PLoS ONE: Diagnostisk Værdi af SFRP1 som Gunstige Predictive og prognostiske Biomarkør i patienter med prostata Cancer

Abstrakt

Voksende genetisk og molekylærbiologisk tyder på, at afbrydelsen af ​​balancen mellem udskilt Frizzled-relateret protein-1 ( SFRP1) og β-catenin spiller en vigtig rolle i initieringen og udviklingen af ​​flere cancertyper. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge, om ekspressionen af ​​SFRP1 og β-catenin er forbundet med de kliniske-patologiske træk af patienter med prostatakræft (PCA), og vurdere deres potentielle roller som forudsigende og prognostiske biomarkører. I denne undersøgelse, blev i alt 61 patienter med PCa og 10 patienter med benign prostatahyperplasi inkluderet, og vi viste, at ekspressionen af ​​SFRP1 og β-catenin blev korreleret med Gleason score, overlevelsesraten og respons for endokrin behandling af PSA. De overlevelsesrater for PCA patienter med lav SFRP1 udtryk (P = 0,016) eller høj β-catenin udtryk (P = 0,004) var signifikant dårligere. En negativ korrelation (r = -0,275, P = 0,032) mellem SFRP1 og β-catenin blev observeret ved Chi-square test. Multivariat analyse foreslog, at SFRP1 (hazard ratio, 0,429; 95% konfidensintervaller, 0.227-0.812; P = 0,009), kan fungere som en uafhængig prædiktiv og prognostisk faktor for PSA. Vi viste også, at protein og mRNA-niveauer af SFRP1 i androgen-afhængige PCa LNCaP var signifikant højere end i androgen-uafhængige PCA cellelinjer DU145 og PC3. Imidlertid proteinniveauet af β-catenin i LNCaP-celler var signifikant lavere end i DU145 og PC3-celler, og ingen signifikant forskel på β-catenin mRNA niveau blev observeret i LNCaP, DU145 og PC3-celler. Bisulfit sekventering PCR-assay viste signifikant lavere methylering niveau af

SFRP1

promotor i LNCaP-celler end i DU145 og PC3-celler. Tilsammen tyder disse resultater på, at SFRP1, hvilket udtryk omvendt korrelerer med den af ​​β-catenin, er et gunstigt prædiktiv og prognostisk biomarkør

Henvisning:. Zheng L, Sun D, ​​Fan W, Zhang Z, Li Q Jiang T (2015) diagnostisk Værdi af SFRP1 som gunstige Predictive og prognostiske Biomarkør i patienter med prostatakræft. PLoS ONE 10 (2): e0118276. doi: 10,1371 /journal.pone.0118276

Academic Redaktør: Craig N. Robson, Northern Institute for Cancer Research, Storbritannien

Modtaget: August 2, 2014 Accepteret: 12 Januar 2015; Publiceret: 26 feb 2015

Copyright: © 2015 Zheng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud (21272032 til TJ) fra National Natural Science Foundation of China (https://www.nsfc.gov.cn/publish /portal1 /). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er en almindelig ondartet svulst i urinvejene, hvilket er den sjette hyppigste årsag til kræft dødsfald hos mænd [1-3], alvorligt påvirker patientens livskvalitet. Familie historie af sygdommen, etnicitet og høj alder er anerkendt som de vigtigste faktorer, der driver PCa, mens detaljeret patogenese af denne sygdom er stadig usikkert [4]. I øjeblikket er radikal kirurgisk resektion, stråling og endokrin behandling anvendes som behandlinger af PCa [5-8]. Men denne sygdom er sædvanligvis fatal for de fleste patienter diagnosticeret i fremskredne stadier. Derfor er det ganske vigtigt at identificere værdifulde forudsigende og prognostiske biomarkører for tidlig diagnose, og for at præcisere patogenesen af ​​PSA.

Wnt proteiner udskilles cysteinrige glykosylerede og lipid modificerede proteiner, som spiller en nøglerolle i flere cellulære processer, herunder celledifferentiering, proliferation, migration, synaptisk aktivitet og embryonale udvikling [9-14]. Disse proteiner udøver deres fysiologiske funktioner gennem Wnt signalvejen. Wnt proteiner binder til de syv transmembrane (7-TM) receptorer af frizzlede familie, og derefter aktivere et kompleks signalering kaskade endelig føre til aktivering af downstream target gener, såsom

c-myc, c-Jun, fibronektin

og

cyklin D1

[15,16]. β-catenin er en vigtig komponent i Wnt signaling pathway, hvis ændret lokalisering er blevet anerkendt som en markør for signaleringsvej aktivering Wnt [16]. I fravær af Wnt-ligand, er cytoplasmatisk β-catenin nedbrydes af β-catenin ødelæggelse kompleks sammensat af stilladser axin protein, caseinkinase 1 (CK1), adenomatøs polypose coli (APC) og glycogensynthasekinase 3 (GSK3) gennem ubiquitin -proteasome pathway. Men i nærværelse af Wnt-ligand, Wnt liganden binder til dets receptor, hvilket resulterer i inhibering af β-catenin ødelæggelse kompleks. Efterfølgende phosphorylerede P-catenin molekyler ophobes i cytoplasmaet, hvoraf en del trænge ind i kernen og udøve deres funktion som en co-aktivator af LEF /TCF transkriptionsfaktorer endelig føre til aktivering af Wnt-målgener ekspression [9]. I øjeblikket stigende tegn på, at dereguleringen af ​​Wnt signalvejen er tæt forbundet med PCa tumorigenese hos voksne [17-20].

Udskilte Frizzled-relateret protein-1 (SFRP1), også kendt som SARP-2, blev først isoleret fra humane osteoblastceller, som indgår i det udskilte glycoprotein SFRP familie. Det huser to distinkte strukturelle domæner, nemlig netrin domæne og CRD-domænet. CRD-domænet er homologe med frizzled receptorer [16,21]. Undersøgelser viser, at SFRP1 er en antagonist af Wnt signalvejen, og kan binde til Wnt proteiner via dets CRD-domænet på en kompetitiv måde med det transmembrane Frizzled receptoren, hvilket fører til inhibering af Wnt signalvejen [22-25]. SFRP1 er påkrævet for prostata udvikling, og udøver sin rolle som en stromal-til-epitel parakrin modulator af epitelial vækst, forgrening morfogenese, og epithelial genekspression [26]. Det er også anerkendt som kandidat formidler af stromale-til-epitelial signalering i PCa [27]. Inaktivering af SFRP1 er rapporteret på grund af høj methylering af

SFRP1

genpromotor i en række forskellige maligniteter, herunder PCa [28-35]. Desuden SFRP1 inhiberer den transkriptionelle aktivitet af androgen receptor (AR) og spredning af androgenafhængige LNCaP-celler [36]. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge, hvilken rolle SFRP1 og β-catenin udtryk i menneskelig PCa patogenese.

I denne rapport, viste vi, at der var en negativ sammenhæng mellem SFRP1 og β-catenin i humane PCA væv ved at evaluere kliniske-patologiske funktioner. Multivariat analyse viste, at SFRP1 kan fungere som en uafhængig prædiktiv og prognostisk faktor for PSA. Protein- og mRNA-niveauer af SFRP1 i androgen-afhængige PCa LNCaP var signifikant højere end i androgen-uafhængige PCA cellelinjer DU145 og PC3. Imidlertid proteinniveauet af β-catenin i LNCaP-celler var signifikant lavere end i DU145 og PC3-celler, og ingen signifikant forskel på β-catenin mRNA niveau blev observeret i LNCaP, DU145 og PC3-celler. Vi viste ligeledes, at methylering på

SFRP1

promotor var signifikant lavere i LNCaP-celler end i DU145 og PC3-celler. Tilsammen vores data antydet, at SFRP1 sandsynligvis vil være en gunstig prædiktiv og prognostisk biomarkør.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse omfatter menneskelige deltagere blev godkendt af den etiske komité i Dalian Medical University. Skriftligt samtykke blev opnået fra alle de menneskelige deltagere. Al forskning blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen.

Cell Culture og eksperiment Reagenser

Menneskelig PCA cellelinjer LNCaP, DU145 og PC3 blev opnået fra cellen bred af Shanghai filial af kinesiske videnskabsakademi. LNCaP-celler blev dyrket i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (Gibco, USA), 100 ug /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. DU145 celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% kalvefosterserum (Gibco, USA), 100 ug /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. PC3 celler blev dyrket i DMEM /F12 suppleret med 10% føtalt bovint serum (Gibco, USA), 100 ug /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Alle celler blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO

2.

Kanin monoklonalt anti-SFRP1 (ab126613) og mus monoklonalt anti-β-catenin (ab22656) blev opnået fra Abcam (Cambridge, UK). Muse monoklonalt anti-β-actin (C4) (sc-47.778), ged anti-mus IgG og gede anti-kanin IgG blev opnået fra Santa Cruz Biotech (CA, USA). Proteaseinhibitor blanding blev indkøbt fra Roche Applied Science (Basel, Schweiz). 5Aza blev opnået fra Sigma (Santa Clara, USA). SMARTpool siRNA’er (Kontrol og β-catenin) med fire individuelle siRNA rettet mod en enkelt gen blev opnået fra Thermo (USA).

PCA vævsprøver til immunhistokemisk assay

I alt 71 prøver blev opnået fra First Affiliated Sygehus af Dalian Medical University, Liaoning, Kina 2002-2008, herunder 61 prøver fra patienter, der var patologisk eller cytologisk verificerede adenokarcinom i prostata og 10 godartet prostatahyperplasi prøver. Alle PCA prøver var fra patienter med aldre spænder fra 44 til 84 (gennemsnitlig alder på 72 år). De tumor kvaliteter blev registreret som Gleason score 7 (34 prøver), og Gleason score≤7 (27 prøver). Ifølge tumor node metastase (TNM) udviklet af amerikanske Blandede Cancer (AJCC), deltog alle patienter i denne forskning var i T

3 /T

4 /N

x-1 M

0 fase. Godartet prostatahypertrofi prøver blev opnået fra patienter til behandling af ikke-tumorsygdomme, med aldre svinger fra 48 til 81, (gennemsnitsalder på 71,8 år). Alle patienter blev fulgt op til december 2013. overlevelsestiden varierede fra 3 til 60 måneder, med en median tid på 38 måneder. I denne periode, 38 patienter døde på grund af kræft tilbagefald

Vurderingskriterier af respons for endokrin behandling:. (1) Effektiv endokrin behandling. Efter endokrine behandling (medicin eller kirurgisk kastration), PSA niveau vender tilbage til normal og 2 ng /ml inden for tre år. Ingen nye metastatiske læsioner vises i knoglen gennem CT, MR eller ECT-scanning; (2) Ineffektiv endokrin behandling. Efter endokrin behandling, er PSA-niveau ikke reducere eller forbigående falder og derefter stiger. Sygdom forværrer og nye metastatiske læsioner vises i knogle i to år.

immunhistokemisk analyse

Alle prøver blev analyseret ved immunhistokemi. De enheder udskåret ved drift blev fikseret i 10% pufret formalin i 24 timer, og derefter de faste væv blev indlejret i paraffin. Fire mikrometer sektioner af de på hinanden følgende paraffinindlejrede prøver blev skåret til immunhistokemisk analyse ved hjælp af en Histostain-Plus (Invitrogen, Camarilo, CA). Alle snit blev afparaffiniseret med xylen og hydreret med gradueret ethanol opløsning. H

2O

2 (3%) blev anvendt til at slukke de endogene peroxidaser af prøverne, og derefter blev snittene inkuberet i blokerende serum i 10 minutter ved 37 ° C. Snittene blev derefter farvet med citratbuffer (pH 6,0) indeholdende enten anti-SFRP1 eller anti-β-catenin i en fortynding på 1: 100 natten over ved 4 ° C. Snittene blev derefter inkuberet med biotinyleret gede-anti-kanin immunoglobulin ved en fortynding på 1: 200 i 10 minutter ved stuetemperatur, og derefter inkuberet med avidin-biotin peroxidase-kompleks i 10 minutter ved stuetemperatur. Endelig blev sektionerne inkuberet med DAB (diaminobenzidin) anvendt som chromogen. Salg

SFRP1-positiv farvning tilfælde udviste klare brune gule granuler i cytoplasmaet. β-catenin-positiv farvning sager udstillet klare brune gule granulat i cytomembrane og kerne. Scoring af farvningen blev foretaget efter følgende kriterier: (1) Scoring baseret på farvning intensitet. 0, ingen cellefarvning; 1, celler med bleggul; 2, celler med lysebrunt; 3, celler med brun. (2) Scoring baseret på procentdelen af ​​positive celler. Prøver blev observeret under stor forstørring (400 ×). 10 tilfældige områder blev udvalgt, og 100 celler pr feltet blev talt. 0, 25% cellefarvning; 1, 25% -50% cellefarvning; 2, 51% -75% cellefarvning; 3, 75% cellefarvning. Tilsammen (1) + (2) . 3 blev anerkendt som positive prøver, mens (1) + (2) ≤3 blev anerkendt som negative prøver

Western Blot-analyse

LNCaP, DU145 og PC3-celler behandlet med eller uden 5Aza (DNA-methyleringsinhibitor) blev høstet og lyseret i en kold buffer (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoxycholat, og inhibitor-blanding protease). Efter centrifugering ved 12.000 rpm i 10 min ved 4 ° C blev prøver af supernatanten underkastet SDS-PAGE. Derefter blev proteinbåndene i gel overført til poly vinylidenfluorid (PVDF) -membran (Millipore) og probet med angivne primært antistof natten over ved 4 ° C. Dernæst blev PVDF-membran inkuberes med det passende sekundære antistof i 4 timer ved stuetemperatur. Resultaterne blev analyseret ved kemiluminescensdetektion. Data blev kvantificeret ved at scanne de passende bånd af interesse og afbildet som relativ densitet på gråskala. Eksperimentet blev gentaget tre gange.

Kvantitativ RT-PCR assay

Totalt RNA fra hver cellelinje (LNCaP, DU145 og PC3) blev ekstraheret under anvendelse RNAiso Plus-reagens (Takara, Dalian, Kina) ifølge producentens anvisninger. Revers transkription blev udført ved hjælp af en revers transkription-kit (Takara, Dalian, Kina). Real-time PCR blev udført med LightCycler Real-Time PCR System (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz). De følgende primere designet af Primer Premier 5.0 blev anvendt: 5′-CCCGAGATGCTTAAGTGTGACAA-3 ‘(sense) og 5′-ACTCGCTGGCACAGAGATGTTC-3’ (antisense) for

SFRP1

; 5′-AGAAAAGCGGCTGTTAG-3 ‘(sense) og 5′-ATACAGGACTTGGGAGGT-3’ (antisense) for

β-catenin

; 5′-CAGGTCATCACTATCGGCAA-3 ‘(sense) og 5′-CAAAGAAAGGGTGTAAAACGC-3’ (antisense) for

β-actin

. Prøverne indeholdende cDNA, det passende par af primere og maksima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo) blev underkastet den følgende reaktion: indledende denatureringstrin på 95 ° C i 10 minutter; og 40 cykler ved 95 ° C i 30 s, 55 ° C i 15 s og 72 ° C i 20 s. De 2

– △△ CT metode blev anvendt til dataanalyse. De mRNA niveauer af

SFRP1

β-catenin

blev normaliseret til

β-actin

, som serveres som den endogene kontrol.

Bisulfite sekventering PCR assay (BSP)

DNA fra hver cellelinje (LNCaP, DU145 og PC3) blev ekstraheret under anvendelse af et DNA-oprensningskit (Tiangen, Beijing, Kina) ifølge producentens anbefalinger. Det isolerede DNA blev behandlet med natriumbisulfit ved hjælp af CpGenome Hurtig DNA Modification Kit (Millipore) ifølge producentens anbefalinger. DNA’et behandlet med natriumbisulfit blev amplificeret ved en GeneAmp 9600 PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). De følgende primere designet af Primer Premier 5.0 blev anvendt: 5′-GGTTAAGGTAGGAGTATTATTTGAGGT-3 ‘(sense) og 5′-AACCTAAATCATACTTACAAACCCAT-3’ (antisense) for CpG island 1 af

SFRP1

promotor; 5′-TTGTTTTTTAAGGGGTGTTGAGT-3 ‘(sense) og 5′-TACCACAAACTTCCAAAAACCTC-3’ (antisense) for CpG island 2

SFRP1

promotor. De følgende reaktionsbetingelser blev udført: 10 cykler af 95 ° C i 5 min, 95 ° C i 30 s, 60 ° C-50 ° C i 45 s (begyndende ved 60 ° C for den første cyklus, men med temperaturen faldt med 1 ° C for hver efterfølgende cyklus), og 72 ° C i 45 s; 33 cykler ved 95 ° C i 30 s, 50 ° C i 45 s og 72 ° C i 45 s; og 60 ° C i 30 minutter. PCR-produkterne blev oprenset ved anvendelse af et DNA-oprensningskit (Tiangen, Beijing, Kina), og blev klonet i PMD-19T-vektoren (Takara, 6013). Efter transformation blev 10 positive kloner af hver BSP prøve valgt til sekventering ved hjælp af en 3730xl DNA analysator (Applied Biosystems).

Statistisk analyse

En Chi-square (

χ

2) test blev anvendt til at afklare sammenhængen mellem SFRP1 og β-catenin udtryk og klinisk-patologiske træk i PCA væv fra 71 patienter. Patientgrupper overlevelsesrater blev analyseret ved Kaplan-Meier-metoden. Spearman rank korrelation blev udført for at vurdere forholdet mellem SFRP1 og β-catenin-ekspression. Data blev udtrykt som middelværdi ± SDS. Forskelle mellem middelværdier blev analyseret ved ANOVA efterfulgt af flere sammenligning Student-Neuman-Keuls test og bi-variant forholdet analyser. Statistisk signifikans blev behandlet på

P

. 0,05 niveau

Resultater

Udtrykket af SFRP1 og β-catenin er forbundet med klinisk-patologiske træk ved menneskelig PCa

afvigende ekspression af SFRP1 og β-catenin spiller vigtige roller i udviklingen af ​​en række cancersygdomme, såsom galdevejene kræft, mucoepidermoid carcinom, adrenocortikale tumorer og livmoderhalskræft [16,37-39]. Imidlertid rolle SFRP1 og β-catenin i PCa ikke er klarlagt,. For at undersøge deres roller i PCa, vi undersøgt, om ekspression af SFRP1 og β-catenin korreleret med kliniske-patologiske træk blandt de 61 PCA prøver ved

χ

2 test. Statistisk signifikante forskelle blev observeret i Gleason score, overlevelsesraten og respons for endokrin behandling for de to proteiner, hvorimod ikke blev observeret nogen statistisk signifikant forskel i alder, metastaser før operationen og PSA-niveau (tabel 1). Samlet set viser disse resultater antydede, at udtrykket SFRP1 og β-catenin korreleret med Gleason score, overlevelsesraten og respons for endokrin terapi af PCA patienter, hvorimod ikke korrelerer med alder, metastase før kirurgi og PSA-niveau.

effekten af ​​SFRP1 udtryk på overlevelsen i PCA patienter

for yderligere at bestemme forholdet mellem SFRP1 /β-catenin udtryk og samlet overlevelse i PCa blev overlevelseskurver tegnet af Kaplan-Meier metode. Resultaterne viste, at SFRP1-negative patienter viste en signifikant dårligere samlet overlevelse end SFRP1-positive patienter (P = 0,016, Fig. 1A). I modsætning hertil udviste β-catenin-positive patienter en signifikant ringere samlet overlevelse end p-catenin-negative patienter (P = 0,004, Fig. 1B). Disse resultater antydede, at negative SFRP1 udtryk og positiv β-catenin udtryk alvorligt påvirket den samlede overlevelsesraten for patienter med PSA.

A, Forholdet mellem SFRP1 udtryk med samlede overlevelse hos patienter med PCa (P = 0,016). B, Forholdet af β-catenin udtryk med samlede overlevelse hos patienter med PCa (P = 0,004).

For at vurdere bidraget af klinisk-patologiske funktioner som potentielle prædiktive og prognostiske biomarkører, vi analyserede 6 klinisk-patologiske variabler i de 61 PCA patienter med multivariate analyse. Som vist i tabel 2, Kun SFRP1 ekspression var statistisk signifikant faktor (P = 0,009), og kunne identificeres som en uafhængig forudsigende og prognostisk indikator, der angiver, at SFRP1 ekspression kan tjene som den bedste forudsigende og prognostisk biomarkør for overlevelsesrate i PCa blandt disse variabler.

udtrykket af SFRP1 og β-catenin er negativt korreleret i PCa

for at bestemme korrelationen mellem SFRP1 /β-catenin udtryk og forekomst af PCa, protein udtryk af SFRP1 og β-catenin i benigne prostatahyperplasi og prostata tumorprøver blev sammenlignet ved immunhistokemi (fig. 2). Der blev analyseret i alt 71 vævsprøver (10 godartet prostata hyperpslasia og 61 prostatatumorer). Ifølge rating kriterier, 8 (80%) af de 10 godartet prostatahyperplasi prøver blev klassificeret som positive for SFRP1 udtryk og 2 (20%) blev klassificeret som negativ, mens det i tumorprøver, SFRP1 udtryk faldt betydeligt med 36 (59% ) positive og 25 (41%) negativt. I modsætning hertil godartede prostatahyperplasi prøver blev 9 (90%) er klassificeret som negative for β-catenin udtryk og en (10%) blev klassificeret som positivt udtryk, mens β-catenin udtryk signifikant øget med 29 (47,5%) positive og 32 (52,5%) negativ i tumorprøver (tabel 3). For at bevise specificiteten af ​​β-cateninantistof blev siRNA knockdown eksperiment udført ved hjælp af PC3 celler. Den endogene β-catenin-ekspression blev reduceret med 86% i PC3-celler transficeret med siβ-catenin pool sammenlignet med PC3 celler transficeret med siControl (S1 Fig). Disse resultater indikerede, at SFRP1 ekspression blev reduceret, hvorimod β-catenin-ekspression blev øget i PSA.

A, Repræsentative resultater, som viser immunhistokemisk farvning af SFRP1 og β-catenin i et afsnit af humane godartede prostatahyperplasi væv. I venstre panel, pile viser, at lokaliseringen af ​​SFRP1 jævnt fordelt i cytoplasmaet. I det højre panel, pile viser, at lokaliseringen af ​​β-catenin var overvejende cellemembran. B, The immunhistokemisk farvning af SFRP1 og β-catenin i et afsnit af human prostatacancer væv (SFRP1 negative og β-catenin positiv). I det højre panel, pile viser, at β-catenin hovedsageligt lokaliseret i både cytoplasmaet og kernen. C, The immunhistokemisk farvning af SFRP1 og β-catenin i et afsnit af human prostatacancer væv (SFRP1 positiv og β-catenin negativ). I venstre panel, pile viser, at lokaliseringen af ​​SFRP1 var overvejende i cytoplasmaet.

For at undersøge forholdet mellem SFRP1 og β-catenin i PCA væv, protein niveauer af SFRP1 og β-catenin i prostata tumorprøver blev analyseret ved chi-square test. Ifølge vores vurdering kriterier, blev 36 prøver identificeret som SFRP1-positivt udtryk, og 25 blev identificeret som SFRP1-negative udtryk i 61 PCA prøverne. 23 (63,9%) af de SFRP1-positive prøver viste negativ β-catenin-ekspression, hvorimod kun 9 prøver (36%) viste negative β-catenin-ekspression i SFRP1-negative prøver (tabel 4). Disse resultater viste, at der var en negativ sammenhæng mellem SFRP1 og β-catenin i PCa (r = -0,275, P = 0,032).

For yderligere at bestemme ændringen af ​​SFRP1 og β-catenin udtryk i forskellige PCA cellelinjer, proteinet og mRNA-niveauer af SFRP1 og β-catenin i LNCaP, DU145 og PC3 celler behandlet med eller uden 5Aza blev undersøgt. Blandt dem, LNCaP er en androgen-afhængig human prostatacancer-cellelinie, mens DU145 og PC3 er androgenuafhængig human prostatacancer-cellelinier, som er mere stærkt malign end LNCaP-celler. Med den maligne grad steget gradvist, protein og mRNA-niveauer af SFRP1 i partnerskabs- og samarbejdsaftalen celler behandlet uden 5Aza faldt betydeligt, mens både protein og mRNA-niveauer af SFRP1 var opreguleret i PCA celler behandlet med 5Aza (Fig 3A . 3B) . Men det protein niveauet af β-catenin steget markant i PCA celler behandlet uden 5Aza, og blev nedreguleret i PCA celler behandlet med 5Aza (fig. 3C). Ingen signifikant forskel af β-catenin mRNA niveau blev observeret i LNCaP, DU145 og PC3-celler (fig. 3D). Tilsammen disse resultater bekræftede, at der var en omvendt korrelation mellem SFRP1 og β-catenin udtryk i PCA-cellelinjer, som er i overensstemmelse med oplysningerne fra tumor vævsprøver.

A, LNCaP, DU145 og PC3 celler behandlet med eller uden 5Aza blev opsamlet og derefter underkastet Western blot-analyse med anti-SFRP1 antistof. B, LNCaP, DU145 og PC3-celler behandlet med eller uden 5Aza blev opsamlet og derefter underkastet kvantitativ RT-PCR-assay.

SFRP1

mRNA niveau af LNCaP-celler blev sat til 1. C, LNCaP, DU145 og PC3-celler behandlet med eller uden 5Aza blev opsamlet og derefter underkastet Western blot-analyse med anti-β-catenin antistof. D, LNCaP, DU145 og PC3-celler behandlet med eller uden 5Aza blev opsamlet og derefter underkastet kvantitativ RT-PCR-assay.

β-catenin

mRNA niveau af LNCaP-celler blev sat til 1. Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange. Data, der er vist i graferne er middel ± SD’er af tre eksperimenter. *,

P

0,05. ns, ikke signifikant. Fuldlængde-blot i fig. 3A er præsenteret i S2 Fig.

Ændringerne af

SFRP-1

gen methylering i PCA-cellelinjer

methylering af

SFRP1

genpromotor er blevet rapporteret at føre til nedregulering af SFRP1 protein og mRNA-niveauer, og til at spille vigtige roller i initieringen og udviklingen af ​​tumorer. Eftersom protein- og mRNA-niveauer af SFRP1 signifikant med stigende grad af malignitet og 5Aza, en DNA-methyleringsinhibitor, opreguleret både protein og mRNA-niveauer af SFRP1 i PCA-cellelinjer, vi spekulerede at SFRP1 silencing vil kunne blive induceret af

SFRP1

gen methylering. For at undersøge denne mulighed, methylering af

SFRP1

genpromotor i LNCaP, DU145 og PC3-celler behandlet med eller uden 5Aza blev undersøgt ved BSP assay. Methylering forekommer normalt i CpG-rige promotorområder, opkaldt CpG ø med ø størrelse 100, GC% 50, Obs /Exp 0,6. Bioinformatik analyse viste, at 2 CpG-øer kan være methyleret i

SFRP1

genpromotor (fig. 4A, blå-farvede regioner). BSP-analysen viste, at både CpG øer i

SFRP-1

promotor blev methylerede i LNCaP, DU145 og PC3 celler. De methylering satser CpG øer 1 og 2 i LNCaP celler behandlet uden 5Aza var 32,5% og 2,7%, mens begge methylering satser faldt til 9,3% og 1,1% efter 5Aza behandling (fig. 4B). I DU145-celler, de methylering satser af CpG-øer 1 og 2 faldt fra 36,7% og 85,6% til 12,6% og 47,9%, henholdsvis efter 5Aza behandling (fig. 4C). I PC3-celler, begge methylering satser faldt fra 85% og 71% til 38,3% og 44,1% efter 5Aza behandling (fig. 4D). Disse resultater svarede til de opnået fra Western blot-analyse af data (figur 3A . 3B), hvilket antyder, at nedreguleringen af ​​protein og mRNA-niveauer af SFRP1 blev induceret ved

SFRP1

gen methylering med stigende grad af malignitet af PCA cellelinjer

A, Skematisk diagram af SFRP-1 promoter region (blå-farvede områder: CPG øer).. CpG island 1 var fra 1454 bp til 1613 bp. CpG island 2 var fra 1831 bp til 2257 bp. B-D, Methylering af CpG island 1 (venstre felt) og CpG island 2 (højre panel) i LNCaP, DU145 og PC3-celler, henholdsvis behandlet med eller uden 5Aza. Hver cirkel repræsenterer en methyleret (sort) eller umethyleret (hvid) CpG dinukleotid. Hver række repræsenterer en anden klon.

Diskussion

PCa er den mest almindeligt diagnosticeret ikke-hudkræft hos mænd med øget forekomst sats hvert år [40-42]. De patologiske funktioner i PCa er uhyre komplekse [43]. Tumorer i mange patienter med PCa er i en indolente form, hvilket ikke har nogen effekt på overlevelsen af ​​patienter og ofte holdes under opsyn snarere end øjeblikkelig behandling, mens en lille del af tumorer tilhører hurtigt frem maligne tumorer, som i alvorlig grad truer liv af patienterne [44,45]. Endvidere på grund af de fysiologiske og anatomiske træk af PCa, er det vanskeligt at observere tydelige tidlige symptomer på patienter, hvilket fører til et stort antal patienter diagnosticeret på et fremskredent stadium [46]. Derfor er det vigtigt at forbedre tidlig diagnose for PCa ved at identificere prædiktive og prognostiske biomarkører. I denne undersøgelse påviste vi, at Wnt-antagonisten SFRP1 var en positiv prædiktiv og prognostisk biomarkør og dets ekspression blev omvendt korreleret med β-catenin-ekspression.

Wnt signalvej spiller en vigtig rolle i flere cellulære processer, såsom celledifferentiering, proliferation og migration og dens deregulering korrelerer med flere sygdomme, herunder kræft [47]. Wnt /β-catenin-signalvejen er unormalt aktiveres i en lang række humane maligniteter [48-54]. Denne afvigende aktivering bidrager til tumorigenese ved opregulering af ekspression af forskellige nedstrøms target gener, såsom

MDR-1, Livin, cyclin D1

og

c-Myc

[15,55]. β-catenin er en central komponent i Wnt signaling pathway og dets ændrede lokalisering er anerkendt som en markør for pathway aktivering. Dataene fra immunhistokemisk farvning viste, at β-catenin lokalisering i humane godartede prostatahyperplasi prøver overvejende blev lokaliseret til cellemembranen med lavt proteinindhold ekspressionsniveauer (Fig 2A højre panel.); dog i humane PCA prøver, hovedsagelig β-catenin lokaliseret i cytoplasmaet og kernen med højere proteinindhold ekspressionsmængde sammenlignes med den i benigne prostatahyperplasi prøver (fig. 2B højre panel). Det er blevet rapporteret, at β-catenin interagerer med AR og øger androgen-stimuleret transkriptionsaktivitet AR, hvilket antyder, at rollen af ​​β-catenin i prostata carcinogenese ikke kan begrænses til transkriptionel aktivering af TCF /LEF [56]. I denne undersøgelse viste vi, at β-catenin-ekspression var positiv i 47,5% af PCA prøver, hvorimod kun 10% (1/10) positivt ekspression blev observeret i benigne prostatahyperplasi prøver (tabel 2). Den positive udtryk for β-catenin i PCa var også signifikant korreleret med Gleason score, overlevelsesraten og respons for endokrin behandling (tabel 1). Vi påviste, at PCA patienter med positiv β-catenin-ekspression havde en signifikant ringere alt overlevede (Fig. 1B). Endvidere ekspressionen af ​​β-catenin signifikant opreguleret med stigende grad af malignitet (fig. 3C). Disse resultater antyder, at ekspressionen af ​​β-catenin er tæt forbundet med dårligere prognose, og at afvigende aktivering af Wnt signalvejen bidrager til udviklingen af ​​PSA.

SFRP1 udøver sin funktion i Wnt signalvejen som en velkendte antagonist af frizzlede receptor, og er blevet foreslået at være en tumor suppressor i flere humane cancere [57,58]. Dataene fra immunhistokemisk farvning viste, at lokaliseringen af ​​SFRP1 ensartet fordelt i cytoplasmaet (fig. 2A venstre panel), i overensstemmelse med dets ekspression i adskillige andre væv [34,59]. Men SFRP1 lokalisering er overvejende cytoplasmatisk perinukleære biliær cancere fordøjelsesorganer og blære [16,60]. Forskellen i fordelingen af ​​SFRP1 kan skyldes vævsspecifik ekspression.