethylbenzidin (Sigma, varenr .: T0440), blev reaktionen standset ved 1,6 N svovlsyre. Absorbans blev registreret ved 450 nm (Labsystems Multiscan MS, Thermo Labsystems, Milford, MA, USA)

Kvantificering af CXCL12 og IGFBP2 i cellesupernatanten blev udført ved anvendelse af en fast fase Sandwich ELISA-kit (Quantikine R 0,05) og uden (3,47 gange og 2,35 gange p 0,05) før CHG eksponering.

Når kvikskranker blev udsat kun CHG, en tendens til øget type 1 og -3 kollagen produktioner (1,41 gange og 1,40 gange) blev observeret (figur 2). Disse resultater antyder, at kronisk hyperglykæmi kan bidrage til PSC aktivering og overdreven ECM produktion.

Øget α-SMA og type-1-collagen-protein-ekspression blev fundet på immunocytokemi efter PSC’er blev udsat både for 21 dage hyperglykæmi eller 48h af TGF-β1

(a)

. Øget type 1 og type-3 kollagen niveauer blev observeret i PSC cellekultur supernatant i ELISA studier, men stigningerne var statistisk eneste væsentlige efter TGF-p1 behandlinger både med og uden eksponering forudgående CHG, men ikke efter CHG eksponering alene

(b)

. Signifikante forskelle (p 0,05) (fig 3A). tidligere Behandling af kvikskranker-holdes i normal glukose koncentration-med TGF-β1 i 48 timer resulterede i en 2,69-dobling af CXCL12 niveauer.

Når TGF-β1 behandlingen blev anvendt senere efter at kvikskranker blev udsat for CHG det resulterede i en signifikant (3,78 gange, s 0,05) IGFBP2 proteinniveau elevation i PSC supernatant (fig 3B)

CXCL12 niveau blev øget betydeligt i PSC cellekultur efter udsættelse for CHG mens 48h TGF-β1. behandling med normal glukose koncentration resulterede også i mere end 2-fold forøgelse

(a

). IGFBP2 proteinniveau blev forøget i celledyrkningsmediet efter udsættelse for enten CHG eller TGF-β1. Denne ændring var kun signifikant, når kvikskranker blev udsat for TGF-β1 senere efter CHG eksponering.

(b)

. Signifikante forskelle (p 0,05) * og meget signifikante forskelle (p 0,001). ** Er markeret

Øget spredning og Migration af T3M4 celler og effekten af ​​en CXCR4 inhibitor

spredningen af ​​T3M4 celler steget markant efter 48h dyrkning med CHG udsatte PSC /CCM viser næsten fordobling (10,48) i forhold til andre behandlinger (DMEM-5.5: 6.58¸DMEM-15.3: 6.43, p 0,05) på 72 timer varig hele eksperimentet (96h). Denne proliferation fremmende virkning kan delvist inhiberes ved hjælp af CXCR4 inhibitor, AMD3100 co-behandling (14,91 vs 17,54, p 0,05), men først efter 96 timers behandling (figur 5A)

Proliferation af T3M4 celler inkuberet med. forskellige konditioneret PSC dyrkningsmedium og CXCR4 inhibitor AMD3100 efter 24, 48, 72 og 96 timers behandling. T3M4 celleproliferation (optrukket linie, ubehandlet kontrol) var signifikant forøget efter inkubation med PSC supernatant (stiplet linje), forudsat at PSC var forud eksponeret for CHG. Tilstedeværelsen af ​​CXCR4 inhibitor AMD3100 (stiplet linie) kan delvist modvirker denne proliferation induktion efter 96 timers.

(b)

Migration af T3M4 kræftceller i et sår-helende assay. blev fundet en hurtig direkte virkning af forhøjet glucoseniveau: væsentlig virkning af hyperglykæmi på migrationen af ​​cancerceller. Der var ingen slående effekt af aircondition PSC dyrkningsmedier på T3M4 celle migration.

(c)

Western blot-analyser af centrale signalmolekyler i T3M4 celler. Cancer celler blev udsat for hyperglykæmi eller forskellige konditioneret PSC dyrkningsmedium. Bedste repræsentative billeder af vigtige signalmolekyler af kræftceller er angivet i WB membraner. Ponceau-farvning blev anvendt til at vurdere lige lastning af geler. Signifikant (p 0,05). Forskelle er betegnet *

Migration af T3M4 tumorceller blev vurderet i en sårhelende assay. Såvel engagementet af cancerceller til direkte hyperglykæmi (cancerceller inkuberet i 50% DMEM-high glucose og 50% RPMI i en glukose concentation af 13,2 mm) og behandlingstid til PSC CCM-5,5 forstærket migration efter 20 timer, sammenlignet med kontrolceller. Den mest udtalte migration fremmende virkning blev påvist, når cancerceller blev inkuberet med konditioneret PCS medium med højt glucoseindhold (CCM-15.3). (Fig 5B)

Ændring af centrale signalveje i T3M4 celler

I T3M4 celler, en massiv (mere end 5 gange) stigning i phosphoryleret ERK1 /2 parallelt med en betydelig stigning i p21 protein produktion blev fundet efter eksponering både til hyperglykæmi og til PSC-CCM, trods at T3M4 er en KRAS-Wild typen ductal PaC cellelinje. Signifikant stigning i p-p38 blev fundet i T3M4 celler udsat for begge typer af PSC-CCM. Hyperglykæmi eksponering faldt mængden af ​​p (Thr) Akt og p (Ser) Akt i T3M4 celler, i modsætning hertil eksponering af cancerceller til PSC-CCM forøgede mængde p (Ser) Akt (Fig 5C). Begge receptorer af CXCL12, CXCR4 og CXCR7 blev udtrykt på T3M4 celler (Fig 5C). T3M4 celler udsat direkte til hyperglykæmi eller forskellige konditionerede PSC dyrkningsmedier udtrykt øget mængde af CXCR4, hovedsagelig efter behandling af T3M4 celler med dyrkningsmediet af PSC, der tidligere blev udsat for CHG. I modsætning hertil fandt vi ingen ændring i CXCR7 proteinekspression på T3M4 celler efter forskellige behandlinger. WB resultater med de relative massefylde værdier er angivet på Fig 5C. Kun en beskeden, ikke-signifikant stigning i c-fos og i FAK-proteiner blev fundet i T3M4 celler udsat for begge typer PSC-CCM eller protein udtryk for PTEN og PKCa blev væsentligt ændret i T3M4 celler efter forskellige behandlinger. (S3 Fig)

Diskussion

epidemiologisk forbindelse mellem DM og PaC [1-3, 6] motiveret denne linje af forskning. Vi antager, at CHG kunne fremkalde trans-differentiering (aktivering) af kvikskranker og bidrage til udvikling og progression af pancreas fibrose og kræft [15-18, 23]. Hypotesen blev vurderet ved hjælp af menneskelige, udødeliggjort RLT-PSC-cellelinje [13] i en unik forsøgsopstilling. En række PSC aktiverende faktorer (f.eks: EtOH, TGF-β1, PDGF, TNFa, interleukiner [IL-1, -6, -13], ROS) blev tidligere identificeret, men den rolle af kronisk (dvs. 14 dage) hyperglykæmi i PSC aktivering er ikke undersøgt til dato.

Tidligere undersøgelser rapporteret en hyperglykæmi induceret aktivering af rotte kvikskranker, men kun op til 72 timer og uden en genom-strategi. [24-26] Vi fandt, at humane PSC øget cytoplasmatisk αSMA mikro-filament formation den og tendens til at øge større ECM proteinbestanddele (type-1 og -3 kollagener) ved udsættelse for CHG.

hele genomet microarray fremgangsmåde blev anvendt til at vurdere glucose -inducerede ændringer i mRNA ekspressionsmønstre. Den MetaCore vej database-software blev brugt til foreløbig identifikation af diabetes forbundet veje, efter udvælgelsen af ​​de øverste 300 differentielt udtrykte gener. Hver molekylær vej var resultatet af integrationen af ​​flere sæt af gener med ændrede mRNA udtryk i microarray (f.eks .: CXCL12 blev identificeret som en integration af 12 gener med markant ændret mRNA udtryk i en enkelt signalering kaskade). Efterfølgende vi valideret mRNA udtryk for et udvalgt sæt af gener ved hjælp af real-time PCR. Key signalmolekyler blev derefter vurderet på proteinniveau i kvikskranker.

fosforylering af p38 var den mest markante ændring i kvikskranker efter eksponering for CHG. Vi kunne ikke give en entydig opstrøms vej for hyperglykæmi induceret forøget phosphorylering af p38 i kvikskrankerne imidlertid lignende resultater blev rapporteret i dyrkede humane peritoneale mesoteliale celler udsat for høj glucosekoncentration, hvilket indikerer, at p38 MAPK-aktivering af spillet en rolle i (den peritoneale ) fibrose udvikling [27]. Aktivering af p38 pathway var også væsentligt i den høje glucosekoncentration induceret epithelial-mesenchymal overgang (EMT), i dyrkede humane renale tubulære epitelceller [28] og EMT af acini i bugspytkirtlen kan bidrage til den endelige PSC population [29]. Desuden er den p38 pathway aktiveret under gluco-lipotoxicity induceret apoptose i insulin-udskillende INS-1-celler [30].

SP1 blev udvalgt til WB-analyse på grund af, at den proksimale promotor af CXCL12 er besat af seks formodede SP1 bindende motiver som bekræftet ved funktionelle metoder (in vitro-mutagenese) [31] og på grund af denne SP1 transkriptionsfaktor bindes også til 200 bp opstrøms for transkriptionsinitieringsstedet af IGFBP2. SP1 inducerer også transkriptionen af ​​p21 og CDC25 gener [32, 33]. Vi fandt en signifikant stigning i SP1 proteinmængden i PSC’er efter eksponering for CHG og dette var uafhængig af virkningen af ​​TGF-β1. SP1 overekspression i kirurgisk resektion human PaC var forbundet med aggressiv sygdom og dårlig prognose [34] og SP1 blev beregningsmæssigt forudsagt at være den væsentligste regulator transkriptionsfaktoren i PaC [35]. Vi konkluderede, at signalering via hexosamin pathway, og CHG inducerede stigning af p-p38 og p-ERK1 /2-koordineret alle regulerede aktiveringen af ​​SP1, som til sidst resulterede i den forøgede transkription af Sp1-afhængige gener, herunder CXCL12, IGFBP2, Cdc25A og p21 i PSC (Fig 6) [36-39].

disse resultater antyder en rolle metaboliske faktorer i PSC-aktivering, der kan give profibrogenic stimuli i mindre grad sprednings signaler i disse stromale celler. Hyperglykæmi inducerede også en cancerassocieret sekretion mønster af PSC, der kan ændre pancreas tumormikromiljøet.