Abstrakt
mavekræft herunder Cardia og ikke-Cardia typer er den anden hyppig årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan. En delmængde af ikke-mavemunden mavekræft genetisk modtagelighed loci er blevet behandlet blandt asiatiske gennem genom-dækkende forening undersøgelser (GWASs). Denne undersøgelse var at evaluere effekten af enkelte nukleotid polymorfier (SNP) af lange intergeniske ikke-kodende RNA (lincRNAs) på ikke-Cardia mavekræft modtagelighed i kinesiske befolkningsgrupper. Vi valgte lange intergeniske ikke-kodende RNA (lincRNAs) placeret i ikke-cardia gastrisk kræftrisiko relateret loci og identificeret 10 SNPs beliggende inden lincRNA exoniske regioner. Vi undersøgte, om genetiske polymorfier i lincRNAs exoner er forbundet med ikke-mavemunden gastrisk kræftrisiko i 438 ikke-Cardia patienter mavekræft og 727 kontrolpersoner i kinesiske befolkningsgrupper ved hjælp af logistisk regression. Funktionel relevans blev yderligere undersøgt af biokemiske analyser. Vi fandt, at
lincRNA-NR_024015
rs8506AA luftfartsselskab var signifikant forbundet med risiko for manglende Cardia mavekræft (justeret odds ratio [OR] = 1,56, 95% CI = 1,03-2,39, sammenlignet med den rs8506 AG eller GG . genotype yderligere lagdeling analyse viste, at risikoen effekt var mere udtalt i undergrupper af rygere (
P
= 0,001) Biokemisk analyse påviste, at G til En ændring base ved rs8506G . A forstyrrer bindingssted for has- . miR-526b, og derved påvirke den transkriptionelle aktivitet af
lincRNA-NR_024015
påvirker celledeling Vores nuværende studie etableret en robust sammenhæng mellem rs8506G en polymorfisme i
lincRNA-NR_024015
exon og risikoen for ikke-Cardia mavekræft
Henvisning: Fan QH, Yu R, Huang WX, Cui XX, Luo BH, Zhang LY (2014) det har-miR-526b Binding-site rs8506G En Polymorfi. i
lincRNA-NR_024015
Exon identificeret ved GWASs prædisponere til ikke-Cardia Gastric Cancer Risk PLoS ONE 9 (3):. e90008. doi: 10,1371 /journal.pone.0090008
Redaktør: Xiaoping Miao, MOE Key Laboratory for Miljø og Sundhed, Institut for Folkesundhed, Tongji Medical College, Huazhong Universitet for Videnskab og Teknologi, Kina
modtaget: 11. december 2013; Accepteret: 25 Jan 2014; Udgivet: 4 marts 2014
Copyright: © 2014 Fan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Suzhou Socialfond Development Project (SS08047), Jiangsu-provinsen Key Medicinsk afdeling i 2011. finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.
konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
mavekræft (GC) er den næststørste årsag til kræft død på verdensplan efter lungekræft i 2010, selv om dødsfald dødelighed. er faldet en smule fra 774 tusind i 1990 til omkring 755 tusind i 2010 [1], [2]. Epidemiologiske undersøgelser har vist, at miljømæssig faktor, herunder kost, rygning, alkohol forbrug og især er infektion med Helicobacter pylori forbundet med en højere risiko for GC [3], [4]. På trods af disse anerkendte risikofaktorer, forskere stadig overbevist om, at genetiske faktorer, især enlige nukleotid polymorfier (SNP), kan forventes at spille en væsentlig rolle i en persons risiko for at udvikle mavekræft som kun en brøkdel af eksponerede personer udvikler mavekræft [5] .
til dato, med forud for næste generation transkriptom sekventering (RNA-Seq), har der været en dybtgående ændring i vores forståelse af hele sæt af transkriptionelle afvigelser i en sygdom, herunder nye afskrifter og ikke-kodende RNA’er (ncRNAer) ikke måles ved konventionelle analyser [6] – [9]. Af alle de aktuelt karakteriserede klasser af ikke-kodende RNA’er molekyler, er disse blevet kaldt lange mellemliggende ncRNAer (lincRNAs) længere end 200 nucleotider (nt), der mangler en åben læseramme og ikke overlapper proteinkodende gener [7], [10]. Grupper af lincRNAs er blevet godt karakteriseret i nogen grad og påvist at korreleret med vigtige cellulære processer, såsom prægning, X-kromosom inaktivering, pluripotens vedligeholdelse, og transkriptionel regulering [10] – [15]. Desuden har nye beviser for dysreguleret lincRNA udtryk i talrige kræftformer dukket lincRNA som en ny del af biologi, med beviser for, at en stor rolle for inddragelse af lincRNA i human tumorgenese og metastase [16], [17]. Faktisk et godt beskrevne eksempel,
hotair
er blevet undersøgt bidragene til den trinvise progression af tumorigenese [11], [18], der fremhæver betydningen af lncRNAs i kræft biologi. Derudover lange ikke-kodende RNA
MALAT1
(metastase-associerede lungeadenocarcinom transkript 1), er hyppig fejlagtig regulering og som en prædiktiv markør for en række forskellige humane cancere i colon, bryst og prostata [19] – [ ,,,0],22]. Ikke desto mindre er de mekanismer, der ligger til grund for specifikke funktion lincRNAs i udvikling af kræft er ikke fuldt afgrænset.
I det seneste årti, flere upartiske genom-dækkende forening undersøgelser (GWAS) har udvidet vores forståelse af genetiske ændringer vedrørende forskellige typer af sygdomme og kræft ved høje gennemløb teknologier [23]; dog mindst en tredjedel af de identificerede varianter er inden ikke-kodende intervaller [24]. For nylig, to GWAS afslørede, at flere modtagelighed risiko loci, der er forbundet med ikke-Cardia mavekræft (nCgC) risiko i en kinesisk befolkning. Bioinformatik analyse har afsløret talrige lincRNAs tæt på disse loci. Desuden flere relevante enkelt nukleotid polymorfier (SNP) placeret i exon regioner lincRNAs, der kan associere med nCgC blev identificeret; imidlertid har foreningen mellem genetiske variationer i lincRNAs exoner og kræft modtagelighed sjældent rapporteret.
I den foreliggende undersøgelse, vi hypotese, at SNP’er i exon region lincRNAs kan ændres ekspressionsniveauer og dermed kan bidrage til nCgC. For at teste denne hypotese, gennemførte vi et hospital-baseret case-kontrol undersøgelse for at undersøge sammenhængen mellem disse SNPs og modtagelighed for nCgC i en kinesiske befolkning.
Materialer og metoder
forsøgspersoner
Alle emner i den aktuelle undersøgelse var etnisk homogene han-kinesere, herunder 438 nCgC patienter og 727 raske kontrolpersoner. Patienter, der blev opereret på Affiliated Hospitals af Soochow University (Suzhou) blev fortløbende rekrutteret 2003-2009, med en svarprocent på 94%. Patienterne var fra Suzhou byen og de omkringliggende områder, og der var ingen alder, køn, og histologiske restriktioner. Detaljer vedrørende de kliniske træk ved de patienter, er sammenfattet i tabel 1. Den tumor, node, metastase (TNM) klassifikation og tumor iscenesættelse blev vurderet i henhold til den amerikanske Blandede 2002 om Cancer Staging system. Befolkning kontrol var cancer-fri mennesker, der bor i Suzhou region; de blev udvalgt fra en ernæringsmæssig undersøgelse foretaget i samme periode som sagerne blev indsamlet. Kontrolprøverne var tilgængelige for os fra tidligere undersøgelser, som tilfældigt blev udvalgt fra en database bestående af 3500 personer baseret på en fysisk undersøgelse [25] – [27]. Målingen for serum H.pylori immunoglobulin G i nCgC patienter og kontroller blev bestemt ved enzymkoblet immunosorbent assay (ELISA). Denne undersøgelse blev godkendt af medicinsk etik udvalg Soochow University. Alle deltagerne var genetisk relateret etniske han-kinesere, og ingen havde blodtransfusion i de sidste 6 måneder. Efter at have givet et skriftligt informeret samtykke, blev hver deltager planlagt til et interview med en struktureret spørgeskema for at indsamle udvalgte oplysninger, og at donere 5 ml perifert blod.
SNP Selection
Alle offentliggjorte litteratur undersøger en sammenhæng mellem genetisk modtagelighed og nCgC risiko var støtteberettigede. Vi søgte efter studier frem til august 2013 ved hjælp af PubMed database og Web of Science. Relevante søgetermer var “genom-dækkende forening undersøgelse”, “GWAS”, “nCgC”, “mavekræft”, “mavekræft”, og “asiatisk”. Vi har også manuelt søgte referencelisterne i udvalgte artikler. Vi først udelukket nogle artikler ved at scanne titler og abstracts af studier, der ikke blev skrevet på engelsk. Så efter at have læst den fulde ordlyd af de resterende artikler, identificerede vi et endeligt sæt undersøgelser. Alle de udvalgte undersøgelser opfyldte følgende kriterier: (1) resultatet undersøgte var baseret på GWAS i forhold til nCgC hos mennesker; (2) artiklerne er publiceret på engelsk; (3) de seneste undersøgelser blev udvalgt blandt overlappende data og duplikeres data; (4) GWAS blev udført under anvendelse chipteknologi. De store udelukkelseskriterier var (1) anmeldelser, tutorials, breve og ledere; (2) duplikere data; (3) ikke en case-kontrol design; og (4) overlappende data eller data dumpet af de seneste rapporter. Dernæst har vi gennemsøgt modtagelighed loci identificeret ved GWAS for nCgC i udvalgte artikler blev 4 lincRNAs som ikke overlapper med nogen anerkendte gener inden for en 1-MB række af disse loci, i begge retninger (i alt spændvidde på 2 MB) til sidst identificeret fra menneskelige lincRNAs databasen [28]. Endvidere blev Haploview software 4.2 bruges til bioinformatik analyse af haplotype blok baseret på den kinesiske Han-Beijing (CHB) befolkningsdata i HapMap (HapMap data Slip 27 fase II + III, februar 2009 på NCBI B36 forsamling, dbSNP B126). Disse SNPs med mindre allelfrekvenserne på over 5% i den kinesiske befolkning blev ekstraheret. Der var tre haplotype blokke i den kinesiske befolkning (figur 1A). De haplotype-tagging SNPs blev udvalgt med Haploview software 4.2 Tagger programmet; blev det konstateret, at rs11752896, rs11752942, rs4714336 og rs4711631 dækkede haplotypen i blok 1 ved en 100% frekvens (rs11752896 og rs11752942: D ‘= 1,0, r
2 = 1,0; rs11752896 og rs4714336: D’ = 1,0, r
2 = 1,0; rs11752896 og rs4711631: D ‘= 1,0, r
2 = 1,0). Desuden rs2467950, rs2450764 og rs9312, dækket rs8506 haplotypen i blok 1 ved en 100%, henholdsvis (rs2467950 og rs2450764: D ‘= 1,0, r
2 = 1,0; rs9312 og rs8506: D’ = 1,0, r
2 = 1,0). SNPs rs2304285 og rs2477757 er uden blokkene. Derfor blev den SNP’er rs11752896, rs2467950, rs8506, rs2477757 og rs2304285 valgt som fem potentielle funktionelle SNPs i exon af de udvalgte lincRNAs der skal analyseres for deres foreninger med risiko for mavekræft.
(A) Bindingsuligevægt (LD) kort for udvalgte SNP’er af
lincRNA-NR_024015
exon. Den viste, at rs11752896, rs11752942, rs4714336 og rs4711631 er i LD med D ‘= 1; rs2467950 og rs2450764 er i LD med D ‘= 1; rs9312 og rs8506 er i LD med D ‘= 1. (B) Niveauerne af kontrol udskrift nukleare (
U6
), cytoplasmatisk kontrol udskrift (
GAPDH
mRNA), og
lincRNA -NR_024015
blev vurderet ved RT-qPCR med nukleare og cytoplasmatiske fraktioner. Dataene er middelværdier ± standardfejl på middelværdien. Data er præsenteret som en procentdel af
U6
,
GAPDH
lincRNA-NR_024015
niveauer og totale niveauer for hver blev taget til at være 100%. (C-D)
In-silico
forudsigelse af sammenklappelige strukturer induceret af rs8506G A i
lincRNA-NR_024015
. Bjerget plot er en xy-graf, der gengiver en sekundær struktur, herunder MFE struktur, den termodynamiske ensemble af RNA-strukturer (pf), og det geometriske tyngdepunkt struktur i en afbildning af højden versus position. “MFE” repræsenterer minimum fri energi struktur; “Pf” angiver partition funktion; “Tyngdepunkt” repræsenterer det geometriske tyngdepunkt struktur.
Genotypning Analyse
Genom DNA blev ekstraheret fra perifere blod-lymfocytter af forsøgspersonerne. Allelspecifik MALDI-TOF-massespektrometri blev anvendt til at genotype markørerne anvendt i foreningen analyser, som tidligere beskrevet [27], [29]. I alt 60 prøver blev udvalgt tilfældigt til direkte sekventering for at bekræfte genotypebestemmelse resultater fra massespektrometrianalyse, og resultaterne var i 100% overensstemmelse. Ca. 10% af prøverne blev også tilfældigt udvalgt til en blindet gentagelse af genotypebestemmelse uden forudgående kendskab til det tidligere genotypning resultat eller status af at være en sag og kontrol, og resultaterne var i 100% overensstemmelse.
Cell Culture
293T eller HGC-27 celler blev købt fra Cell Bank of Type Culture Collection af det kinesiske Academy of Sciences, Shanghai Institute of Cell Biology, og blev overført til færre end 6 måneder. De 293T eller HGC-27-celler blev opretholdt i DMEM med høj glucose (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) eller RPMI 1640-medium suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) og 50 pg /ml streptomycin (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) ved en 37 ° C i nærvær af 5% CO
2.
Subcellulær Fraktionering
HGC- 27 celler blev dyrket i en fugtig inkubator i 2 dage. For subcellulære fraktioneringstrin eksperimenter, op til 2 × 10
6 celler blev anvendt. Cytosoliske og nukleare ekstrakter fra brystkræftceller blev indsamlet ved hjælp af en Nuclear /Cytosol Fraktionering kit (BioVision, USA) i overensstemmelse med producentens anvisninger.
In-silico
Forudsigelse af Folding Strukturer induceret af Rs8506G A i
LincRNA-NR_024015
Da visse strukturer er mere tilbøjelige til at spille vigtige roller i biologiske funktioner; derfor vi brugte RNAfold og SNPfold algoritmer til at forudsige den formodede indflydelse rs8506G A på de lokale sammenklappelige strukturer i
lincRNA-NR_024015
ved at analysere de 61-bp regioner flankerer polymorfi
Konstruktion af. Reporter plasmider
To reporter plasmider, der indeholder 160 bp
lincRNA-NR_024015
exon region fragment flankerer rs8506G eller rs8506A allelen blev syntetiseret ved Genewiz Company (Suzhou, Kina) og derefter klonet ind i psiCHECK- 2 basic Vector (Promega, Madison, WI) (figur 1B). Den resulterende konstruktion med
lincRNA-NR_024015
rs8506 SNP (psiCHECK-2-lincRNA-rs8506G og psiCHECK-2-lincRNA- rs8506A) blev bekræftet ved sekventering.
Forbigående transfektioner og luciferaseassays
Bioinformatik analyse viste, at rs8506G En polymorfisme lokalisere ved bindingsstedet af microRNA har-mIR-526b (https://snpinfo.niehs.nih.gov/). Derved blev de efterligner og hæmmere af har-miR-526b (GenePharma Co, Shanghai) anvendes til at analysere effekten af har-miR-526b på psiCHECK-2-lincRNA-rs8506 reportergener
in vitro
. De 293T eller HGC-27-celler blev podet i 24-brønds plader (1 × 10
5 celler per brønd) og dyrket til 60-70% konfluens før transfektion; celler blev derefter transficeret med reporter plasmider, der er beskrevet ovenfor under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA) som tidligere beskrevet [25]. I hver brønd blev co-transfektion udført med 800 ng konstruerede plasmid DNA og 0, 1, eller 40 pmol microRNA har-miR-526b efterligner (Shanghai GenePharma Co Ltd), og med eller uden 40 pmol har-mir -526b inhibitor, i overensstemmelse med producentens anvisninger. Luciferaseaktiviteten blev målt med Dual-Luciferase Reporter assaysystem (Promega, Madison, WI, USA) under anvendelse af en TD-20/20 luminometer (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA, USA), og resultaterne blev normaliseret mod aktiviteten af
Renilla
luciferasegenet. Hver gruppe omfattede 6 gentagelser, og blev udført uafhængige tredobbeltforsøg.
Expression Vector Construction
For yderligere at undersøge, hvilken rolle af
lincRNA-NR_024015
i kræft progression, den fuld- længde cDNA af
lincRNA-NR_024015
husly rs8506G og rs8506A alleler blev syntetiseret ved Genewiz Company (Suzhou, Kina) og derefter klonet ind i pcDNA3.1 vektorer. Den resulterende konstruktion med
lincRNA-NR_024015
rs8506 SNP (pcDNA-lincRNA-rs8506G og pcDNA-lincRNA-rs8506A) blev bekræftet ved sekventering.
RNA Isolation og kvantitativ RT-PCR-analyse
Toogtredive nCgC vævsprøver blev opnået fra biopsier af individuelle patienter og opbevaret ved -80 ° C før analyse. Total RNA blev opnået fra disse cancervæv med TRIzol-reagens (Molecular Research Center, Inc.). cDNA blev dannet fra mRNA under anvendelse af random primer og Superscript II (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Real-time kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-PCR) blev udført for at kvantificere relative genekspression af
lincRNA-NR_024015
, anvendelse af en ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems) baseret på SYBR-green metode, og
GAPDH
blev anvendt som en intern reference gen i hver reaktion.
Cell synlighed Assay
i 96-brønds, fladbundede plader (BD Biosciences, Bedford , MA), 100 pi HGC-27-celler cotransficeret med pcDNA-lincRNA-rs8506SNP og har-mIR-526b eller kontrol blev alikvoteret i hver brønd. Cellernes levedygtighed blev målt ved Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratory, Kumamoto, Japan) baseret på producentens anvisninger.
Statistisk analyse
Forskellene i fordelingerne af udvalgte demografiske variable mellem cases og kontroller, samt allel og genotypefrekvenser blev vurderet ved tosidede chi-squared test. Ubetingede logistiske regressions modeller blev anvendt til at estimere de sammenslutninger af genotyper SNPs med risiko for mavekræft ved odds ratio (OR) og deres konfidensintervaller 95% (CIS), efterfulgt af lagdeling analyse efter alder, køn, rygning og drikke status. Logistisk regression modellering blev anvendt i test for trend, samt at vurdere de potentielle multiplikative og additive gen-gen og gen-Miljøfaktoren interaktioner. Desuden blev dataene yderligere stratificeret af undergrupper af klinikken-patologiske variabler. Statistisk magt blev beregnet ved at anvende PS software (https://biostat.mc.vanderbilt.edu/twiki/bin/view/Main/PowerSampleSize, adgang Dec 14, 2010). Envejs ANOVA-test blev anvendt til at bedømme virkningen af forskellige SNP’er på
lincRNA-NR_024015
transkript ekspression. Alle tests var to-sidet ved hjælp af SAS-software (version 9.1, SAS Institute, Cary, NC, USA). En
P
. 0,05 blev anvendt som kriterium for statistisk signifikans
Resultater
genotyper og risiko for manglende Cardia Gastric Cancer
I nærværende undersøgelse blev fem SNPs genotypet mellem cases og kontroller. Som vist i tabel 2, blev en signifikant sammenhæng med nCgC risiko observeret for rs8506G A. Konkret resultaterne af genotypning viste, at sammenlignet med den rs8506GG eller AG genotype,
lincRNA-NR_024015
rs8506AA luftfartsselskab var signifikant forbundet med risiko for manglende Cardia mavekræft (justeret odds ratio [OR] = 1,56, 95% CI = 1,03-2,39). Derudover blev ingen signifikante forskelle undersøgt i de andre fire SNPs (
P
0,05). Således kunne vi konkludere, at genetiske variant rs8506G En polymorfi i
lincRNA-NR_024015
spiller en væsentlig rolle i formidling af risikoen for nCgC
Stratificering Analyse af Rs8506G . En genotyper og risiko for nCgC
Vi yderligere foretaget en lagdeling analyse af sammenhængen mellem variant genotyper og risiko for nCgC af undergrupper af klinisk-patologiske funktioner i nCgC i denne undersøgelse. Som vist i tabel 3 blev en signifikant sammenhæng mellem variant genotyper og risikoen for nCgC observeret hos forsøgspersoner med rygning (justeret OR = 2,48, 95% CI = 1,63-3,78, homogenitet test
P
= 0,001) , hvilket tyder på, at rygning modulerer association mellem
lincRNA-NR_024015
rs8506G En variant genotyper og risikoen for nCgC. Ingen signifikant sammenhæng blev fundet i andre undergrupper.
Cellular karakterisering af
LincRNA-NR_024015
Niveauerne af kontrol udskrift nukleare (
U6
), cytoplasmatisk kontrol udskrift (
GAPDH
mRNA), og
lincRNA-NR_024015
blev vurderet ved RT-qPCR med nukleare og cytoplasmatiske fraktioner af HGC-27 celler. Resultaterne viste, at
GAPDH
mRNA blev udelukkende påvist i den cytoplasmatiske fraktion, mens kerne-bibeholdt
U6
blev overvejende fundet i den nukleare fraktion. Og
lincRNA-NR_024015
udtryk var overvejende cytoplasmatisk (figur 1B)
In-silico
Analyse af Effekt af Rs8506G . A i
LincRNA-NR_024015
Folding
Brug RNAfold og SNPfold algoritmer i
i-silico
analyse, vi forudsagde lokale strukturelle ændringer af
lincRNA-NR_024015
forårsaget af rs8506G En polymorfisme placeret inden den exon region
lincRNA-NR_024015
. Som vist i figur 1C og D, resultaterne antydede, at G til A baseændring af rs8506G En direkte påvirker foldningen af
lincRNA-NR_024015
, som kan påvirke bindingssted for den microRNA. Dette kan så påvirke
lincRNA-NR_024015
genekspression
Rs8506G . A genotyper Indflydelse
LincRNA-NR_024015
Expression ved at forstyrre Binding af Har-miR-526b
In vitro
To luciferasereportergen konstruktioner indeholdt rs8506G eller A-allelen blev analyseret ved forbigående co-transfektion med mimik og hæmmer har-miR-526b, som blev bygger binding til rs8506G En polymorfe sted ved bioinformatik analyse. Resultatet af luciferaseaktivitet viste, at HEG-27-celler transient co-transficerede har-MIR-526b efterligner og konstruktion indeholdende rs8506G allel udviste signifikant reduceret luciferaseaktivitet, i en koncentrationsafhængig måde, og de har-MIR-526b inhibitorer betydeligt vendt, og opreguleres deres aktiviteter. Der blev imidlertid ikke indlysende ændring observeret for reportergen med A allel behandlet med har-miR-526b efterligner eller inhibitorer (
P
0,05) (Figur 2A). De samme resultater blev også observeret, når disse forsøg blev gentaget ved anvendelse af 293T-celler (figur 2B).
repræsentant graf af luciferaseaktivitet af variant allel på luciferase reportergener bærer
lincRNA-NR_024015
exon region spanning 160 bp, der flankerer rs8506G en polymorfisme segmenter i HEG-27 (A) og 293T celler (B). Resultaterne er vist som procent i forhold til luciferaseaktivitet (Renilla luciferaseaktivitet blev målt og normaliseret til ildflueluciferase). Relativ luciferaseaktivitet af psiCHECK-2-
lincRNA-NR_024015
-G-allel og psiCHECK-2-
lincRNA-NR_024015
-A-allel konstruktioner cotransficeret med har-miR-526b efterligne og inhibitor. Seks gentagelser for hver gruppe og forsøget gentages mindst tre gange. Data er gennemsnit ± SEM. Asterisk angiver en signifikant ændring (
P
0,001). (C)
LincRNA-NR_024015
ekspressionsniveauerne i toogtredive ikke-Cardia mavecancerpatienter til forskellige rs8506G A genotyper (15 rs8506GG, 11 rs8506AG og 6 rs8506AA); data er gennemsnit ± standardfejl af gennemsnittet. (D) HEG-37 celler blev cotransficeret pcDNA-lincRNA-rs8506G eller pcDNA-lincRNA-rs8506A med har-miR-526b. Efter 24 timer blev cellerne opsamlet, RNA ekstraheres og real time PCR udføres. Dataene er middelværdier ± standardfejl på middelværdien. “Stjerne” repræsenterer
P
0,05. (E) Celler ‘spredning var signifikant hæmmet, når celler cotranfected
lincRNA-NR_024015
der huser rs8506G allel og har-miR-526b. Celleproliferation blev udført ved celleviabilitetstest og effekten blev tydeligt fra dag 2. Seks gentagelser for hver gruppe og forsøget gentages mindst tre gange. Dataene er middelværdier ± standardfejl på middelværdien. “Stjerne” repræsenterer
P
. 0,05
Association of Rs8506G En genotyper med
LincRNA-NR_024015
Expression
Vi indsamlede 32 tumorvæv fra de ubehandlede nCgC patienter med forskellige genotyper og udført real-time PCR til at vurdere effekten af
lincRNA-NR_024015
rs8506G A på
lincRNA-NR_024015
udtryk. Resultatet viste, at patienter med rs8506AG og rs8506AA genotyper udtrykt signifikant højere
lincRNA-NR_024015
mRNA-niveauer (gennemsnit ± SEM) i forhold til bærere af rs8506GG genotypen (AG: 0,029 ± 0,005; AA: 0,040 ± 0,005; GG: 0,019 ± 0,004;
P
= 0,023), som vist i figur 2C
Effekten af miRNA-afhængig forordning af
LincRNA-NR_024015
Expression på celleproliferation.
Vi yderligere undersøgt, om
lincRNA-NR_024015
rs8506G A genotyper påvirke celledeling i
vitro
. Som vist i figur 2D,
lincRNA-NR_024015
udtryk faldt efter 24 timer transfektion i celler forbigående cotransficeret med pcDNA-lincRNA-rs8506G og har-miR-526b sammenlignet med dem cotransficeret med pcDNA-lincRNA- rs8506A og har-miR-526b (
P
0,001). Celler med nedsat udtryk for
lincRNA-NR_024015
havde en svag celle vækst i sammenligning med celler transficeret med pcDNA-lincRNA-rs8506A og har-miR-526b fra dag 2 (
P
= 0,004 ) (Figur 2E)
Dicussion
i den nuværende sygehus-baserede case-kontrol undersøgelse indeholder i alt 438 patienter og 727 raske kontrolpersoner, vores gruppe fundet rs8506G . a er forbundet med risikoen for nCgC. Vores data viser, at fag bærer rs8506AG og rs8506AA genotyper havde en signifikant øget risiko for nCgC forhold til GG-genotypen (
P
0,05). Derudover viste det sig, at en høj risiko virkning af denne polymorfi var mere udtalt i rygere. Til vores viden, er dette den første undersøgelse for at omfattende vurdere sammenhængen mellem varianterne i exon af lincRNA og risiko for nCgC.
Som en anden klasse af regulatoriske ikke-kodende RNA, lincRNAs, har for nylig flyttet til forkant med ikke-kodende RNA undersøgelse. Disse mRNA-lignende molekyler, mangler en betydelig åben læseramme, er generelt udjævnet, splejset og polyadenyleret har været impliceret i en lang række af cellulære processer, såsom nuklear arkitektur, regulering af genekspression, immunovervågning, eller embryonale stamceller pluripotens. En håndfuld undersøgelser har vist lincRNAs dukket op som en ny del af biologien i en række forskellige sygdomstilstande, og ændringer i ekspressionsniveauer af lincRNAs kan bidrage til kræft biologi på transkriptionelle, post-transkriptionelle og epigenetiske niveauer [18], [30] – [32]. En fremtrædende lincRNA,
ANRIL
, var blevet funktionelt impliceret i kræft progression, typisk undertrykke epigenetisk genekspression via binding til og rekruttere kromatin modificering komplekser [33], [34]. En anden berømt eksempel er lincRNA,
GAS5
; genetiske afvigelser på dette lincRNA locus er blevet fundet i mange typer af tumorer, herunder melanom, bryst- og prostatakræft [35] – [37]. Disse linjer af beviser støttede betydningen af lincRNAs i cellebiologi og onkogenese. For nylig, to GWASs har rapporteret en delmængde af nCgC modtagelighed loci (5p13.1, 3q13.31, 8q24.3, 6p21.1 og 7p15.3), der er forbundet med udviklingen af nCgC. Bioinformatik analyse afslørede adskillige lincRNAs lukket til disse loci. Desuden blev flere relevante enkelt nukleotid polymorfier (SNP) placeret i exon regioner lincRNAs, der kan associere med nCgC identificeret. Som vi alle kendte, i det seneste årti, med tilgængeligheden af store RNA-sekventering, er det nu ved at blive bemærkelsesværdigt klart, at tusindvis af sygdomsrelaterede genetiske varianter boet uden for gener eller endda i ikke-kodende er allerede blevet opnået ved udskrifter genom projekt i pattedyr [24]. Nylige nye beviser har indikeret sammenhængen mellem SNPs boede i lincRNAs og menneskelige kræftformer. For eksempel baseret på de 1000 genomprogramledere data, Guangfu Jin og colleages har fundet, at regioner i lncRNA havde en SNPs densitet svarende til protein-kodende regioner og yderligere kommenteret de fænotypespecifikke relaterede SNP’er rapporteret af GWAS på lncRNA region kan bidrage til prostata risiko [ ,,,0],38]. En nylig undersøgelse rapporterede også, at en genetisk polymorfi i
lincRNA-uc003opf.1
genet er forbundet med en øget risiko for udvikling esophageal pladecellecarcinom i kinesiske populationer [39]. Kollektivt vores nuværende undersøgelse er i overensstemmelse med tidligere resultater viste, at
lincRNA-NR_024015
var moderat mere rigelig i cytoplasmaet end i kernen af fraktionerede gastriske cancerceller, hvilket antyder, at funktionen af dette lincRNAs udøves i cytoplasmaet . Vores resultater forudsat en stærk dokumentation for en hypotese for cytoplasmatisk regulering, hvor
lincRNA-NR_024015
rs8506G . En SNP kan påvirke ekspressionen af denne lincRNA ved at ændre bindingssted for har-miR-526b
i den foreliggende undersøgelse, vores resultat af forbindelsen mellem en genetisk polymorfi i exon regioner af en lincRNA og tilbøjelighed til nCgC blev først opnået i kinesiske populationer. De relativt store stikprøvestørrelser anvendte faldt størrelsen af de yderste periferi, der kan påvises statistisk. Desuden har vi opnået en undersøgelse magt på over 90% (tosidet test, α = 0,05) i detektion en OR på 1,28 for rs8506AG + AA-genotyper (forekommer med en frekvens på 42,5% blandt kontrollerne), sammenlignet med den rs8506GG genotype. Især foreningen er biologisk plausibelt og er i overensstemmelse med resultaterne af vores funktionelle studier.
Som konklusion nærværende undersøgelse forudsat den første bevis på, at genetiske polymorfier i exoniske regioner lincRNAs spiller en afgørende rolle i at mediere individ modtagelighed for nCgC. Vores resultater understøtter endvidere den hypotese, at genetiske varianter i lincRNA exoniske regioner kan påvirke microRNA-medieret regulering og forbundet med risiko for GC. Vores resultater berettiger validering i større, helst populationsbaserede, case-kontrol studier, samt ved veldesignede mekanistiske undersøgelser.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.